辣椒产量调控基因LOC107867680、其编码蛋白、表达载体及其应用

辣椒产量调控基因loc107867680、其编码蛋白、表达载体及其应用
技术领域
1.本发明申请涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种辣椒产量调控基因loc107867680、其编码蛋白、表达载体及其应用。


背景技术：

2.辣椒（capsicum annuum l.）是双子叶植物纲、茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物。辣椒是一种常见的调味品和食材，通常用于增加食物的辛辣度和口感。它含有辣椒素等成分，具有促进食欲、提高代谢率、抗氧化等作用，也被认为有助于预防某些疾病。辣椒是一种重要的经济作物，全球辣椒产量逐年增加，主要生产国包括中国、印度、墨西哥、印度尼西亚、泰国等。其中，中国是世界上最大的辣椒生产国和消费国，占全球辣椒产量的近50%。
3.辣椒的产量构成因子主要包括结实率、果实数量、果实大小等，近年来随着基因组学和分子生物学技术的不断发展，一些研究已经鉴定出一些与辣椒产量相关的基因，如ipt3、grf9、rbcs、arf11等。但辣椒的产量性状是由多个基因控制的复杂性状，而当前对辣椒产量基因的研究还相对较少，目前获得的功能基因对全面阐明产量形成的分子机制仍十分有限。因此，需进一步挖掘更多的辣椒果实产量相关性状的基因并解析其利用途径，从而丰富产量形成的遗传基础，并为辣椒新品种选育提供优良的基因资源。
4.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

5.发明人在辣椒中发现了与玉米基因kwe2同源的基因loc107867680，并创制相应的辣椒敲除突变，进而明确了基因loc107867680在辣椒果实大小、生育期或/和抗病性等性状上的表现和对产量的调控作用，从而为利用loc107867680基因提高辣椒产量提供了坚实的技术支撑。
6.本发明的目的之一在于提供一种辣椒产量调控基因loc107867680，其核苷酸序列为下组中的至少一种：（1）如seq id no.1所示；（2）在seq id no.1的基础之上经过一至数个碱基替换和/或一至数个碱基的插入和/或缺失以及大片段的核苷酸序列插入/缺失/移位/倒位所形成的能影响产量相关性状表型的dna分子。
7.本发明公开的另一个方面，提供一种辣椒产量调控基因loc107867680的编码蛋白，其氨基酸序列为下组中的至少一种：（1）由seq id no.1所编码的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）如seq id no.2所示；
（3）由seq id no.2经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有影响产量相关性状的蛋白质。
8.本发明公开的第三个方面，提供一种含所述辣椒产量调控基因loc107867680的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或者重组菌。
9.本发明公开的第四个方面，提供一种鉴定辣椒调控基因loc107867680突变的引物对，其序列如下：lj-t459-12393
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l2:5
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actctctcatcgccgtcg-3’，lj-t459-12393
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r2:5
’‑
agcaagcaatctgggtcgtttcattata-3’；lj-2l:5
’‑
tcaatccatctctccgactgg-3’，lj-2r:5
’‑
attggcagtcatcgaccca-3’。
10.本发明公开的第五个方面，将所述基因loc107867680、所述引物应用在辣椒产量性状改良及优势品种/品系选育当中。
11.例如，沉默/下调表达所述辣椒基因loc107867680，以增加辣椒果实的长度、宽度，或选育早熟或/和抗病高产辣椒品种。
12.本发明可转化的植物可以是单子叶和双子叶植物，包括但不限于辣椒、柳枝稷、油菜、向日葵、棉花、玉米、高粱、小麦、黑麦、大麦、马铃薯、甘薯、大豆、豌豆、苜蓿、拟南芥属等。
13.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：1. 对辣椒产量调控基因loc107867680进行crispr/cas9编辑，获得纯合的crispr-cas9突变体，明确了loc107867680基因对辣椒的果实大小（长、宽）、生育期或/和抗病性等性状表现的影响，进而明确其对辣椒果实产量的提高作用；为利用loc107867680基因提高辣椒产量及抗逆性提供了技术支撑。
14.2. 利用本技术公开的产量调控基因及利用方法，可方便辣椒、玉米、小麦等农作物高产育种材料的创制，大幅缩短各类农作物新品种的选育周期，降低选育成本，进而提高育种效率。
附图说明
15.图1为本技术实施实例中辣椒loc107867680基因的进化分析树。
16.图2为本技术实施实例中生育期极早的辣椒loc107867680基因敲除株系。
17.图3为本技术实施实例中loc107867680基因敲除抗病株系及其对照；其中，左侧为转基因对照株系，右侧为loc107867680基因敲除株系。
18.图4为本技术实施实例中loc107867680基因敲除株型优势株系及其对照；其中，左侧为基因敲除株系，右侧为转基因对照株系。
19.图5为本技术实施实例中表型性状对比图；其中，wt为转基因对照，ko为loc107867680独立编辑事件，ko-1为kwe2编辑系1，ko-2为loc107867680编辑系2，ko-3为loc107867680编辑系3。
具体实施方式
20.相关术语定义及说明：术语“辣椒产量调控基因”指一段具有编码蛋白能力的核苷酸序列，该序列特异编码具有调控果实大小（长、宽）、生育期和产量功能的蛋白活性多肽。
21.所述“辣椒产量调控基因”，还包括能编码具有天然的调控生物产量的基因kwe2相同功能蛋白的、开放阅读框序列的变异形式；这些变异形式包括但并不限于：一个或多个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及5’或3’端添加几个（通常为60个以内，较佳的为30个以内，更佳的为10个以内，最佳的为5个以内）的核苷酸。
22.所述“辣椒产量调控基因”，还包括能翻译一类具备调控辣椒果实大小、生育期长短、抗病性和产量功能的氨基酸序列，如seq id no.2的氨基酸序列。该类氨基酸序列还包括具有天然调控辣椒产量蛋白相同功能的变异形式。这些变异形式包括但并不限于：一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及c末端和/或n末端添加一个或多个（通常为20个以内，较佳的为10个以内，更佳的为5个以内）的氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
23.另外，所述“辣椒产量调控基因”的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr 扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本实施例公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计对应引物，并用市售的cdna文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna文库作为模板，扩增到有关序列。当序列较长时，通常需要两次或者多次的巢式pcr扩增，然后将各次pcr扩增产物按正确的顺序拼接在一起。
24.特别优选在高等植物中表达的至少一种本技术公开的辣椒产量调控基因kwe2的蛋白，一旦将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种（特别包括商业品种）中。可将本技术公开的各辣椒产量调控基因loc107867680的核苷酸序列插入到表达盒中，或将其包含在非致病自我复制的病毒中，然后优选地，将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。本技术转化的受体可以是单子叶和双子叶植物，包括但不限于辣椒、玉米、小麦、大麦、黑麦、稻、油菜、棉花、向日葵、马铃薯、豆、豌豆、柳枝稷、拟南芥属等。通过在转基因植物中表达本发明公开的核苷酸序列，由此在转基因植物中促进能够增强相应杂种优势表现的功能蛋白的生物合成。以这种方式，可产生增强杂种优势表现的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明公开的核苷酸序列可能需要修饰和优化，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35%，优选多于约45%，更优选多于50%，最优选多于约60%gc含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。
25.下面对本发明的一些具体实施方式进行详细描述，以下的实施例更便于更好的理解本发明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本技术各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析
solutionⅱ试剂裂解菌块，上下轻轻颠倒数次直至菌体透明；（5） 取350 μlsolution
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试剂，颠倒数次，直至形成白色紧实絮状物；（6） 室温12000 rpm离心10 min，取上清；（7） 从试剂盒中取出核酸纯化柱，放置于收集管上；（8） 取上述操作步骤6的澄清上清至核酸纯化柱中，室温12000 rpm离心1 min，弃滤液；（9） 取500 μl的buffer w1至核酸纯化柱中，室温12000 rpm离心30 s，弃滤液；（10）取700 μl的buffer w2至核酸纯化柱中，室温12000 rpm离心30 s，弃滤液；（11）重复上述操作步骤（10）；（12）将核酸纯化柱放置于收集管上，室温12000 rpm空离2 min，尽可能除去残留液体；（13）弃收集管，取核酸纯化柱置于1.5 ml ep管中，并加入50 μl洗脱液洗脱核酸纯化柱膜上附着的dna（洗脱液可事先置于65℃恒温水浴锅内预热，有助于洗脱dna），室温静置2 min；（14）室温12000 rpm离心2 min，洗脱核酸纯化柱膜上附着的dna，并于-20℃低温冰箱保存；（15）取微量回收产物，采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提质量；（16）质粒进行单克隆测序。
34.菌落pcr及测序引物：u626-idf: tgtcccaggattagaatgattaggc；u629-idf: ttaatccaaactactgcagcctgac；u629-idr:agccctcttctttcgatccatcaac。
35.5. 遗传转化在超净工作台中，取适量野生型辣椒种子置于无菌1.5 ml离心管中。首先，用75%乙醇进行表面消毒30s～60s；无菌水清洗3～5次去除乙醇；然后加入2.5%次氯酸钠或0.1%升汞溶液消毒8～10 min；无菌水清洗3～5次去除次氯酸钠或升汞。将消毒后的辣椒种子置于冰箱4℃进行低温催芽。将露白的辣椒种子播种至1/2 ms（蔗糖20 g/l，ph 5.8）培养基中进行辣椒无菌苗的培养，培养温度为24-26℃、光照度为120
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mol
·
m-2
s-1
、光周期为16h光照/8h黑暗。以辣椒无菌苗的根、茎、叶等为诱导外植体，于黑暗条件下，诱导其se（somatic embryogenesis，体细胞胚发生）（xu et al., 2019；李成伟等, 专利号:zl201310215428.3）或felb（frog egg-like body，类蛙卵体）（xu et al., 2014; xu et al., 2016a）或rtb（rhizoid tuber，类块根体）（xu etal., 2015）或blb（bulbil-like body，类珠芽体）（xu et al., 2016b）等结构。
36.通过农杆菌侵染外植体协同辣椒体细胞胚诱导发生的方法，完成辣椒的遗传转化操作（xu et al., 2019；徐克东等, 专利号: zl201310215428.3；徐克东等, 专利号: zl201910896821.0）。
37.6. 对应突变位点的鉴定为检测靶点序列的编辑情况，共设计两对检测引物，lj-t459-12393-l2/r2（l2:5’actctctcatcgccgtcg3’，r2:5’agcaagcaatctgggtcgtttcattata3’）和lj-2l/2r（2l:5’tcaatccatctctccgactgg3’, 2r:5’attggcagtcatcgaccca3’），扩增产物长度684bp。
38.lj-t459-12393-l2/r2程序
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39.实施例二、辣椒loc107867680基因的表型分析敲除后的转基因系和对照朝天椒品种种植在相同的环境条件下，在结果期进行表型调查，发现转基因敲除系的生育期早且较对照品种抗病（图2、图3、和图4），且其辣椒果实的大小（长度和宽度）均显著高于对照品种（图5）。说明loc107867680基因对辣椒的生育期和产量起负调控作用。

技术特征：
1.一种辣椒产量调控基因loc107867680，其核苷酸序列为下组中的至少一种：（1）如seq id no.1所示；（2）在seq id no.1的基础之上经过一至数个碱基替换和/或一至数个碱基的插入和/或缺失以及大片段的核苷酸序列插入/缺失/移位/倒位所形成的能影响产量相关性状表型的dna分子。2.一种辣椒产量调控基因loc107867680的编码蛋白，其氨基酸序列为下组中的至少一种：（1）由seq id no.1所编码的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）如seq id no.2所示；（3）由seq id no.2经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有影响产量相关性状的蛋白质。3.一种含有权利要求1所述辣椒产量调控基因loc107867680的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或者重组菌。4.一种鉴定辣椒调控基因loc107867680突变的引物对，其序列如下：lj-t459-12393
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actctctcatcgccgtcg-3’，lj-t459-12393
‑ꢀ
r2:5
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agcaagcaatctgggtcgtttcattata-3’；lj-2l:5
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tcaatccatctctccgactgg-3’，lj-2r:5
’‑
attggcagtcatcgaccca-3’。5.权利要求1所述辣椒产量调控基因loc107867680、权利要求4所述引物在辣椒产量性状改良及优势品种/品系选育中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，沉默/下调表达所述辣椒产量调控基因loc107867680，以增加辣椒果实的长度或/和宽度，或/和选育早熟或/和抗病品种。

技术总结
本申请涉及一种辣椒产量调控基因LOC107867680、其编码蛋白、表达载体及其应用；本发明通过对辣椒基因LOC107867680进行CRISPR/Cas9敲除，明确了该基因对辣椒果实大小、产量、生育特性、抗病等性状表现的影响，以及其对辣椒产量的调控作用，从而为利用LOC107867680基因提高辣椒产量、增强抗逆性提供了有利的技术支撑。供了有利的技术支撑。供了有利的技术支撑。


技术研发人员：汤继华 付志远 陈永强 王雅菲 周清倩 李浩川 陈艳乐
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/14