一种可用于降低膀胱癌细胞耐药性的化合物、组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种用于治疗膀胱癌细胞的化合物、组合物及其应用，特别是涉及一种可用于降低膀胱癌细胞耐药性的化合物、组合物及其应用。


背景技术：

2.膀胱癌是指发生在膀胱粘膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。根据who所报道的2020年全球癌症数据统计，膀胱癌的发病率位居第十位，而且在男性中的新发病例与死亡率均位于前十。临床数据随着膀胱癌发病率的不断增长。膀胱癌分为非肌层浸润型和肌层浸润型。近年来，各种治疗手段层出不穷，目前主要治疗措施是手术治疗，如激光、电切、全膀胱切除等，但各种治疗手段均具有较高的复发率以及严重的不良反应。且在手术治疗后患者还需要坚持进行药物灌注，预防复发。且自从30多年前卡介苗免疫保守治疗发展以来，很少有新的治疗方法被发现。且全球目前正在面临着卡介苗短缺的问题。因此寻找治疗膀胱癌的新型药物十分重要。
3.以二甲双胍为主的双胍类药物是目前临床上治疗2型糖尿病的一线用药，近年来在肿瘤细胞体外实验和小鼠实验中发现双胍类药物具有显著的抗肿瘤作用。尽管目前有大量的实验结果证实二甲双胍可以显著治疗膀胱癌，同时有表明二甲双胍联合egfr通道阻滞剂吉非替尼对nsclc合并2型糖尿病患者预后影响的研究。其实验结果表明二甲双胍即延长了生存期，同时延缓了吉非替尼获得性耐药性发生的进程。二甲双胍联合厄洛替尼对人肺癌细胞也表现出良好的抑制作用。但目前为止临床上用二甲双胍治疗膀胱癌仍未获批。最主要原因是二甲双胍发挥抑制肿瘤所需的最低浓度为2mm，而二甲双胍多采用传统的口服给药，这种给药模式会使膀胱局部的有效药物浓度低于治疗浓度，无法达到抑制膀胱癌生长的作用，并且口服二甲双胍会导致血液中的乳酸含量增加，造成乳酸中毒。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物、组合物及其应用，以提高膀胱癌对抗癌药物的敏感性。
5.本发明提供了一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，所述化合物结构为：
6.其中r1为c5的饱和烷基，r2为f、cl、br、i或f、cl、br、i取代的吸电子基。
7.进一步地，所述r1为c5的直链饱和烷基。
8.进一步地，所述r2的取代位为苯环对位。
9.进一步地，所述r2为f取代的烷氧基。
10.更进一步地，所述r2的取代基为三氟甲氧基。
11.本发明另一方面还公开一种可治疗膀胱癌的组合物，包括上述新型双胍衍生物，所述组合物还包括至少一种可用于治疗膀胱癌的药物。
12.进一步地，所述组合物还包括奥希替尼。
13.更进一步地，所述奥希替尼与新型双胍衍生物的摩尔比为(0.1-10)：1
14.本发明第三方面还公开一种上述组合物的应用，所述组合物用于治疗膀胱癌。
15.进一步地，所述膀胱癌为egfr高度表达膀胱癌。
16.本发明相对于现有技术，采用具二甲双胍结构的化合物，对膀胱癌细胞的耐药性进行抑制，从而提高膀胱癌细胞对奥希替尼等治疗药物的敏感性，从而促进对膀胱癌细胞的有效治疗。
附图说明
17.图1为不同浓度下5c对j82、t24膀胱癌细胞株的抑制性(*p《0.05，**p《0.01.***p《0.001,n＝3)；
18.图2为不同浓度下奥希替尼对j82、t24膀胱癌细胞株的抑制性(*p《0.05，**p《0.01.***p《0.001,n＝3)；
19.图3为mtt检测5c与奥希替尼在t24、j82膀胱癌细胞中的联用效果；
20.图4为5c、奥希替尼的单用及联用与egfr表达情况图。
21.其中，图4为各组膀胱癌细胞中p-egfr、p-akt、p-erk1/2和β-actin的蛋白表达情况。(*p《0.05，**p《0.01.***p《0.001.n＝3)。
具体实施方式
22.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
23.本发明实施例公开了一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，所述化合物结构为：
24.其中r1为c5的饱和烷基，r2为f、cl、br、i或f、cl、br、i取代的吸电子基。
25.可选的，所述r1为c5的直链饱和烷基。
26.可选的，所述r2的取代位为苯环对位。
27.可选的，所述r2为f取代的烷氧基。
28.特别的，所述r2的取代基为三氟甲氧基。
29.本发明实施例可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物的具体化学式为
[0030][0031]
本发明实施例还公开一种可治疗膀胱癌的组合物，所述组合物包括上述化合物，所述组合物还包括至少一种可用于治疗膀胱癌的药物。
[0032]
可选的，所述组合物包括奥希替尼。
[0033]
其中，本领域技术人员可基于实际需要，采用除奥希替尼外的其它类似抑制剂，也可采用包括奥希替尼在内的多种抑制剂混合药物。
[0034]
本发明实施例还公开一种上述组合物的应用，所述组合物用于治疗膀胱癌。
[0035]
可选的，所述膀胱癌为egfr高度表达膀胱癌。
[0036]
其中，膀胱癌具体为egfr高度表达膀胱癌。
[0037]
为进一步说明本发明实施例的具体效果，现以(后称5c)为例，进行对比实验如下。
[0038]
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0039]
取本发明实施例化合物5c对膀胱癌细胞进行测试，结果如图1所示，5c对j82、t24癌细胞具有明显的抑制作用。取奥希替尼对膀胱癌细胞进行测试，结果如图2所示，奥希替尼对j82、t24癌细胞具有明显的抑制作用。
[0040]
实施例1：5c和奥希替尼对膀胱癌细胞体外抗肿瘤联用作用
[0041]
取膀胱癌t24和j82细胞株上，分别设置运用mtt方法，在将5c和奥希替尼进行联用，对比单用与联用的体外抗肿瘤作用。5c选择5个浓度，奥希替尼选择5个浓度，计算ci值。
[0042]
具体操作如下：
[0043]
s101.在5a培养基中加入10％的胎牛血清溶液，将t24和j82细胞以6000个/孔/180μl的密度接种于96孔板中；
[0044]
s102.在温度为37℃，5％co2条件下培养24h；
[0045]
s103.将不同浓度的药物用新鲜培养基稀释后，按照每孔20μl的添加量，将测试药液加入已加细胞的培养板中；其中，采用仅含奥希替尼的单用组，和含奥希替尼、5c的联用组，联用组共有两大组，且两大组中5c的具体浓度分别为1μm、2μm，调整奥希替尼在溶液中的浓度，每个浓度至少设三个复孔以减少实验误差，以测试奥希替尼在不同浓度下，单用组、联用组对细胞的抑制性；另设对照组(加细胞不加药)和空白组(不加细胞也不加药，仅含培养基)；
[0046]
s104.在37℃，5％co2的条件下培养72h后，以50μl/孔体积加入mtt试剂(2mg/ml)，继续孵育5h；
[0047]
s105.去掉培养基，加入150μl二甲亚砜，震荡混匀15min，酶标仪检测每孔od值，检测波长490nm；根据od值读数，计算细胞的存活率，并使用grapad prism 6计算ic
50
；利用compusyn软件，计算ci值。
[0048]
结果如图3所示，5c与奥希替尼在膀胱癌细胞中有较强的协同抑制作用，ci值＜0.5，说明有强的协同作用。
[0049]
实施例2：采用克隆形成试验，在膀胱癌细胞j82和t24中，比较5c与奥希替尼单独用药和联合用药的抗肿瘤作用
[0050]
s201.分别取1500个t24、j82细胞接种于24孔板中，0.5ml培养液混匀，每组设3个复孔；
[0051]
s202.培养24h，待细胞贴壁后，将药物用新鲜培养基稀释，按照每孔500μl加入上述已加细胞的培养板中；仅含5c的单用组浓度为1μm，仅含奥希替尼的单用组浓度为1μm，联用组由250μl浓度为1μm的5c+1μl浓度为10μm的奥希替尼混合而成，设置给药作用时间为7天；
[0052]
s203.在37℃，5％co2条件下连续培养8天，至克隆长至直径1 2mm时，终止培养；
[0053]
s204.弃上清，用pbs洗2次，每孔加入10％多聚甲醛2ml，固定15min；
[0054]
s205.去除固定液，0.5ml结晶紫染液染色15min；
[0055]
s206.清水洗去染色液，室温晾干，拍照并采用酶标仪检测吸光值，波长为550nm。
[0056]
结果如图3所示，与单用5c或奥希替尼相比，两药联用组进一步抑制肿瘤细胞增殖。
[0057]
实施例3：western blot检测p-egfr及其下游信号通路的表达水平
[0058]
egfr家族是一类重要的酪氨酸激酶受体。它们通过介导细胞外信号的反应控制细胞的增殖、分化和迁移，并且在膀胱癌、头颈癌、肺癌、肠癌等多种肿瘤组织中egfr高度表达。为了进一步探索5c、奥希替尼及联合用药对膀胱癌的抗增殖机制，本发明实施例研究了其与egfr信号通路的关系。通过wb实验对不同药物处理后的细胞样品进行增殖相关蛋白的检测，结果表明5c与奥希替尼均抑制egfr的磷酸化，且二者联用的效果更加显著。同时有研究表明，egfr的下游pi3k/akt/mtor通路及ras/raf/erk通路异常激活都能促进细胞的生长增殖。并进一步研究了不同对于用药对akt、erk1/2的影响。
[0059]
试验具体步骤如下：
[0060]
s301.设置四个组(依次为5c单用组、奥希替尼单用组、5c+奥希替尼的联用组，同时设置无药物处理组为对照组)，5c单用组在细胞水平的浓度为1μm，奥希替尼单用组的浓度为1μm，5c+奥希替尼的联用组由相同体积的1μm的5c溶液与1μm的奥希替尼溶液混合而成；
[0061]
s302.在药物处理适当时间(同时加入两种药物)后，收集细胞提取蛋白，western blot检测相关蛋白表达水平。
[0062]
结果如图4所示，结果表明化合物5c处理组与奥希替尼都能下调akt、erk1/2的磷酸化水平，而联用组能显著下调akt、erk1/2的磷酸化水平(图4)。以上的这些结果表明：5c与奥希替尼通过下调egfr及其其下游信号通路来抑制膀胱癌细胞生长。
[0063]
综上所述，本发明实施例选择奥希替尼与5c联用运用，mtt检测对细胞活力的影响，结果显示奥希替尼能够与5c共同抑制膀胱癌细胞的增殖。克隆结果显示两药联用相比单用具有更显著的抑制作用。wb检测也发现二者联用能加强抑制egfr及其下游通路相关蛋白akt、erk的活化水平。表明egrf通路在奥希替尼与5c对于膀胱癌的抑制起重要作用。总之，5c与奥希替尼下调egfr及其下游信号通路抑制膀胱癌细胞生长，且联用能加强二者的作用效果，表明5c联用奥希替尼是膀胱癌的潜在治疗方案。
[0064]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本技术说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

技术特征：
1.一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，其特征在于，所述化合物结构为：其中r1为c5的饱和烷基，r2为f、cl、br、i或f、cl、br、i取代的吸电子基。2.根据权利要求1所述一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，其特征在于，所述r1为c5的直链饱和烷基。3.根据权利要求1所述一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，其特征在于，所述r2的取代位为苯环对位。4.根据权利要求1-3任意一项所述一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，其特征在于，所述r2为f取代的烷氧基。5.根据权利要求4所述一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，其特征在于，所述r2的取代基为三氟甲氧基。6.一种可治疗膀胱癌的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-4任意一项所述新型双胍衍生物，所述组合物还包括至少一种可用于治疗膀胱癌的药物。7.根据权利要求6所述一种可治疗膀胱癌的组合物，其特征在于，所述组合物还包括奥希替尼。8.根据权利要求7所述一种可治疗膀胱癌的组合物，其特征在于，所述奥希替尼与新型双胍衍生物的摩尔比为(0.1-10)：1。9.一种权利要求6-8任意一项所述组合物的应用，其特征在于，所述组合物用于治疗膀胱癌。10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述膀胱癌为egfr高度表达膀胱癌。

技术总结
本发明提供了本发明提供了一种可抑制膀胱癌的新型双胍衍生物，所述化合物结构为：其中R1为C5的饱和烷基，R2为F、Cl、Br、I或F、Cl、Br、I取代的吸电子基。二甲双胍发挥抑制肿瘤所需的最低浓度为2mM，而二甲双胍多采用传统的口服给药，这种给药模式会使膀胱局部的有效药物浓度低于治疗浓度，无法达到抑制膀胱癌生长的作用，并且口服二甲双胍会导致血液中的乳酸含量增加，造成乳酸中毒。本发明的新型双胍衍生物，对膀胱癌细胞的耐药性进行抑制，从而提高膀胱癌细胞对奥希替尼等治疗药物的敏感性，从而促进对膀胱癌细胞的有效治疗。癌细胞的有效治疗。癌细胞的有效治疗。


技术研发人员：杨小平 肖迪 周晓辰 王伟帆 彭美 李朵 章行健
受保护的技术使用者：湖南岳靶生物医药有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/21