食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母KD3及在制备生物除臭菌剂中的应用

食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3及在制备生物除臭菌剂中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3及其在生物除臭中的应用。
(二)

背景技术：

2.恶臭是一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快及损害人类生活环境的气体总称。恶臭是世界公认的七大公害之一，仅次于噪音。恶臭会使人产生恶心，头晕，呕吐等反应，严重还会引起人类呼吸道，心血管等疾病。餐厨垃圾由于高含水率和高有机质含量，极易腐败，导致臭气散发，滋生虫蝇。
3.目前除臭方法主要有三种：物理方法、化学方法和生物方法。物理方法和化学方法适用于臭气污染物浓度较大的场合，具有臭气处理效率高，处理停留时间短，启动快等优势；但也存在处理容易引起二次污染、设备耗资大、操作要求高等缺点。
4.生物除臭方法与物理和化学方法相比，过程中不需要添加化学物质，可以在正常温度(10℃～40℃)和压力中进行，比物理方法和化学方法的成本更低，操作更加简单。而且微生物降解通常都是氧化反应的，臭气的最终产物为二氧化碳、水、硫酸盐和硝酸盐等，不会造成二次污染。垃圾填埋场、垃圾压缩站、垃圾压缩车等垃圾处理场所采用的微生物除臭方式与畜牧养殖场的除臭方式相似，以使用生物活菌喷雾为主。
5.专利文献cn112159775a公开了一株细菌在生物除臭中的应用，具体以玉米鞘氨醇单胞菌菌体与载体硅藻土、小麦秸秆或玉米芯以质量比1:0.8～1.2混合应用于餐厨垃圾除臭。
6.专利文献cn113999803a公开了一种复合微生物除臭菌剂，包括氧化硫硫杆菌10-25份、枯草芽孢杆菌25-40份、巨芽孢杆菌5-25份、屎肠球菌10-25份、植物乳杆菌20-30份和蜡状芽孢杆菌10-25份。这种除臭剂可以有效消除餐厨垃圾的酸臭异味并杀灭各类病菌。
7.因此为解决不同地方餐厨垃圾引起的污染，减少恶臭气体的排放，从微生物丰富的自然界中开发出更多的高效除臭菌株是本领域技术人员需要解决的技术问题。
(三)

技术实现要素：

8.本发明目的是提供一种具有高效除臭能力的菌株
‑‑
食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3及在制备生物除臭菌剂中的应用，为解决餐厨垃圾引起的污染，减少恶臭气体的排放，提供了新的高效除臭菌株。
9.本发明采用的技术方案是：
10.本发明提供一种具有高效除臭能力的菌株kd3
‑‑
食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(blastobotrys adeninivorans)kd3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m2023383，保藏日期：2023年3月21日，保藏地址：中国武汉、武汉大学，邮编430072。
11.本发明筛选得到的能够用于生物除臭的食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3，在改良martin固体平板上37℃培养48h，菌落呈白色圆形，中间突起，边缘整齐，电子显微镜下，细
胞形态呈椭圆形。
12.本发明还提供了食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3在制备生物除臭菌剂中的应用，所述生物除臭菌剂为餐厨垃圾异味去除剂，所述餐厨垃圾包括食堂垃圾堆放区，垃圾中转站等。
13.进一步，所述生物除臭菌剂为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3经发酵培养获得的发酵液或者发酵液离心后湿菌体于离子水中的悬浮液；优选，所述发酵液或悬浮液中活菌数大于1
×
109cfu/ml，优选2.0～2.2
×
109cfu/ml。
14.进一步，所述生物除臭菌剂按如下方法制备：将食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3接种至改良martin液体培养基中，30-40℃、100-300rpm培养12-48h(优选37℃，200rpm培养24h)，获得的发酵液即为生物除臭菌剂；所述改良martin液体培养基：蛋白胨5g/l、酵母提取物2g/l、葡萄糖20g/l、mgso
4 0.5g/l、kh2po
4 1g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。
15.进一步，所述食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3发酵前先进行斜面活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度1-3％(优选1％)的接种量接种至改良martin液体培养基，所述种子液按如下步骤制备：将食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3接种在改良martin固体培养基，37℃培养36-48h，挑取单菌落接入改良martin液体培养基中，37℃，200rpm培养12-15h，获得种子液；所述改良martin固体培养基：蛋白胨5g/l、酵母提取物2g/l、葡萄糖20g/l、mgso
4 0.5g/l、kh2po
4 1g/l，琼脂15g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。
16.本发明还提供了一种所述食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3在降解餐厨垃圾臭气中的应用，所述的应用为：将生物除臭菌剂与待处理餐厨垃圾进行混合，37℃恒温放置，达到降解餐厨垃圾臭气的目的；所述餐厨垃圾臭气包括硫化氢、vocs或氨气；所述生物除臭剂为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3经发酵培养获得的发酵液或者发酵液离心后湿菌体于去离子水中的悬浮液。
17.优选的，所述的生物除臭菌剂体积用量以待处理的餐厨垃圾重量计为0.05-0.15ml/g，优选0.1ml/g。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明从垃圾处理站污泥中分离出了一株高效除硫化氢的食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母cctcc no:m2023383，其环境适应能力强，营养需求简单，可在餐厨垃圾中生存并高效降解硫化氢，硫化氢去除率可达85％以上。
(四)附图说明
19.图1为菌株kd3菌落正面(a)和背面形态图(b)。
20.图2为菌株kd3的sem电镜扫描图，a为放大5000倍菌株的表面结构，b为放大10000倍菌株的表面结构。
21.图3为菌株kd3的系统发育树。
22.图4为以餐厨垃圾为底物进行小批量除臭测试中气体排放情况。
(五)具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
24.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.martin液体培养基：蛋白胨5g/l，葡萄糖10g/l，kh2po
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。使用前，每1000ml的martin液体培养基添加质量浓度1％孟加拉红水溶液3ml，且每100ml的martin液体培养基中加1％链霉素液0.3ml。孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用。
26.martin固体培养基：蛋白胨5g/l，葡萄糖10g/l，kh2po
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，琼脂15g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。使用前，每1000ml的martin固体培养基添加质量浓度1％孟加拉红水溶液3ml，且每100ml的martin固体培养基中加1％链霉素液0.3ml。孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用。
27.改良martin固体培养基：蛋白胨5g/l、酵母提取物2g/l、葡萄糖20g/l、mgso40.5g/l、kh2po
4 1g/l，琼脂15g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。
28.改良martin液体培养基：蛋白胨5g/l、酵母提取物2g/l、葡萄糖20g/l、mgso40.5g/l、kh2po
4 1g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。
29.实施例1：菌株kd3的筛选
30.(1)取样富集：称取5g取自武汉某垃圾处理厂的污泥(湿重)接种于含有50ml martin液体培养基(含300μg/ml孟加拉红和30μg/ml链霉素)的250ml三角摇瓶中，于37℃、180rpm的摇床上培养24h。
31.(2)稀释涂布：取步骤(1)1ml驯化后的菌液于9ml生理盐水中进行梯度稀释，分别取稀释10
3-106的稀释液100μl涂布于martin固体培养基平板上，并在37℃恒温培养箱中培养48h。
32.(3)纯化保藏：用接种环挑取步骤(2)形态有明显区别的单菌落接种于改良martin固体培养基，37℃培养48h，待长出单菌落后再次接种于改良martin固体培养基，37℃培养48h进行纯化确保得到纯种单菌落，记为菌株kd3。挑取单菌落kd3接改良martin固体培养基试管，37℃培养12-15h后甘油保藏在-80冰箱，30％甘油1:1装入无菌甘油保菌管。
33.实施例2：菌株kd3的鉴定
34.1、菌落形态观察：
35.用接种环挑取实施例1保藏的菌种kd3，划线接种至改良martin固体培养基平板，37℃培养1-2d，其菌落形态见图1。菌落呈白色圆形，中间有明显突起，边缘整齐。
36.2、sem扫描电镜观察：
37.菌株kd3的扫描电镜图见图2，细胞形态呈椭圆形，单个或成对，繁殖方式为出芽生殖。
38.3、分子鉴定
39.挑取菌株kd3的单菌落到10μl无菌ddh2o的pcr管中沸水煮10min，作为dna模板。以its1(5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3')和its4
40.(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')为正向和反向引物，pcr扩增。
41.pcr扩增体系为(20μl)：引物its1和its4各0.5μl，dna模板1μl，ddh2o 8μl，2*rapid taq master mix 10μl。
42.pcr反应条件：预变性98℃5min，变性98℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，30个循
环，72℃10min，4℃保存。
43.将所得序列(核苷酸序列如seq id no.1所示)在ncbi网站上用blast检索，选出与该序列相似性较高的rdna序列，利用mega7软件align by clustalw自动分析，按1000次重复产生邻近连接树(nj系统发育树)(图3)，结果显示菌株kd3与nr 165943.1blastobotry sadeninivorans cbs 8244its region form type material同源性最近，高达81％。
44.seq id no.1：
45.gcctgcggaaggatcattaacgaaattgtcttcggacatttttatccttaacacctgtga60
46.actattgtaattttttgctttggtccttcggggccagaggatttaatcaaaaccttttat120
47.tattaacctgagtctgaaaattgaaaaattgaattattcaaaactttcaacaacggatct180
48.cttggttctcgcatcgatgaagaacgcagcgaactgcgataagtaatgtgaattgcagaa240ttttgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccttttggtattccagaaggcata 300
49.cctgtttgagagtcatttcttcctcaatcctcggattggtgttgactcgagcgttgcgaa360
50.acgctgagtcgaaaagaattggcaggcaggaattcagtgctttacagtgtcttaggtttt420accaactacgctggcctagtaactgttttctgagctggcctttataacagttcttttaaa 480
51.agtttgacctcaaatcaggcaagactacccgctgaacttaagcatatcaaa531。
52.4、biolog微生物生理生化鉴定
53.利用biolog(genⅲ)自动微生物鉴定系统考察菌株kd3对95种不同碳源的代谢情况：将菌株kd3接种于真菌平板培养基，30℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(ff-if)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至75％t/ff。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在biolog ff微孔鉴定板的各孔中，每孔100μl。将微孔鉴定板放在30℃培养箱中，分别在培养24h、48h、72h、96h、168h和240h后将其置于biolog读数仪上读取结果。
54.经biolog读数仪分析代谢指纹，菌株kd3可较强利用75种碳源，对其他20种碳源不能利用或利用能力较弱。biolog系统给出72h鉴定结果，结果如表1所示。
55.表1.菌株kd3对biolog ff板上95种碳源的利用能力
56.[0057][0058]
notes:+,positive；-,negative；b,borderline
[0059]
结合形态学鉴定、分子生物学与biolog微生物生理生化鉴定，初步鉴定该菌株kd3为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(blastobotry sadeninivorans)，命名为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(blastobotry sadeninivorans)kd3。此菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m2023383，保藏日期为2023年3月21日。
[0060]
实施例3：生物除臭菌剂的制备及应用
[0061]
菌剂制备：将甘油保藏的菌株kd3在改良martin固体培养基(同实施例1)上划线，37℃培养36-48h，挑取单菌落接入装有5ml改良martin液体培养基的试管中，37℃，200rpm培养12-15h，获得种子液；取1ml种子液转接至装有100ml改良martin液体培养基的500ml三角摇瓶中，37℃，200rpm培养24h，获得发酵液(食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母菌落数在2.0～2.2
×
109cfu/ml)即为除臭菌剂。
[0062]
实验设置：在学校食堂的泔水存放处取餐厨垃圾，取样要均匀，人工剔除骨头，搅碎分装于500ml摇瓶，每瓶50
±
2g，接入摇瓶中的菌剂5ml，密封，放在30℃恒温室静置发酵，对照组接入等量纯净水，16h后测量气体。
[0063]
硫化氢、vocs测定方法：用逸云天手提式复合气体分析仪ptm-600进行测定。
[0064]
氨气测定方法：参照标准hj533-2009环境空气和废气中氨的测定
‑‑
纳氏试剂分光光度法测定。
[0065]
去除率计算：(对照气体量-实验组气体量)/对照气体量
×
100％
[0066]
检测结果如表2，检测结果可以发现菌液对于硫化氢有极好的降解效果，对氨气以及挥发性有机物也有一定程度的降解效果。
[0067]
表2、菌株kd3对于硫化氢等的降解效果
[0068][0069]
经过三组平行试验得出接种生物除臭菌剂16小时后对于餐厨垃圾中氨气的降解率为59.68％，硫化氢降解率为92.6％，挥发性有机物降解率为69.84％，从以上实验结果可以看出，利用食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3制成的生物除臭菌剂对餐厨垃圾产生的臭气有明显的降解作用，具有较好的应用潜力。
[0070]
实施例4：以餐厨垃圾为底物进行小批量除臭测试
[0071]
菌剂制备：将实施例3中得到的发酵液以体积浓度2％的接种量转接至装有1000ml改良martin液体培养基的2000ml三角摇瓶中，37℃，200rpm培养48h，获得发酵液(食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母菌落数在2.0～2.2
×
109cfu/ml)即为除臭菌剂。
[0072]
实验设置：将新鲜餐厨垃圾用搅拌机打碎并分装于3l垃圾桶中，每个垃圾桶分装2kg(湿重)新鲜餐厨垃圾，每组实验设置三个平行。然后将制备好的菌剂以0.1ml/g的加量添加，对照组加入等量纯净水。放置于37℃恒温实验室中，测定七天的气体含量变化。
[0073]
采用实施例3方法，每隔24h测定硫化氢、挥发性有机物浓度，第1、3、5、7天测定氨气浓度，测定结果见图4。
[0074]
结果表明接种食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3能有效减少臭味气体的产生，其中氨气排放量减少了41.39％，硫化氢减少了85.24％，挥发性有机物减少了52.25％。

技术特征：
1.食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(blastobotrys adeninivorans)kd3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m2023383，保藏日期：2023年3月21日，保藏地址：中国武汉、武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3在制备生物除臭菌剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物除臭菌剂为餐厨垃圾异味去除剂。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物除臭菌剂为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3经发酵培养获得的发酵液或者发酵液离心后湿菌体于去离子水中的悬浮液。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液或悬浮液中活菌数大于1
×
109cfu/ml。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物除臭菌剂按如下方法制备：将食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3接种至改良martin液体培养基中，30-40℃、100-300rpm培养12-48h，获得的发酵液或者发酵液离心后湿菌体于去离子水中的悬浮液即为生物除臭菌剂；所述改良martin液体培养基组成：蛋白胨5g/l、酵母提取物2g/l、葡萄糖20g/l、mgso
4 0.5g/l、kh2po
4 1g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3发酵前先进行斜面活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度1-3％的接种量接种至改良martin液体培养基，所述种子液按如下步骤制备：将食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3接种在改良martin固体培养基，37℃培养36-48h，挑取单菌落接入改良martin液体培养基中，37℃，200rpm培养12-15h，获得种子液；所述改良martin固体培养基组成：蛋白胨5g/l、酵母提取物2g/l、葡萄糖20g/l、mgso
4 0.5g/l、kh2po
4 1g/l，琼脂15g/l，溶剂为自来水，ph7.0～7.5。8.一种权利要求1所述食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3在降解餐厨垃圾臭气中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将生物除臭菌剂与待处理餐厨垃圾混合，37℃恒温放置，达到降解餐厨垃圾臭气的目的；所述餐厨垃圾臭气包括硫化氢、vocs或氨气；所述生物除臭剂为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母kd3经发酵培养获得的发酵液或者发酵液离心后湿菌体于去离子水中的悬浮液。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的生物除臭菌剂体积用量以待处理的餐厨垃圾重量计为0.05-0.15ml/g。

技术总结
本发明公开了一种食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母KD3及在制备生物除臭菌剂中的应用，所述生物除臭菌剂为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母KD3经发酵培养获得的发酵液或者发酵液离心后湿菌体于去离子水中的悬浮液；本发明从垃圾处理站污泥中分离出了一株高效除硫化氢的食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母CCTCC NO:M2023383，其环境适应能力强，营养需求简单，可在餐厨垃圾中生存并高效降解硫化氢，硫化氢去除率可达85％以上。硫化氢去除率可达85％以上。


技术研发人员：柳志强 侯文静 周海岩 朱文静 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/8/22