一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水的方法

1.本发明涉及污水处理及资源化利用技术领域，具体为一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水并联产高质量蛋白的方法。


背景技术：

2.据不完全统计，2015年至2050年期间，全球鱼类消费将增加80％以上，其中罗非鱼作为世界上第二大类养殖鱼类，在2019年产量就达到了651.3万吨，随之而来的污水排放和饲料短缺成为限制其发展的关键问题。目前许多国家采用好氧或厌氧生物降解处理，通过活性污泥减少生物需氧量，但是这种技术对极高营养负荷的污水降解能力有限，且处理后的污水仍然含有无机化合物如硝酸盐、铵和磷酸根离子，达不到排放标准，不仅消耗能源多，维护和运营成本也非常昂贵。
3.采用微藻处理污水可以克服上述缺陷。微藻是一种可以轻松适应各种条件的光合自养微生物，可用于通过生物累积、生物降解和生物吸附净化不同类型的废水，并可以利用污水作为氮、磷和微量营养素的来源来生长，产生大量的生物质比如蛋白质、碳水化合物、脂质和色素，以此成为很有前景的动物饲料和生物燃料来源。但利用微藻对污水进行处理存在效率低、生物质产量低等问题，达不到预期排放和产物积累；并且通过控制外界条件提高污水处理效果的研究大部分仅限于实验室摇床的无菌水平，并未在较大规模开放条件下进行，无法确保有效性。
4.例如，cn202111458556.1公布了一种利用混合微藻处理城市生活污水的方法，利用混合微藻最终去除城市污水中64％的cod、76％的tan和69％的tp，最高生物量仅达到0.51g/l。
5.另外，cn201510295511.5公布了一种利用污水分阶段培养微藻的方法，利用分阶段方法去除污水中79％的tp、84％的tn和100％tan，且生物量增加到3.45g/l，但未在开放条件下进行验证。
6.因此，有必要提出一种微藻培养条件调控策略，对指导微藻规模化培养具有重要意义，可以为水产养殖污水培养以及在制备高质量蛋白饲料进行工艺优化。


技术实现要素：

7.本发明目的在于提供一种提高蛋白核小球藻高效处理水产养殖污水效果并联产高质量蛋白的策略；实现在板式反应器中利用蛋白核小球藻使得养殖污水得到净化，同时藻能够在养殖污水中增殖并积累蛋白质，有利于污水处理规模化。
8.为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水的方法，包括如下过程：
9.将蛋白核小球藻接种于配置模拟罗非鱼养殖污水，蛋白核小球藻的接种量为10％(v/v)，模拟罗非鱼养殖污水在摇瓶中，摇瓶设置在摇床上，设定蛋白核小球藻培养条件，条件为温度、光源以及碳源，设定调节条件如下，培养温度为20-30℃，培养光源为白光、红光
或者蓝光，碳源为葡萄糖、淀粉或者麸皮，摇床条件为转速140rpm、光照强度80μe m-2
s-1
、光暗比为24h：0h的恒温振荡摇床。
10.其中，配置模拟罗非鱼养殖污水的cod＝152.50mg/l，tp＝4.70mg/l，tn＝13.20mg/l，tan＝9.50mg/l。
11.一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水方法，包括如下过程：将蛋白核小球藻接种于罗非鱼养殖污水中，在最佳条件下进行板式反应器培养，最佳条件为培养温度30℃，光源为红光，碳源为淀粉，板式反应器由总体积为5l的开放平板光反应器组成，材质为有机玻璃，每个反应器由一个可拆卸的盖子，混合气体由恒流泵提供，并通过底部的四个端口充气。
12.有益效果，本技术的技术方案具备如下技术效果：
13.1、本发明选择蛋白核小球藻作为去除罗非鱼养殖污水中污染物的生物体，其具有光合效率高、环境耐受性强、生长繁殖快，进行污水处理应用范围广、去除效率高，去除了罗非鱼养殖污水中85.15％的tp，96.96％的tn，88.53％的cod，98.0％的tan，使养殖污水出水水质符合淡水养殖尾水排放二级标准，本发明对去除效果进行了放大处理，在板式反应器中证明了本发明的有效性。
14.2、在处理结束后，本发明在污水中分离收获的藻体，生物量达到了1.15g/l,蛋白含量占52％，经氨基酸分析发现其中赖氨酸占必需氨基酸总量的32.53％。本发明方法可以应用在净化水产养殖污水生成蛋白质中，提供了一种用于培养蛋白核小球藻并积累蛋白质的组合条件；通过本方法可以兼顾污水处理、微藻生长和蛋白积累，降低了污水处理成本的同时又能够收集生物质作为优质水产饲料的蛋白来源。
15.应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。
16.结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
17.附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：
18.图1是不同温度下罗非鱼养殖污水中tp、tn随时间的变化图；
19.图2是不同温度下罗非鱼养殖污水中cod、tan随时间的变化图；
20.图3是红光光源下罗非鱼养殖污水中tp、tn随时间的变化图(其中淀粉组葡萄糖组麸皮组对照组)；
21.图4是红光光源下罗非鱼养殖污水中cod、tan随时间的变化图；
22.图5是白光光源下罗非鱼养殖污水中tp、tn随时间的变化图；
23.图6是白光光源下罗非鱼养殖污水中cod、tan随时间的变化图；
24.图7是蓝光光源下罗非鱼养殖污水中tp、tn随时间的变化图；
25.图8是蓝光光源下罗非鱼养殖污水中cod、tan随时间的变化图；
26.图9是在板式反应器中罗非鱼养殖污水中tp、tn随时间的变化图；
27.图10是在板式反应器中罗非鱼养殖污水中cod、tan随时间的变化图；
28.图11是培养后收获蛋白核小球藻氨基酸种类和含量。
具体实施方式
29.为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定义在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。
30.实施例1(温度条件实验)：本发明提供了一种利用蛋白核小球藻高效处理水产养殖污水的方法，按以下步骤进行：
31.将处于对数生长期藻液接种到灭菌后的模拟罗非鱼养殖污水中，接种比例10％(v/v)，在恒温振荡摇床中培养温度分别为15、25、30℃为实验温度，每个温度设置3个平行，培养8天，其它条件保持一致，完成罗非鱼养殖污水的处理；
32.实施例2(光源条件实验)：本发明提供了一种利用蛋白核小球藻高效处理水产养殖污水的方法，按以下步骤进行：
33.将处于对数生长期藻液接种到灭菌后的模拟罗非鱼养殖污水中，接种比例10％(v/v)，在恒温振荡摇床中培养温度30℃，光源由统一规格led分别为白光、红光和蓝光，提供每个光源设置3个平行，培养8天，其它条件保持一致，完成罗非鱼养殖污水的处理；
34.实施例3(碳源条件实验)：本发明提供了一种利用蛋白核小球藻高效处理水产养殖污水的方法，按以下步骤进行：
35.将处于对数生长期藻液接种到灭菌后的模拟罗非鱼养殖污水中，接种比例10％(v/v)，在恒温振荡摇床中培养温度30℃，光源为红光由统一规格led提供，添加0.5g/l的葡萄糖、淀粉、麸皮，每组3个平行，培养8天，其它条件保持一致，完成罗非鱼养殖污水的处理。
36.实施例4(放大实验)：本发明提供了一种利用蛋白核小球藻高效处理水产养殖污水的方法，按以下步骤进行：
37.将处于对数生长期藻液接种到灭菌后的模拟罗非鱼养殖污水中，接种比例10％(v/v)，在板式反应器中培养温度30℃，光源为红光由统一规格led提供，添加0.5g/l的淀粉，每组3个平行，培养8天，其它条件保持一致，完成罗非鱼养殖污水的处理；
38.本发明的检测方法
39.(1)污水中各指标分析方法：将污水样品适当稀释取上清液用于tn、tp、cod、tan分析。采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定tn，钼酸铵分光光度法测定tp，紫外分光光度法测定cod，采用纳氏试剂光度法测定tan；
40.(2)生物质干重采用干重法；取已知体积的培养基并在5000rpm转速下离心5min。在去掉上清液后，重复离心2次后以减少培养基中营养物质重量的影响。将清水重悬后的细胞用已知重量的滤纸片过滤，并将滤纸片放在设定温度为80℃的真空干燥器中干燥12h，滤纸片在取出后迅速放入干燥器中冷却，最后完成称重，生物量浓度用细胞干中和所取出的
培养基体积的比值表示，为g/l；
41.(3)用bca试剂盒测定其蛋白含量；
42.(4)酸水解法测定其氨基酸的种类和含量，具体方法如下：将微藻细胞冻干，称取一定量藻粉然后液氮破壁，加入1m氢氧化钠水解200μl，在80℃孵化10min，添加1.8ml水，在13000rpm条件下离心30min。再重复提取操作2次，将上清合并，用bca试剂盒进行测定蛋白含量(bio-rad#5000002,hercules,usa)。取1ml样品离心后置于安培瓶中，加入15ml 6mol/l hcl(内含0.75ml巯基乙醇)，充氮气封管；110℃水解22h后取出冷却，用0.02mol/l的hcl定容50ml；吸取1ml，氮吹至吹干，再加入3-5滴超纯水继续吹干；用2ml 0.02mol/l的hcl复溶，后经0.22μm水相过滤膜过滤至液相瓶作为待测液。采用全自动氨基酸分析仪(日立-l8900)对藻粉的氨基酸组成进行定性、定量分析。
43.实施例1处理过程中，模拟罗非鱼养殖污水中各项指标随时间变化情况如图1-2所示，各指标去除效率及速率如表1-2所示。
44.表1不同温度下污染指标去除效率对比
45.去除效率(％)15℃25℃30℃tp38.3048.9045.17tn33.3052.4250.23cod84.6684.1088.77tan94.8296.3895.74
46.表2不同温度下污染指标去除速率对比
[0047][0048]
根据中华人民共和国《淡水养殖尾水排放标准》
[0049]
(二级排放标准：tp≤1.0mg l-1
、tn≤5.0mg l-1
、cod≤25mg l-1
、tan≤0.5mg l-1
)
[0050]
从图1-2和表1-2可以看出，25℃作为小球藻生长最适温度，去除tp、tn、tan的效率也是最高的，分别为48.90、52.42、96.38％，也就是说在常温下，蛋白核小球藻本身就有一定的污水处理能力；明显看出，15℃时各个指标的去除效率都最低，这是由于温度低导致藻生长缓慢导致。25℃和30℃在各个指标上的去除效率大致相同，为了模拟罗非鱼养殖的真实环境，后面的实施例将以30℃为实验温度；在这三组温度下只有tan、cod达到了排放指标，去除速率差别不是很大，还需改变策略提高去除率。
[0051]
实施例2和3处理过程中，模拟罗非鱼养殖污水中各项指标随时间变化情况如图3-8所示，各指标去除效率及速率如表3-4所示。
[0052]
表3不同光源下污染指标去除效率对比
[0053][0054]
表4不同光源下污染指标去除速率对比
[0055][0056]
[0057]
根据中华人民共和国《淡水养殖尾水排放标准》
[0058]
(二级排放标准：tp≤1.0mg l-1
、tn≤5.0mg l-1
、cod≤25mg l-1
、tan≤0.5mg l-1
)。
[0059]
从图3-8和表3-4可以看出，添加淀粉可以很大程度上促进污染物的去除，且各光源之间差异较明显，其中对于tp的去除效率白光、红光、蓝光下分别为61.11、81.49、78.89％，比不添加碳源时增加了一半以上的效率，且后两者都达到了排放标准，其中红光时tp、tn、cod、tan去除效率分别达到81.49、86.36、90.01、98.01％，且在第四天就可以使氮含量达到了排放标准；而葡萄糖组和麸皮组在各光源之间差异并不明显，且处理效果并不是很好。整体上来说添加葡萄糖有利于对氮的去除，在白光、红光、蓝光对tn去除率分别为92.42、94.17、88.57％，对tan去除率分别为96.33、97.50、97.50％，且都在2天之内就各自达到了排放标准，去除速率十分高。麸皮组整体上对于促进去除率的效果并不是很明显，这是因为蛋白核小球藻对于麸皮的吸收利用并不是很好，在培养过程中极易出现絮凝沉淀的现象。
[0060]
实施例4处理过程中，在板式反应器中，模拟罗非鱼养殖污水中各项指标随时间变化情况如图9-10所示，各指标去除效率及速率如表5-6所示。
[0061]
表5板式反应器中污染指标去除效率对比
[0062]
去除效率(％)白光红光tp65.9685.15tn66.2396.96cod78.7888.53tan99.9899.99
[0063]
表6板式反应器中污染指标去除速率对比
[0064]
去除速率(mgl-1
d-1
)(达到排放标准a)白光红光tp未达标1.90tn1.091.60cod未达标25.30tan1.581.59
[0065]
如图9-10所示，在平板光生物反应器中，在红光下，tp、tn、cod和tan的去除率分别为85.15、96.96、88.53和98％，远远超过白光。各项指标均符合排放标准。
[0066]
实施例5处理过程中，对板式反应器培养后的藻体进行生物量和氨基酸分析。
[0067]
收获后的生物量为1.15g/l,蛋白质含量为52％，如图11所示其中有14种氨基酸，eaa/taa为62％远远高于传统饲料如豆粕(12.43％)和鱼粉(23.97％)；同时基本上满足了fao/who的蛋白质参考模式，即eaa/taa应达到约40％，eaa/neaa值应超过0.6。其中，lys通常被认为是第一限制性膳食氨基酸。常见鱼类饲料如鱼粉和豆粕的赖氨酸含量分别为5.51％和2.96％。而在该条件下蛋白核小球藻中的lys占eaa的32.53％，可以弥补常规饲料中lys的缺乏的现象。
[0068]
综合以上所述，本方案构建了一种调控蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水并联产高质量蛋白的策略，能够兼顾污水处理、微藻生长和蛋白积累的调控策略。对污水处理和指导微藻规模化培养具有重要意义。
[0069]
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技
术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

技术特征：
1.一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水的方法，其特征在于：包括如下过程：利用蛋白核小球藻处理模拟罗非鱼养殖污水，并在设定的温度、红光以及额外添加淀粉量的条件下使tp、tn、cod和tan的去除率分别达到了85.15、96.96、88.53和98％，生物量达到了1.15g/l,蛋白含量达到了52％，其中赖氨酸占必需氨基酸总量的32.53％；其中，设定的温度、红光以及额外添加淀粉的条件为：温度为30℃，红光的波长为9500-15000lux，淀粉量为0.5g/l。2.根据权利要求1所述的一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水的方法，其特征在于：具体的操作为：将蛋白核小球藻接种于配置模拟罗非鱼养殖污水，蛋白核小球藻的接种量为10％(v/v)，模拟罗非鱼养殖污水在摇瓶中，摇瓶设置在摇床上，设定蛋白核小球藻培养条件，培养条件包括温度、光源以及碳源，设定调节条件如下，培养温度为20-30℃，培养光源为白光、红光或者蓝光，碳源为葡萄糖、淀粉或者麸皮，摇床条件为转速140rpm、光照强度80μem-2
s-1
、光暗比为24h：0h的恒温振荡摇床。3.根据权利要求1所述的一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水的方法，其特征在于：包括如下过程：将蛋白核小球藻接种于罗非鱼养殖污水中，在最佳条件下进行板式反应器培养，最佳条件为培养温度30℃，光源为红光，碳源为淀粉，板式反应器由总体积为5l的开放平板光反应器组成，材质为有机玻璃，每个反应器由一个可拆卸的盖子，混合气体由恒流泵提供，并通过底部的四个端口充气。

技术总结
本发明提供一种利用蛋白核小球藻处理罗非鱼养殖污水并联产高质量蛋白的方法，包括利用蛋白核小球藻处理模拟罗非鱼养殖污水，并在设定的温度、红光以及额外添加淀粉的条件下去除了罗非鱼养殖污水中85.15％的TP，96.96％的TN，88.53％的COD，98.0％的TAN，使养殖污水出水水质符合淡水养殖尾水排放二级标准，且本发明在污水中分离收获的藻体，生物量达到了1.15g/L,蛋白含量占52％，其中赖氨酸占必需氨基酸总量的32.53％.通过本方法可以兼顾污水处理微藻生长和蛋白积累，降低了污水处理成本的同时又能够收集生物质作为优质水产饲料的蛋白来源。蛋白来源。蛋白来源。


技术研发人员：牟海津 王佳 孙翰 汪雨欣
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/22