一种微生物浓度的监测系统及方法

1.本发明涉及微生物浓度检测技术领域，具体涉及一种微生物浓度的监测系统及方法。


背景技术：

2.微生物浓度反映着微生物活力，通过实时监测微生物生长过程中浓度变化，可以获悉酶活力及诱导重组蛋白的最佳时间，进而可以监测酶促反应并计算酶催化反应的速率。测量微生物浓度常采用以下方法：干重法、血球板计数法、pct平板计数法、生物传感器测定法、代谢产物法、光学测定法等。
3.相较上述多种方法，光学测定法存在显著优势。该方法以浊度来表征微生物浓度，在1min内可实现高准确度测量(r2》0.9)，且以非接触、非破坏的方式自动测量。一般来说，微生物可视为直径约为1μm的颗粒，受光照射后会产生反射、散射、吸收或透射现象。依据朗伯比尔定律，微生物浓度愈高，溶液吸收的光、反射及散射的光愈多，光强的衰减也愈显著。故通过实时监测透射光强，可以间接测量微生物的浓度变化。
4.由于各菌种光谱特性不一，测量od值时所使用的波长也存在差异，通常400～700nm都是微生物测定的范围，其中505nm测菌丝菌体、560nm测酵母、600nm测细菌。当以600nm波长测定od值时，存在下述问题：(1)600nm属于可见光范围，而部分微生物自身具有色素分子，或者代谢产生的色素吸收可见光而影响准确率。此外，不同批次、颜色的培养基，都会使矫正模型发生不同程度的偏离；(2)微生物培养与od测定分离，取样破坏原生环境，且增加染菌风险的同时会消耗样本；(3)微生物完整生长周期时间长，取样工作量大。以大肠杆菌为例，10h后方进入平台期，需间隔半小时取样测量一次od；(4)判断微生物生长状态依赖实验人员的实验经验；(5)od
600
线性范围小(0.2-0.8)，当微生物培养中od
600
值超过0.8时，实际测量存在误差，需倍比稀释后再测量。
5.可见，常规光学测定法虽然能够准确、自动且无损监测多菌种的微生物浓度，却仍有两个难题苛待解决，包括：抗颜色干扰性能差及高浓度(od
600nm
》2.5)测定准确性差。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种微生物浓度的监测系统，以解决现有技术中抗颜色干扰性能差及高浓度测定准确性差的技术问题。
7.为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案：
8.一种微生物浓度的监测系统，包括光源驱动模块、光电转换模块、无线传输模块、a/d模数转换模块、mcu芯片、上位机、led光源、光源波长测算模块，所述光源驱动模块与所述mcu芯片、led光源均电性连接，光电转换模块、a/d模数转换模块和mcu芯片依次电性连接，mcu芯片与上位机通过uart协议进行有线通信连接得到有线通信通路，所述mcu芯片与无线传输模块通过uart协议进行有线通信连接，以及所述无线传输模块与上位机通过socket协议进行无线通信连接得到无线通信通路，所述led光源、透镜、待测溶液、光电转换
模块构成利用光电转换监测微生物浓度的监测通路，所述待测溶液为用于监测微生物浓度的微生物培养溶液，其中，
9.所述光源驱动模块用于将mcu芯片提供的pwm波转换成稳压直流信号以驱动led光源发射稳定；
10.所述光电转换模块用于将由led光源经过透镜产生的平行光线照射待测溶液的透射光强转化为稳定的电流进行输出，以实现光电转换；
11.所述a/d模数转换模块用于将光电转换模块输出的电流由模拟信号转换为数字信号得到光电转换模块输出电流的数字信号，并以spi协议反馈所述输出电流的数字信号于mcu芯片；
12.所述无线通信通路中mcu芯片对输出电流的数字信号预处理后，以uart协议将输出电流的有效数字信号缓存至无线传输模块，再由无线传输模块通过基于socket协议的无线通信方式将采样数据实时传输至上位机；
13.所述优先通信通路中上位机通过基于uart协议的有线通信方式对mcu芯片的配置及flash中缓存数据进行操作；
14.所述光源波长测算模块用于测算监测微生物浓度的最优波长，将最优波长作为光源波长，并以光源波长选定led光源；
15.所述上位机中内置有微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，所述微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型分别基于上位机内由所述数字电流信号得到的系统光密度od
sys
进行线性校准和非线性校准得到标准微生物浓度od
600nm
，以实现通过电流信号对微生物浓度进行直接定量量化，所述系统光密度od
sys
为上位机利用朗伯比尔定律对数字电流信号进行换算得到，所述标准微生物浓度为光源波长为600nm时的微生物浓度。
16.所述光源驱动模块包括电阻r1，电容c1，电阻r2，驱动芯片max1916，模拟供电电源avcc，模拟地线，所述电阻r1一端与mcu芯片的pwm波的输出端相连接，电阻r1的另一端分别与电容c1的一端、电阻r2的一端相连接，电容c1的另一端与模拟地线相连接，电阻r2的另一端与驱动芯片max1916的set端相连接，驱动芯片max1916的gnd端与模拟地线相连接，所述驱动芯片max1916的led端与led光源的负极相连接，所述模拟供电电源avcc与led光源的正极相连接。
17.作为本发明的一种优选方案，所述光电转换模块包括光电池phdiode，电容c2，电阻r3，信号放大器，数字供电电源dvcc，数字地线，模拟地线，所述光电池phdiode的正极分别与电容c2的一端、电阻r3的一端和信号放大器的反向输入端相连接，电容c2的另一端和电阻r3的另一端均与信号放大器的输出端相连接，所述光电池phdiode的负极分别与模拟地线、信号放大器的同向输入端相连接，所述信号放大器的正电源端与数字供电电源dvcc相连接，所述信号放大器的负电源端与数字地线相连接，所述信号放大器的输出端与a/d模数转换模块相连接。
18.作为本发明的一种优选方案，所述监测通路中led光源、透镜、光电转换模块均置于待测溶液中，且led光源和光电转换模块与待测溶液接触位置均做了防水处理，所述监测通路中led光源的发出光线依次通过透镜和待测溶液到达光电转换模块中光电池处所形成的光程为1cm，所述透镜将led光源的发出光线调整为平行光线。
19.作为本发明的一种优选方案，本发明提供了一种所述的微生物浓度的监测系统的监测方法，包括以下步骤：
20.测算监测系统的光源波长，并利用光源波长选取led光源；
21.基于led光源组成所述监测系统，并将监测通路中led光源、透镜、光电转换模块均置于待测溶液中进行光电转换，获取数字电流信号利用朗伯比尔定律换算为待测溶液中的系统光密度od
sys
；
22.构建所述微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，分别将系统光密度od
sys
进行线性校准和非线性校准为微生物浓度od
600nm
。
23.作为本发明的一种优选方案，所述测算监测系统的光源波长，包括：
24.利用紫外分光光度计对不同浓度的各微生物培养溶液在350～1100nm范围内扫描吸收光谱，其中400～780nm为可见光波段，780～1100nm属于近红外波段，微生物包括酵母菌，芽孢杆菌，节杆菌和大肠杆菌；
25.分析扫描后的全光谱图，并在全光谱图中标记出各微生物培养溶液的吸光度与浓度成正相关的波段区间作为光源波长选取区间；
26.将各微生物在光源照射下的吸光均衡性、透射性、稳定性和lb培养溶液的颜色影响性作为光源波长的评价指标，利用梯度变化方式在光源波长选取区间中选取多个光线波长，并将多个光线波长利用评价指标进行评价得到多组评价指标数据；
27.利用bp神经网络对所述光线波长和各微生物对应的评价指标数据进行网络训练得到表征光线波长和评价指标映射关系的各微生物的光源波长评价模型，所述各微生物的光源波长评价指标的模型表达式为：
28.[a,b,c,d]
x
＝bp
x
(l)；
[0029]
式中，x∈[酵母菌；芽孢杆菌；节杆菌；大肠杆菌]，a,b,c,d分别为吸光均衡性，透射性，稳定性，lb培养溶液的颜色影响性，l为光线波长，bp为bp神经网络；
[0030]
将光源波长选取区间中所有的光线波长均输入至各微生物的光源波长评价模型中得到各微生物在光源波长选取区间中所有的光线波长处的评价指标数据；
[0031]
将各微生物对应的评价指标数据在同一光线波长处进行均值化处理，将均值处理后最优的评价指标数据对应的光线波长作为所述光源波长。
[0032]
作为本发明的一种优选方案，所述系统光密度odsys的计算方法包括：
[0033]
基于朗伯比尔定律中所述透射光强随微生物浓度增加按指数衰减关系以及光电转换模块输出电流的数字信号与所述透射光强的正比关系，得到光电转换模块输出电流的数字信号的对数与微生物浓度的线性关系，所述光电转换模块输出电流的数字信号的对数与微生物浓度的线性关系为：
[0034][0035]
式中，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，j为系统测量电路参数，i
out
为透射光强；g为测量仪器的几何参数，i
in
为入射光强，k为微生物吸收系数，l为光程长度，单位cm；t为微生物浓度，单位mol
·
l-1
；
[0036]
基于光密度计算公式中表征的透光率为透射光强与入射光强之比，得到系统光密
度od
sys
与微生物浓度的线性关系，所述系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系为：
[0037][0038]
式中，od
sys
为系统光密度，t为透光率，c为常数项，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号。
[0039]
作为本发明的一种优选方案，所述微生物浓度线性校准模型的构建包括：
[0040]
基于系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系分析出标准微生物浓度可由校正因子δ对不同波长的系统光密度换算得到，所述标准微生物浓度的系统光密度换算公式为：
[0041][0042]
式中，od600
nm
为标准微生物浓度，δ为校正因子，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号；
[0043]
基于标准微生物浓度的系统光密度换算公式得出数字电流信号与微生物浓度为近似线性关系，根据近似线性关系将偏最小二乘法模型引入标准微生物浓度的系统光密度换算公式进行线性拟合得到所述微生物浓度线性校准模型；
[0044]
所述微生物浓度线性校准模型的模型表达式为：
[0045][0046]
式中，od
600nm
为标准微生物浓度，a为线性拟合系数，d为常数项，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号。
[0047]
作为本发明的一种优选方案，所述微生物浓度非线性校准模型的构建包括：
[0048]
根据近似线性关系将四阶多项式模型引入标准微生物浓度的系统光密度换算公式进行线性拟合得到所述微生物浓度非线性校准模型；
[0049]
所述微生物浓度非线性校准模型的模型表达式为：
[0050][0051]
式中，od
600nm
为标准微生物浓度，b1、b2、b3和b4分别为四阶多项式的拟合系数，e为常数项，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号。
[0052]
作为本发明的一种优选方案，所述微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型中的od
600nm
均由紫外分光光度计在微生物待测溶液中进行实测得到。
[0053]
本发明与现有技术相比较具有如下有益效果：
[0054]
本发明构建的监测系统将传统以光吸收为定量指标转换为光散射，采用最优波长的led光源作为光源测定系统光密度od
sys
，通过建立偏最小二乘法线性模型及四阶多项式非线性模型进行拟合校准得到od
600nm
，提高抗色素干扰能力，以及提高高浓度(od600
nm
》2.5)测定准确性。
附图说明
[0055]
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0056]
图1为本发明实施例提供的监测系统结构框图；
[0057]
图2为本发明实施例提供的光源驱动模块和光电转换模块电路图；
[0058]
图3为本发明实施例提供的监测通路示意图；
[0059]
图4为本发明实施例提供的监测方法流程图；
[0060]
图5为本发明实施例提供的各菌种全光谱图像；
[0061]
图5(a)为本发明实施例提供的酵母菌全光谱图像；
[0062]
图5(b)为本发明实施例提供的芽孢杆菌全光谱图像；
[0063]
图5(c)为本发明实施例提供的节杆菌全光谱图像；
[0064]
图5(d)为本发明实施例提供的大肠杆菌全光谱图像。
具体实施方式
[0065]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0066]
微生物浓度的检测方法中光学测定法存在显著优势，该方法以浊度来表征微生物浓度，在1min内可实现高准确度测量(r2》0.9)，且以非接触、非破坏的方式自动测量。一般来说，微生物可视为直径约为1μm的颗粒，受光照射后会产生反射、散射、吸收或透射现象。依据朗伯比尔定律，微生物浓度愈高，溶液吸收的光、反射及散射的光愈多，光强的衰减也愈显著，故通过监测透射光强，可以间接测量微生物的浓度。因此，本发明基于光学测定法的原理提出了一种微生物浓度的监测系统，能够通过光电转换将透射光强转化为电信号，通过监测电信号间接测量微生物的浓度，实现准确、自动且无损监测多菌种的微生物浓度。
[0067]
如图1所示，本发明提供了一种微生物浓度的监测系统，包括光源驱动模块、光电转换模块、无线传输模块、a/d模数转换模块、mcu芯片、上位机、led光源、光源波长测算模块，光源驱动模块与mcu芯片、led光源均电性连接，光电转换模块、a/d模数转换模块和mcu芯片依次电性连接，mcu芯片与上位机通过uart协议进行有线通信连接得到有线通信通路，mcu芯片与无线传输模块通过uart协议进行有线通信连接，以及无线传输模块与上位机通过socket协议进行无线通信连接得到无线通信通路，led光源、透镜、待测溶液、光电转换模块构成利用光电转换监测微生物浓度的监测通路，待测溶液为用于监测微生物浓度的微生物培养溶液，其中，
[0068]
光源驱动模块用于将mcu芯片提供的pwm波转换成稳压直流信号以驱动led光源发射稳定；
[0069]
光电转换模块用于将由led光源经过透镜产生的平行光线照射待测溶液的透射光强转化为稳定的电流进行输出，以实现光电转换；
[0070]
a/d模数转换模块用于将光电转换模块输出的电流由模拟信号转换为数字信号得到光电转换模块输出电流的数字信号，并以spi协议反馈输出电流的数字信号于mcu芯片；
[0071]
无线通信通路中mcu芯片对输出电流的数字信号预处理后，以uart协议将输出电流的有效数字信号缓存至无线传输模块，再由无线传输模块通过基于socket协议的无线通信方式将采样数据实时传输至上位机；
[0072]
优先通信通路中上位机通过基于uart协议的有线通信方式对mcu芯片的配置及flash中缓存数据进行操作；
[0073]
本发明提供的监测系统中包含光源波长测算模块，用于测算监测微生物浓度的最优波长，避免微生物色素以及培养基颜色影响，影响吸收机制中光吸收作用程度越高，瑞利散射现象越明显，当外界环境发生变化后，色素的产生和沉淀会导致微生物浓度的监测偏差较大的影响，而且最优波长还能够提高对各种类微生物浓度测量的泛化能力，即能够在各种类微生物浓度的监测中均保持准确的测量结果。
[0074]
光源波长测算模块用于测算监测微生物浓度的最优波长，将最优波长作为光源波长，并以光源波长选定led光源；
[0075]
具体的，测算监测系统的光源波长的具体步骤为：
[0076]
利用紫外分光光度计对不同浓度的各微生物培养溶液在350～1100nm范围内扫描吸收光谱，其中400～780nm为可见光波段，780～1100nm属于近红外波段，微生物包括酵母菌，芽孢杆菌，节杆菌和大肠杆菌；
[0077]
分析扫描后的全光谱图，并在全光谱图中标记出各微生物培养溶液的吸光度与浓度成正相关的波段区间作为光源波长选取区间，即由图5扫描后的全光谱图可知，在不同稀释条件下，酵母菌和节杆菌在350～450nm波段吸光度起伏大，4种微生物在450～1050nm波段曲线起伏相对较小，550～1000nm区间各菌株稀释培养物的吸光度与浓度成正相关，适合用于多种类微生物的浓度测量，因此将550～1000nm作为光源波长选取区间；
[0078]
将各微生物在光源照射下的吸光均衡性、透射性、稳定性和lb培养溶液的颜色影响性作为光源波长的评价指标，利用梯度变化方式在光源波长选取区间中选取多个光线波长，并将多个光线波长利用评价指标进行评价得到多组评价指标数据；
[0079]
利用bp神经网络对光线波长和各微生物对应的评价指标数据进行网络训练得到表征光线波长和评价指标映射关系的各微生物的光源波长评价模型，各微生物的光源波长评价指标的模型表达式为：
[0080]
[a,b,c,d]
x
＝bp
x
(l)；
[0081]
式中，x∈[酵母菌；芽孢杆菌；节杆菌；大肠杆菌]，a,b,c,d分别为吸光均衡性，透射性，稳定性，lb培养溶液的颜色影响性，l为光线波长，bp为bp神经网络；
[0082]
将光源波长选取区间中所有的光线波长均输入至各微生物的光源波长评价模型中得到各微生物在光源波长选取区间中所有的光线波长处的评价指标数据；
[0083]
将各微生物对应的评价指标数据在同一光线波长处进行均值化处理，将均值处理后最优的评价指标数据对应的光线波长作为光源波长；
[0084]
在光源波长选取区间550～1000nm中所有的光线波长均利用光源波长评价模型中得到各微生物在光源波长选取区间中所有的光线波长处的评价指标数据，将各微生物对应的评价指标数据在同一光线波长处进行均值化处理，将均值处理后最优的评价指标数据对
应的光线波长为890nm，最终选定中间值890nm为光源波长。因此选取光线波长为890nm的led光源，能够在监测微生物浓度时，一方面可以提高对各菌株测量的泛化能力，另一方面可以避免高浓度引起的瑞利散射现象所带来的干扰。
[0085]
监测通路通过监测数字电流信号计算只可以得到系统光密度od
sys
，而无法得到微生物浓度，因此在上位机中内置有微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，可以对系统光密度od
sys
进行校准得到标准微生物浓度od
600nm
，而系统光密度od
sys
与数字电流信号有关，进而直接由数字电流信号校准得到准确的微生物浓度。
[0086]
具体的，上位机中内置有微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型分别基于上位机内由数字电流信号得到的系统光密度od
sys
进行线性校准和非线性校准得到标准微生物浓度od
600nm
，以实现通过电流信号对微生物浓度进行直接定量量化，系统光密度od
sys
为上位机利用朗伯比尔定律对数字电流信号进行换算得到，标准微生物浓度为光源波长为600nm时的微生物浓度。
[0087]
在光电转换时，需要保持led光源的稳定性，才能够保证对透射光强的稳定转换，使得数字电流信号稳定，最终保证微生物浓度的监测稳定性。
[0088]
如图2所示，具体的，光源驱动模块包括电阻r1，电容c1，电阻r2，驱动芯片max1916，模拟供电电源avcc，模拟地线，电阻r1一端与mcu芯片的pwm波的输出端相连接，电阻r1的另一端分别与电容c1的一端、电阻r2的一端相连接，电容c1的另一端与模拟地线相连接，电阻r2的另一端与驱动芯片max1916的set端相连接，驱动芯片max1916的gnd端与模拟地线相连接，驱动芯片max1916的led端与led光源的负极相连接，模拟供电电源avcc与led光源的正极相连接。
[0089]
光源驱动模块采用驱动芯片max1916为led提供恒定电流，光源驱动模块中rc低通滤波器由电阻r1(1kω)、电容c1(0.1μf)组成，其截止频率远远小于输入的pwm频率(1khz)，从而实现对pwm滤波，并使其由矩形脉冲波转换为稳定电平，用于稳定max1916驱动芯片set端口的控制电压。偏置电流i
input
由set端流入，电流大小与载流电阻r2的关系为i
input
＝(v
lowpass-v
set
)/r2，其中v
lowpass
是经低通滤波后的稳定电压。en为使能端，当端口置为高电平时，芯片工作，led引脚输出驱动电流，该电流大小与set端口输入电流i
input
之间关系为：i
led
＝230i
input
＝230(v
lowpass-v
set
)/r2。因此，将pwm波转换为稳定电平，稳定led驱动芯片max1916的输入电压及电流，从而确保光源发射稳定。
[0090]
光电转换模块包括光电池phdiode，电容c2，电阻r3，信号放大器，数字供电电源dvcc，数字地线，模拟地线，光电池phdiode的正极分别与电容c2的一端、电阻r3的一端和信号放大器的反向输入端相连接，电容c2的另一端和电阻r3的另一端均与信号放大器的输出端相连接，光电池phdiode的负极分别与模拟地线、信号放大器的同向输入端相连接，信号放大器的正电源端与数字供电电源dvcc相连接，信号放大器的负电源端与数字地线相连接，信号放大器的输出端与a/d模数转换模块相连接。
[0091]
光电转换模块主要包含滤波、放大两项功能。光电池电流经c2电容滤波去噪后，由信号放大器组成的放大电路放大104倍，完成光电转换。随后，信号经a/d采样、量化、编码，最终实现模拟信号转为数字信号，用于实验分析。
[0092]
监测通路中led光源、透镜、光电转换模块均置于待测溶液中，且led光源和光电转换模块与待测溶液接触位置均做了防水处理，监测通路中led光源的发出光线依次通过透
镜和待测溶液到达光电转换模块中光电池处所形成的光程为1cm，透镜将led光源的发出光线调整为平行光线。
[0093]
本发明提供的监测系统，能够通过光电转换将透射光强转化为电信号，通过监测电信号间接测量微生物的浓度，通过确定最优波长，使得监测系统能够在监测微生物浓度时，一方面可以提高对各菌株测量的泛化能力，另一方面可以避免高浓度引起的瑞利散射现象所带来的干扰，实现准确、自动且无损监测多菌种的微生物浓度，并且结合微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，适用于不同场景和菌种，能够覆盖较多的微生物浓度监测情况，全面性更强。
[0094]
本发明提供了一种监测系统与待测溶液的放置实例，为了能够以透射法实现原位测量，避免无关介质折射所带来的噪声，具体的，如图3所示，将监测通路置于三角瓶的原生环境内，监测通路通过金属制管延伸至250ml的三角瓶内，标准光程为1cm。在三角瓶中置入200ml的lb培养基后，确保液面没过光路。采用一个中心波长为890nm的led发光二极管作为光源，具有稳定性好、光谱宽度窄、寿命长、发光效率高及功耗低的优势。入射光线经透镜调整为平行光线后，直接照射待测溶液，然后由光电池采集透射光强。当微生物需进入培养状态时，将三角瓶放置于恒温振荡培养箱中，以恒温、恒速旋转振荡，该环境下，待测溶液处于均匀混合状态，能有效减小测量误差。光路中led、光电池与待测溶液接触的地方均做了防水处理，避免溶液渗漏。
[0095]
本发明提供了一种的微生物浓度的监测系统的监测方法，包括以下步骤：
[0096]
测算监测系统的光源波长，并利用光源波长选取led光源；
[0097]
基于led光源组成监测系统，并将监测通路中led光源、透镜、光电转换模块均置于待测溶液中进行光电转换，获取数字电流信号利用朗伯比尔定律换算为待测溶液中的系统光密度od
sys
；
[0098]
构建微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，分别将系统光密度od
sys
进行线性校准和非线性校准为微生物浓度od
600nm
。
[0099]
测算监测微生物浓度的最优波长，避免微生物色素以及培养基颜色影响，影响吸收机制中光吸收作用程度越高，瑞利散射现象越明显，当外界环境发生变化后，色素的产生和沉淀会导致微生物浓度的监测偏差较大的影响，而且最优波长还能够提高对各种类微生物浓度测量的泛化能力，即能够在各种类微生物浓度的监测中均保持准确的测量结果，因此本发明提供了一种监测系统的光源波长测算方法，步骤为：
[0100]
利用紫外分光光度计对不同浓度的各微生物培养溶液在350～1100nm范围内扫描吸收光谱，其中400～780nm为可见光波段，780～1100nm属于近红外波段，微生物包括酵母菌，芽孢杆菌，节杆菌和大肠杆菌；
[0101]
分析扫描后的全光谱图，并在全光谱图中标记出各微生物培养溶液的吸光度与浓度成正相关的波段区间作为光源波长选取区间；
[0102]
将各微生物在光源照射下的吸光均衡性、透射性、稳定性和lb培养溶液的颜色影响性作为光源波长的评价指标，利用梯度变化方式在光源波长选取区间中选取多个光线波长，并将多个光线波长利用评价指标进行评价得到多组评价指标数据；
[0103]
利用bp神经网络对光线波长和各微生物对应的评价指标数据进行网络训练得到表征光线波长和评价指标映射关系的各微生物的光源波长评价模型，各微生物的光源波长
评价指标的模型表达式为：
[0104]
[a,b,c,d]
x
＝bp
x
(l)；
[0105]
式中，x∈[酵母菌；芽孢杆菌；节杆菌；大肠杆菌]，a,b,c,d分别为吸光均衡性，透射性，稳定性，lb培养溶液的颜色影响性，l为光线波长，bp为bp神经网络；
[0106]
将光源波长选取区间中所有的光线波长均输入至各微生物的光源波长评价模型中得到各微生物在光源波长选取区间中所有的光线波长处的评价指标数据；
[0107]
将各微生物对应的评价指标数据在同一光线波长处进行均值化处理，将均值处理后最优的评价指标数据对应的光线波长作为光源波长。
[0108]
本发明提供了一种测算监测系统的光源波长的实例，具体步骤如下：
[0109]
利用紫外分光光度计对不同浓度的各微生物培养溶液在350～1100nm范围内扫描吸收光谱，其中400～780nm为可见光波段，780～1100nm属于近红外波段，微生物包括酵母菌，芽孢杆菌，节杆菌和大肠杆菌；
[0110]
分析扫描后的全光谱图，并在全光谱图中标记出各微生物培养溶液的吸光度与浓度成正相关的波段区间作为光源波长选取区间，即由图5扫描后的全光谱图可知，在不同稀释条件下，酵母菌和节杆菌在350～450nm波段吸光度起伏大，4种微生物在450～1050nm波段曲线起伏相对较小，550～1000nm区间各菌株稀释培养物的吸光度与浓度成正相关，适合用于多种类微生物的浓度测量，因此将550～1000nm作为光源波长选取区间；
[0111]
在光源波长选取区间550～1000nm中所有的光线波长均利用光源波长评价模型中得到各微生物在光源波长选取区间中所有的光线波长处的评价指标数据，将各微生物对应的评价指标数据在同一光线波长处进行均值化处理，将均值处理后最优的评价指标数据对应的光线波长为890nm，最终选定中间值890nm为光源波长。因此选取光线波长为890nm的led光源，则系统光密度odsys为od
890nm
，能够在监测微生物浓度时，一方面可以提高对各菌株测量的泛化能力，另一方面可以避免高浓度引起的瑞利散射现象所带来的干扰。
[0112]
系统光密度odsys的计算方法包括：
[0113]
基于朗伯比尔定律中透射光强随微生物浓度增加按指数衰减关系以及光电转换模块输出电流的数字信号与透射光强的正比关系，得到光电转换模块输出电流的数字信号的对数与微生物浓度的线性关系，光电转换模块输出电流的数字信号的对数与微生物浓度的线性关系为：
[0114][0115]
式中，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，j为系统测量电路参数，i
out
为透射光强；g为测量仪器的几何参数，i
in
为入射光强，k为微生物吸收系数，l为光程长度，单位cm；t为微生物浓度，单位mol
·
l-1
；
[0116]
基于光密度计算公式中表征的透光率为透射光强与入射光强之比，得到系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系，系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系为：
[0117][0118]
式中，od
sys
为系统光密度，t为透光率，c为常数项，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号。
[0119]
微生物浓度的监测存在微生物菌种不同，以及监测场景不同，监测场景包括静态监测和动态监测，因此，微生物浓度由数字电流信号进行校正得到方式也不同，本发明提供了两种校准模型，分别为微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，其中，
[0120]
微生物浓度线性校准模型的构建包括：
[0121]
基于系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系分析出标准微生物浓度可由校正因子δ对不同波长的系统光密度换算得到，标准微生物浓度的系统光密度换算公式为：
[0122][0123]
式中，od600
nm
为标准微生物浓度，δ为校正因子，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号；
[0124]
基于标准微生物浓度的系统光密度换算公式得出数字电流信号与微生物浓度为近似线性关系，根据近似线性关系将偏最小二乘法模型引入标准微生物浓度的系统光密度换算公式进行线性拟合得到微生物浓度线性校准模型；
[0125]
微生物浓度线性校准模型的模型表达式为：
[0126][0127]
式中，od
600nm
为标准微生物浓度，a为线性拟合系数，d为常数项，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号。
[0128]
微生物浓度非线性校准模型的构建包括：
[0129]
根据近似线性关系将四阶多项式模型引入标准微生物浓度的系统光密度换算公式进行线性拟合得到微生物浓度非线性校准模型；
[0130]
微生物浓度非线性校准模型的模型表达式为：
[0131][0132]
式中，od
600nm
为标准微生物浓度，b1、b2、b3和b4分别为四阶多项式的拟合系数，e为常数项，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号。
[0133]
微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型中的od
600nm
均由紫外分光光度计在微生物待测溶液中进行实测得到。
[0134]
通过多菌种验证试验，在静态校准中，四阶多项式模型比偏最小二乘法(pls)模型具有更好的准确率，四种菌种均差率介于4.11％-4.53％，od
600nm
实测与od
600nm
测算误差平均值为0.061。由于微生物特性，酵母菌比其余三个菌种在平台期时具有更大的生长量，而
pls模型在高浓度时(od
600nm
》2.1)预测效果更好，如酵母菌均差率为5.1％，而其余三个菌种均差率》30％，od
600nm
误差值》0.34。动态监测时在均匀晃动及od
600nm
《1.5条件下，转换因子近似线性关系，pls模型r2＝0.9972。因此，微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型适用于不同场景和菌种，本发明提供的两种校准模型，能够覆盖较多的微生物浓度监测情况，全面性更强。
[0135]
本发明还提供了一种静态监测和动态监测的实例，选取不同类型微生物培养，用系统测定其生长曲线，分析对革兰氏阳性、阴性细菌、杆状、球状细菌及真菌的响应情况。将监测系统和培养基预热3h后，在超净台无菌环境中，取各菌株种子液，按1％接种量200μl转接至250ml三角瓶中(含200ml lb液体培养基)，各菌种接种3组作为平行实验，1组不接种用于温度补偿。接种后，将插有系统装置的三角瓶置于摇床中培养。待培养至平台期，取样溶液1ml并用紫外分光光度计实测的od
600nm
作为真实值，与拟合公式所得的预测值相对比。由表1可知两种模型在静态与动态预测下各菌种的测量误差比、采样时间、生长环境，qp表示为线性校准模型，pls表示为非线性校准模型。
[0136]
表1多菌种实测结果
[0137][0138]
表1列举了四种微生物菌种分别使用pls、四阶多项式两种模型，以静态监测、动态监测两种方式拟合所得公式换算的od
600nm
预测值与od
600nm
实测值的偏差情况，评价指标为平行实验误差率的均值。分析可知，在静态预测中，四阶多项式模型比pls模型具有更好的准确率，四种菌种均差率介于4.11％-4.53％，od
600nm
实测与od
600nm
预测误差平均值为0.061。由于微生物特性，酵母菌比其余三个菌种在平台期时具有更大的生长量，而pls模型在高浓度时(od
600nm
》2.1)预测效果更好，如酵母菌均差率为5.1％，而其余三个菌种均差率》30％，od
600nm
误差值》0.34。在动态预测中，pls模型与四阶非线性模型在预测高浓度酵母菌od
600nm
数值时效果不理想，pls与四阶模型误差率均值分别为94.88％、917.53％，pls线性模型预测值比非线性模型误差更小，造成误差原因有两点：(1)公式拟合时以芽孢杆菌为实验对象，其平台期时浓度较小(od
600nm
《2)，模型未能正确反映高浓度时od
sys
与od
600nm
之间数值关系。(2)当od
600nm
》0.8时，取样的微生物溶液未稀释，致使紫外分光光度计在测定参照值时存在较大误差，且误差随od值增大而逐步增大。除酵母菌之外，动态预测中pls及四阶多项式模型预测芽孢杆菌、节杆菌、大肠杆菌误差率均值差异较小，两种模型中，节杆菌误差最
小，分别为1.14％、1.84％，大肠杆菌误差最大，分别为7.28％、5.52％，两种模型预测效果近似。结果表明，静态预测时，四阶多项式非线性模型预测效果优于pls线性模型，四种菌种预测误差率均值皆小于4.6％。动态预测时，pls线性模型在预测高浓度酵母菌(od
600nm
》2)时，效果优于四阶多项式模型，预测芽孢杆菌、节杆菌及大肠杆菌时，两种模型预测偏差较小，表明此时od
sys
与od
600nm
对应关系近似线性。
[0139]
本发明构建的监测系统将传统以光吸收为定量指标转换为光散射，采用最优波长的led光源作为光源测定系统光密度odsys，通过建立偏最小二乘法线性模型及四阶多项式非线性模型进行拟合校准得到od
600nm
，提高抗色素干扰能力，以及提高高浓度(od
600nm
》2.5)测定准确性。
[0140]
以上实施例仅为本技术的示例性实施例，不用于限制本技术，本技术的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本技术的实质和保护范围内，对本技术做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本技术的保护范围内。

技术特征：
1.一种微生物浓度的监测系统，其特征在于，包括光源驱动模块、光电转换模块、无线传输模块、a/d模数转换模块、mcu芯片、上位机、led光源、光源波长测算模块，所述光源驱动模块与所述mcu芯片、led光源均电性连接，光电转换模块、a/d模数转换模块和mcu芯片依次电性连接，mcu芯片与上位机通过uart协议进行有线通信连接得到有线通信通路，所述mcu芯片与无线传输模块通过uart协议进行有线通信连接，以及所述无线传输模块与上位机通过socket协议进行无线通信连接得到无线通信通路，所述led光源、透镜、待测溶液、光电转换模块构成利用光电转换监测微生物浓度的监测通路，所述待测溶液为用于监测微生物浓度的微生物培养溶液，其中，所述光源驱动模块用于将mcu芯片提供的pwm波转换成稳压直流信号以驱动led光源发射稳定；所述光电转换模块用于将由led光源经过透镜产生的平行光线照射待测溶液的透射光强转化为稳定的电流进行输出，以实现光电转换；所述a/d模数转换模块用于将光电转换模块输出的电流由模拟信号转换为数字信号得到光电转换模块输出电流的数字信号，并以spi协议反馈所述输出电流的数字信号于mcu芯片；所述无线通信通路中mcu芯片对输出电流的数字信号预处理后，以uart协议将输出电流的有效数字信号缓存至无线传输模块，再由无线传输模块通过基于socket协议的无线通信方式将采样数据实时传输至上位机；所述优先通信通路中上位机通过基于uart协议的有线通信方式对mcu芯片的配置及flash中缓存数据进行操作；所述光源波长测算模块用于测算监测微生物浓度的最优波长，将最优波长作为光源波长，并以光源波长选定led光源；所述上位机中内置有微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，所述微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型分别基于上位机内由所述数字电流信号得到的系统光密度od
sys
进行线性校准和非线性校准得到标准微生物浓度od
600nm
，以实现通过电流信号对微生物浓度进行直接定量量化；所述系统光密度od
sys
为上位机利用朗伯比尔定律对数字电流信号进行换算得到，所述标准微生物浓度为光源波长为600nm时的微生物浓度。2.根据权利要求1所述的一种微生物浓度的监测系统，其特征在于：所述光源驱动模块包括电阻r1，电容c1，电阻r2，驱动芯片max1916，模拟供电电源avcc，模拟地线，所述电阻r1一端与mcu芯片的pwm波的输出端相连接，电阻r1的另一端分别与电容c1的一端、电阻r2的一端相连接，电容c1的另一端与模拟地线相连接，电阻r2的另一端与驱动芯片max1916的set端相连接，驱动芯片max1916的gnd端与模拟地线相连接，所述驱动芯片max1916的led端与led光源的负极相连接，所述模拟供电电源avcc与led光源的正极相连接。3.根据权利要求1所述的一种微生物浓度的监测系统，其特征在于：所述光电转换模块包括光电池phdiode，电容c2，电阻r3，信号放大器，数字供电电源dvcc，数字地线，模拟地线，所述光电池phdiode的正极分别与电容c2的一端、电阻r3的一端和信号放大器的反向输入端相连接，电容c2的另一端和电阻r3的另一端均与信号放大器的输出端相连接，所述光电池phdiode的负极分别与模拟地线、信号放大器的同向输入端相连接，所述信号放大器的
正电源端与数字供电电源dvcc相连接，所述信号放大器的负电源端与数字地线相连接，所述信号放大器的输出端与a/d模数转换模块相连接。4.根据权利要求3所述的一种微生物浓度的监测系统，其特征在于：所述监测通路中led光源、透镜、光电转换模块均置于待测溶液中，且led光源和光电转换模块与待测溶液接触位置均做了防水处理，所述监测通路中led光源的发出光线依次通过透镜和待测溶液到达光电转换模块中光电池处所形成的光程为1cm，所述透镜将led光源的发出光线调整为平行光线。5.一种根据权利要求1-4任一项所述的微生物浓度的监测系统的监测方法，其特征在于：包括以下步骤：测算监测系统的光源波长，并利用光源波长选取led光源；基于led光源组成所述监测系统，并将监测通路中led光源、透镜、光电转换模块均置于待测溶液中进行光电转换，获取数字电流信号利用朗伯比尔定律换算为待测溶液中的系统光密度od
sys
；构建所述微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型，分别将系统光密度od
sys
进行线性校准和非线性校准为微生物浓度od
600nm
。6.根据权利要求5所述的一种监测方法，其特征在于：所述测算监测系统的光源波长，包括：利用紫外分光光度计对不同浓度的各微生物培养溶液在350～1100nm范围内扫描吸收光谱，其中400～780nm为可见光波段，780～1100nm属于近红外波段，微生物包括酵母菌，芽孢杆菌，节杆菌和大肠杆菌；分析扫描后的全光谱图，并在全光谱图中标记出各微生物培养溶液的吸光度与浓度成正相关的波段区间作为光源波长选取区间；将各微生物在光源照射下的吸光均衡性、透射性、稳定性和lb培养溶液的颜色影响性作为光源波长的评价指标，利用梯度变化方式在光源波长选取区间中选取多个光线波长，并将多个光线波长利用评价指标进行评价得到多组评价指标数据；利用bp神经网络对所述光线波长和各微生物对应的评价指标数据进行网络训练得到表征光线波长和评价指标映射关系的各微生物的光源波长评价模型，所述各微生物的光源波长评价指标的模型表达式为：[a,b,c,d]
x
＝bp
x
(l)；式中，x∈[酵母菌；芽孢杆菌；节杆菌；大肠杆菌]，a,b,c,d分别为吸光均衡性，透射性，稳定性，lb培养溶液的颜色影响性，l为光线波长，bp为bp神经网络；将光源波长选取区间中所有的光线波长均输入至各微生物的光源波长评价模型中得到各微生物在光源波长选取区间中所有的光线波长处的评价指标数据；将各微生物对应的评价指标数据在同一光线波长处进行均值化处理，将均值处理后最优的评价指标数据对应的光线波长作为所述光源波长。7.根据权利要求6所述的一种监测方法，其特征在于，所述系统光密度odsys的计算方法包括：基于朗伯比尔定律中所述透射光强随微生物浓度增加按指数衰减关系以及光电转换模块输出电流的数字信号与所述透射光强的正比关系，得到光电转换模块输出电流的数字
信号的对数与微生物浓度的线性关系，所述光电转换模块输出电流的数字信号的对数与微生物浓度的线性关系为：式中，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，j为系统测量电路参数，i
out
为透射光强；g为测量仪器的几何参数，i
in
为入射光强，k为微生物吸收系数，l为光程长度，单位cm；t为微生物浓度，单位mol
·
l-1
；基于光密度计算公式中表征的透光率为透射光强与入射光强之比，得到系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系，所述系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系为：式中，od
sys
为系统光密度，t为透光率，c为常数项，s
in
为光电转换模块输入电流的数字信号。8.根据权利要求7所述的一种监测方法，其特征在于，所述微生物浓度线性校准模型的构建包括：基于系统光密度od
sys
与微生物浓度的线性关系分析出标准微生物浓度可由校正因子δ对不同波长的系统光密度换算得到，所述标准微生物浓度的系统光密度换算公式为：式中，od
600nm
为标准微生物浓度，δ为校正因子，s
out
光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输出电流的数字信号；基于标准微生物浓度的系统光密度换算公式得出数字电流信号与微生物浓度为近似线性关系，根据近似线性关系将偏最小二乘法模型引入标准微生物浓度的系统光密度换算公式进行线性拟合得到所述微生物浓度线性校准模型；所述微生物浓度线性校准模型的模型表达式为：式中，od
600nm
为标准微生物浓度，a为线性拟合系数，d为常数项，s
out
光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输出电流的数字信号。9.根据权利要求8所述的一种监测方法，其特征在于，所述微生物浓度非线性校准模型的构建包括：根据近似线性关系将四阶多项式模型引入标准微生物浓度的系统光密度换算公式进行线性拟合得到所述微生物浓度非线性校准模型；所述微生物浓度非线性校准模型的模型表达式为：
式中，od
600nm
为标准微生物浓度，b1、b2、b3和b4分别为四阶多项式的拟合系数，e为常数项，s
out
为光电转换模块输出电流的数字信号，s
in
为光电转换模块输出电流的数字信号。10.根据权利要求5所述的一种监测方法，其特征在于，所述微生物浓度线性校准模型和微生物浓度非线性校准模型中的od
600nm
均由紫外分光光度计在微生物待测溶液中进行实测得到。

技术总结
本发明公开了一种微生物浓度的监测系统及方法，包括光源驱动模块、光电转换模块、无线传输模块、A/D模数转换模块、MCU芯片、上位机、LED光源、光源波长测算模块，所述LED光源、透镜、待测溶液、光电转换模块构成利用光电转换监测微生物浓度的监测通路，所述待测溶液为用于监测微生物浓度的微生物培养溶液。本发明构建的监测系统将传统以光吸收为定量指标转换为光散射，采用最优波长的LED光源作为光源测定系统光密度OD


技术研发人员：季呈明 徐焕良 翟肇裕 余洪锋
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/8/22