多肽SK56及其在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用的制作方法

多肽sk56及其在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及多肽sk56及其在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.细胞焦亡(pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡发生时会导致炎症因子的大量释放，继而导致机体对炎症反应失调而引起生理学和器官功能的损害。
3.邵峰团队通过crispr-cas9技术进行了全基因组筛选发现了gsdmd，该基因与细胞焦亡密切相关，若存在则发生细胞焦亡，否则不发生。细胞焦亡的终端效应分子是gsdmd被切割后的n端蛋白，记为gsdmd-n。研究发现gsdmd-n会转移并锚定至细胞膜上，形成炎症因子释放通道，破坏细胞内外渗透压，释放白介素1β等炎症因子，进而完成细胞焦亡过程，引发炎症因子风暴。因此阻断gsdmd-n与细胞膜结合形成炎症因子释放通道，抑制炎症因子的释放，能有效减轻炎症因子的负面危害，帮助炎症反应恢复平衡。
4.但目前并没有关于阻断gsdmd-n通道释放炎症因子的功能进而治疗炎症失调相关疾病的有效药物。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供多肽sk56及其在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用，多肽sk56能够阻断gsdmd-n通道释放炎症因子的功能进而治疗炎症失调相关疾病。
6.本发明提供了多肽sk56，包括如(1)～(3)中一项或几项所述多肽：
7.(1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽；
8.(2)在(1)限定的多肽的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸或者一个或几个氨基酸残基经化学修饰或者成环后且与(1)限定的多肽具有相同功能的多肽；
9.(3)项(1)和/或项(2)中所述多肽的盐形式。
10.本发明还提供了一种预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物，包括上述方案所述的多肽sk56和药学上可接受的辅料或载体。
11.优选的，所述辅料包括盐；所述盐包括多肽与有机酸形成的盐；所述有机酸包括酒石酸、苯磺酸、甲酸、甘油磷酸、乙酸、乙二酸、樟脑酸、丁酸、果胶酯酸、马来酸、环戊烷丙酸、琥珀酸、烟酸、己二酸、藻酸、柠檬酸、天冬氨酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、2-萘磺酸、庚酸、新戊酸己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、3-苯基丙酸、丙酸、乳酸、甲磺酸、扑酸、对-甲苯磺酸和十一烷酸中的一种或多种。
12.优选的，所述辅料包括赋形剂；所述赋形剂包括甘露醇、乳糖、蔗糖和果糖中的一种或几种。
13.优选的，所述药物的剂型包括注射剂。
14.优选的，所述药物中多肽sk56的质量百分含量为5％～99％。
15.本发明还提供了上述方案所述sk56在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用。
16.优选的，所述炎症失调相关疾病包括脓毒症。
17.本发明还提供了上述方案所述sk56在制备抗细胞焦亡和/或抑制炎症因子释放的药物中的应用。
18.本发明还提供了上述方案所述sk56在制备与炎症因子释放通道结合并阻断通道释放炎症因子功能的药物中的应用；所述炎症因子释放通道由gsdmd-n与细胞膜结合形成。
19.本发明提供了多肽sk56，包括如(1)～(3)中一项或几项所述多肽：(1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽；(2)在(1)限定的多肽的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸或者一个或几个氨基酸残基经化学修饰或者成环后且与(1)限定的多肽具有相同功能的多肽；(3)项(1)和/或项(2)中所述多肽的盐形式。本发明的多肽sk56能与gsdmd-n与细胞膜结合形成的通道孔区进行结合并抑制通道释放炎症因子的功能来抗细胞焦亡和炎症因子失调。试验结果表明，多肽sk56能有效抑制炎症因子的释放，进而抑制细胞发生焦亡；且试验中发现多肽sk56对细胞基本无毒。多肽sk56可作为制备抑制gsdmd-n通道功能的抑制剂药物，用于抗细胞焦亡，抑制炎症因子释放，可用于脓毒症或其它炎症因子风暴相关疾病治疗或预防的药物制备。
附图说明
20.图1为本发明提供的筛选多肽sk56与gsdmd-n通道结合的图片；其中，a：筛选的工作流程；b：展示了筛选的结合位点(图1中b的顶部图片，箭头指出)；底部图片展示了多肽sk56与gsdmd-n通道的结合示意图，以及多肽sk56的序列信息；
21.图2为本发明提供的多肽sk56能在体外与gsdmd-n通道结合并有抑制炎症因子白介素1β释放和细胞焦亡的活性图；其中，a：酶联免疫吸附结果显示；b：显微镜观察细胞发生焦亡的情况；c：表面等离子共振实验测定多肽sk56与gsdmd-n通道的结合常数；
22.图3为本发明提供的多肽sk56减轻脓毒症小鼠死亡率的图片。
具体实施方式
23.本发明提供了多肽sk56，包括如(1)～(3)中一项或几项所述多肽：
24.(1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽；
25.(2)在(1)限定的多肽的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸或者一个或几个氨基酸残基经化学修饰或者成环后且与(1)限定的多肽具有相同功能的多肽；
26.(3)项(1)和/或项(2)中所述多肽的盐形式。
27.在本发明中，seq id no.1所示氨基酸序列具体为：
28.sleefakrvveelvkefnldkrqesylemsaliqaqmgiseriieivlr haaqtlk。
29.本发明利用计算机人工智能和虚拟筛选方法从自建多肽库中筛选出能与gsdmd-n形成的通道结合且能抑制炎症因子释放的多肽。结合体外分子实验和活性验证等方法，最终筛选出具有抑制gsdmd-n通道功能的多肽sk56。
30.本发明还提供了一种预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物，包括上述方案所述的多肽sk56和药学上可接受的辅料或载体。
31.在本发明中，所述药学上可接受的辅料或载体优选为药学上可接受的、且对人和动物无毒的药用辅料或载体。
32.在本发明中，所述辅料优选的包括盐；所述盐优选的包括多肽与有机酸形成的盐；所述有机酸包括酒石酸、苯磺酸、甲酸、甘油磷酸、乙酸、乙二酸、樟脑酸、丁酸、果胶酯酸、马来酸、环戊烷丙酸、琥珀酸、烟酸、己二酸、藻酸、柠檬酸、天冬氨酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、2-萘磺酸、庚酸、新戊酸己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、3-苯基丙酸、丙酸、乳酸、甲磺酸、扑酸、对-甲苯磺酸和十一烷酸中的一种或多种。本发明对上述有机酸的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的上述有机酸的常规市售产品即可。
33.在本发明中，所述辅料优选的包括赋形剂；所述赋形剂优选的包括甘露醇、乳糖、蔗糖和果糖中的一种或几种。本发明对所述赋形剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的上述赋形剂的常规市售产品即可。
34.在本发明中，所述药物的剂型优选的包括注射剂。
35.在本发明中，所述药物中多肽sk56的质量百分含量优选为5％～99％，进一步优选为10％～80％，更优选为20％～60％，最优选为30％～50％。
36.本发明还提供了上述方案所述sk56在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用。
37.在本发明中，所述炎症失调相关疾病包括脓毒症。
38.在本发明中，所述预防和/或治疗炎症失调相关疾病优选的通过多肽sk56与炎症因子释放通道结合并阻断通道的炎症因子释放功能实现；所述炎症因子释放通道由gsdmd-n与细胞膜结合形成。
39.本发明还提供了上述方案所述sk56在制备抗细胞焦亡和/或抑制炎症因子释放的药物中的应用。
40.在本发明中，所述抗细胞焦亡和/或抑制炎症因子释放优选的通过多肽sk56与炎症因子释放通道结合并阻断通道的炎症因子释放功能实现；所述炎症因子释放通道由gsdmd-n与细胞膜结合形成。
41.本发明还提供了上述方案所述sk56在制备与炎症因子释放通道结合并阻断通道释放炎症因子功能的药物中的应用；所述炎症因子释放通道由gsdmd-n与细胞膜结合形成。
42.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
43.实施例1药物虚拟筛选
44.根据公开的gsdmd-n通道蛋白结构构建三维模型，并使用分子动力学模拟对gsdmd-n通道三维结构进行优化，随后选取gsdmd-n通道朝向孔心的区域进行配体多肽的筛选，以寻找能够干扰其结合的药物。筛选使用的数据库为自建多肽库包含获临床批文的多肽类药物、天然存在的多肽、已有结构的蛋白按结构拆分后的多肽片段以及人工智能生成
的全新多肽。对于筛选得到的排名靠前(top12)的候选多肽直接进行原核表达纯化，随后利用体外实验方法对候选药物活性进行进一步筛选，得到活性多肽sk56(见图1，图1为筛选gsdmd-n通道功能抑制多肽的图片，其中，a：筛选的工作流程；筛选后，对每一个高分候选多肽进行体外实验验证，以确保候选多肽与gsdmd-n通道结合的同时具有抑制细胞焦亡的活性；b：展示了筛选的结合位点(图1中b的顶部图片，箭头指出)；底部图片展示了多肽sk56与gsdmd-n通道的结合示意图，以及多肽sk56的序列信息)。
45.实施例2
46.图2为多肽sk56能在体外与gsdmd-n通道结合并有抑制细胞焦亡的活性图。其中，a：酶联免疫吸附结果显示，相较于其他候选多肽，多肽sk56具有最高的抑制il-1β释放活性；b：显微镜直接观察细胞可以观察到在相同处理时间(3h)内，多肽sk56处理的细胞没有发生焦亡；c：表面等离子共振实验测定多肽sk56与gsdmd-n通道的结合常数约为3.39e-9摩尔。
47.细胞焦亡实验。首先将thp-1细胞系与200ng/ml pma(佛波酯)，24h贴壁后更换培养基。第二天加入1μg/ml的lps(脂多糖)和10μm的nigericin，处理组加入多肽sk56约15μm，随后每10分子进行一次显微镜拍照观察，以确定多肽sk56抑制细胞焦亡的情况。结果显示，相较于对照组，多肽sk56具有显著抑制细胞焦亡的活性，处理6h后还未见明显细胞焦亡发生。(见图2中的a)。
48.实施例3
49.酶联免疫吸附测定。实验使用的溶液配方如下，包被液：ph 9.6的0.05m碳酸盐缓冲液；碳酸钠1.59g+碳酸氢钠2.93g，溶解至1l去离子水里。洗涤液：细胞用磷酸盐缓冲液(pbs)+0.1％的tween-20。注：细胞用pbs：氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8g，7水磷酸二氢钠2.16g，去离子水1l。封闭液(抗体稀释液)：洗涤液每100ml+牛血清白蛋白(bsa)1g。显色液：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)单组份显色液。终止液：2mol/l的硫酸，178.3ml水+21.7ml浓硫酸，慢慢搅拌混匀。
50.具体步骤如下，首先在包被了白介素1β的测试孔板中，加入实施例2中处理的细胞上清液，室温孵育0.5h，洗涤三次后加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗(按说明书进行稀释),每孔100μl，37℃孵育1h。洗涤三次后，每孔加入100μl显色液，37℃避光孵育20min，随后加入100μl终止液，并使用酶标仪测定450/630nm双波长读数。
51.结果显示多肽sk56也能够显著抑制炎症因子白介素1β的释放。(见图2中的b)。
52.实施例4表面等离子共振实验
53.该实验使用fortebio octet仪器完成，缓冲液为磷酸盐缓冲液，ph7.4。仪器操作步骤按照说明书进行，首先载入光纤，随后使用n-羟基琥珀酰亚胺(eds/nhs)将光纤上的基团活化，通过这个官能团反应将多肽sk56交联到光纤上，完成固定。再使用1m乙醇胺盐酸盐(ph8.5)封闭光纤上多余的有活性的羧基。随后使用多通道进行检测，加入不同浓度的待测gsdmd-n蛋白和提取的细胞膜计算结合常数。
54.结果显示，多肽sk56与gsdmd-n的结合常数约为3.39e-9摩尔。(见图2中的c)。
55.实施例5
56.脓毒症小鼠死亡率实验。将每组10只雌雄各半、5周龄的c57品系小鼠腹腔注射15mg/kg的lps诱发脓毒症，待20h后或注射lps前半小时，药物处理组尾静脉注射20mg/kg多
肽sk56。观察小鼠的生存情况，lps会导致小鼠发生严重的炎症反应，导致小鼠死亡，而有多肽sk56的加入会抑制焦亡的发生和炎症因子的释放，保护小鼠。加入多肽后小鼠存活越多，说明药物效果越好。
57.实验结果显示多肽sk56处理的小鼠死亡率明显降低，起到保护作用。结果见图3，图3为多肽sk56减轻脓毒症小鼠死亡率的图片。给予多肽sk56的处理组最终的存活率明显提升，多肽sk56起到保护作用。
58.本发明基于靶点结构设计全新多肽的策略，利用计算机人工智能和虚拟筛选方法筛选自有多肽库中与gsdmd-n通道结合的抑制剂，结合体外分子实验和活性验证等方法。结合后期验证实验，大大增加了筛选结果的可靠性。本发明提供了全新的通过抑制gsdmd-n通道功能的细胞焦亡和炎症反应失调相关疾病的治疗和预防分子——多肽k56。
59.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.多肽sk56，其特征在于，包括如(1)～(3)中一项或几项所述多肽：(1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽；(2)在(1)限定的多肽的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸或者一个或几个氨基酸残基经化学修饰或者成环后且与(1)限定的多肽具有相同功能的多肽；(3)项(1)和/或项(2)中所述多肽的盐形式。2.一种预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽sk56和药学上可接受的辅料或载体。3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述辅料包括盐；所述盐包括多肽与有机酸形成的盐；所述有机酸包括酒石酸、苯磺酸、甲酸、甘油磷酸、乙酸、乙二酸、樟脑酸、丁酸、果胶酯酸、马来酸、环戊烷丙酸、琥珀酸、烟酸、己二酸、藻酸、柠檬酸、天冬氨酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、2-萘磺酸、庚酸、新戊酸己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、3-苯基丙酸、丙酸、乳酸、甲磺酸、扑酸、对-甲苯磺酸和十一烷酸中的一种或多种。4.根据权利要求2或3所述的药物，其特征在于，所述辅料包括赋形剂；所述赋形剂包括甘露醇、乳糖、蔗糖和果糖中的一种或几种。5.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂。6.根据权利要求2或5所述的药物，其特征在于，所述药物中多肽sk56的质量百分含量为5％～99％。7.权利要求1所述sk56在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述炎症失调相关疾病包括脓毒症。9.权利要求1所述sk56在制备抗细胞焦亡和/或抑制炎症因子释放的药物中的应用。10.权利要求1所述sk56在制备与炎症因子释放通道结合并阻断通道释放炎症因子功能的药物中的应用；所述炎症因子释放通道由gsdmd-n与细胞膜结合形成。

技术总结
本发明提供了多肽SK56及其在制备预防和/或治疗炎症失调相关疾病的药物中的应用，属于生物医药技术领域。在本发明中，所述多肽SK56的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的多肽SK56能与GSDMD-N形成的通道孔区结合并抑制通道释放炎症因子的功能来抗细胞焦亡和炎症因子失调。试验结果表明，多肽SK56能有效抑制炎症因子的释放，进而抑制细胞发生焦亡；且试验中发现多肽SK56对细胞基本无毒。多肽SK56可作为制备抑制GSDMD-N通道功能的抑制剂药物，用于抗细胞焦亡，抑制炎症因子释放，可用于脓毒症或其它炎症因子风暴相关疾病治疗或预防的药物制备。的药物制备。的药物制备。


技术研发人员：孟平 王淦 杨俊
受保护的技术使用者：昆明市延安医院
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/8/22