一组检测KRAS基因多位点突变的引物探针和试剂盒的制作方法

一组检测kras基因多位点突变的引物探针和试剂盒
技术领域
1.本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一组检测kras基因多位点突变的引物探针和试剂盒。


背景技术：

2.近些年，结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。结直肠癌的治疗一直是国内外学者研究的热点。随着靶向治疗药物表皮生长因子受体(egfr)抑制剂西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的问世，结直肠癌的治疗进入了靶向治疗时代。ras家族是包括结直肠癌在内的所有人类恶性肿瘤中最常见的突变之一。在正常细胞中，ras蛋白可在胞内信号传递的过程中起着连接的作用，它能够将生长因子和细胞膜受体结合，从而调控细胞的生存。目前建议只有ra s基因野生型的结直肠癌患者才能从抗表皮生长因子(egfr)受体单克隆抗体的临床治疗中获益。因此，在结直肠癌患者中进行ras基因突变的检测，特别是kras和nras的检测具有重要的临床意义，其中以kras突变的频率最高。
3.kras基因在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，是细胞内信号传导途径“下游区”的一种信号传导蛋白，对细胞的生长存活和分化等功能具有重要的影响。正常的kras基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。kras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原发灶和转移灶的kra s基因高度保持一致，并且kras基因状态不会因治疗而发生变化。因此检测kras基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。
4.多个大样本、多中心ⅲ期临床研究结果提示，kras基因2、3、4外显子突变状态与阻断egfr的单克隆抗体——西妥昔单抗、帕尼单抗的疗效明确相关，kras野生型的患者可以从西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗中获得最大化的生存效益。有文献报道，在结直肠癌患者中约30％～55％伴有kras基因突变，而且突变主要位于kras基因第2号外显子的第12和13位密码子，其中第12号密码子位置突变占到80％以上。2013年欧洲癌症大会上公布的fire-3最新数据显示，在既往仅检测kras基因突变热点第2号外显子的基础上，进一步检测了kras基因第3和4号外显子突变，发现了16％的患者带有kras第2号外显子以外的突变，其中kras基因第3和4号外显子的突变率约为11％。早在2009年，美国临床肿瘤学会(asco)即建议对于转移性结直肠癌患者，在选择抗egfr的单抗药物(西妥昔单抗或帕尼单抗)治疗前应检测kras基因状态。2021版《结肠癌临床实践指南》中也明确指出，具有任何kras基因2、3、4外显子突变的患者，不应使用西妥昔单抗或帕尼单抗。
5.kras基因在肺癌检测中也非常重要，突变比例约占非小细胞肺癌(nsclc)的20-30％，肺腺癌较高，肺鳞癌中比较罕见。在中国肺癌患者中kras g12c突变率约为2.8％-5％。kras位于egfr信号通路的下游，肺癌中的kras突变与egfr和alk易位互不相容，众多研究显示，kras基因突变是影响tki类靶向药物疗效的不利因素。kras基因突变对egfr tki类药物敏感性降低，临床疗效很差。数十年来的靶向药物研发均以失败告终，kras已成为肿瘤
药研发领域"不可成药"靶标的代名词。但是近年来，一款高选择性sorasasib(amg510)问世，打破了kras“无药可用”的困境。主要用于kras g12c突变的nsclc晚期肺癌患者，它是首个获批也是目前唯一一个针对kras g12c突变的局部晚期或转移性nsclc患者的靶向药物，因此，及时检测患者肿瘤kras突变状态及突变类型，对于医生判断患者肿瘤特点，制定精准的个性化临床管理与治疗方案至关重要，kras突变基因的检测已成为诊疗中不可或缺的常规辅助分子诊断。
6.目前有关基因突变检测的方法很多，比较常用的有直接测序法和荧光定量pcr法。直接测序法也是目前应用最多的方法，但由于其操作繁琐，成本高，检测周期较长，技术要求高和灵敏度低等问题，很难满足血浆等核酸丰度低的样本及甲醛固定石蜡包埋处理后dna片段化标本的检测需求，从而导致目前越来越少的单位使用该方法应用于临床检测。
7.荧光pcr技术，灵敏度一般只能达到0.5-1％，对血浆样本的检测存在灵敏度不够的缺陷，无法精准指导临床靶向用药；操作虽然相对简单但成本高，需要多孔检测，耗费珍贵样本；结果判读需要采用
△
ct形式消除背景干扰，阴性容易抬头，干扰判读，造成假阳性；另外多重荧光pcr方法最主要的缺陷是只能检测少数几种突变，增加突变类型将导致非特异性增加，检测效果难以保证，部分突变形式无法囊括，将导致部分突变漏检，影响肺癌患者靶向用药。
8.目前很多患者无法顺利采集到肿瘤组织，只能用血浆检测，而现有的主流方法均存在灵敏度不足的缺陷，将无法有效的指导临床进行靶向用药。因此，从这些低含量样本中检测突变基因，需要寻找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法。
9.微滴式数字pcr方法学是通过单分子的扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来从而增加检测灵敏度，可用于疾病或病毒的早期诊断和疗效监控。数字pcr技术在单分子扩增后对样品dna精准定量，具有比其他pcr更高的测量精度。因此数字pcr已成为检测稀有基因突变的超灵敏方法，不过，目前市场主流的双通道微滴式数字pcr方法同时检测的突变区域有限，多孔检测则需要较多的肿瘤样本，这在临床组织取样上往往较难实现，这限制了其在液体活检中的应用。
10.本发明采用基于芯片的多通道液滴式数字pcr平台，具有高灵敏度优势，可以更好地满足现临床对kras 3个外显子多重多位点突变同时检测的需求；具有灵敏性高、特异性强、操作简便快速、结果判定简单的优势，单孔五通道检测，实现14种突变同时超敏检测，这大大降低了临床检测成本和珍贵肿瘤组织或血液样本的消耗。本发明能更好地指导临床肺癌或结直肠癌的精准靶向用药，降低患者负担，适宜临床大规模应用推广。


技术实现要素：

11.本发明要解决的技术问题是，提供一种操作简便、结果准确、成本低廉和高通量的kras基因多位点突变的检测试剂盒，满足临床kras基因的诊疗需求。
12.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
13.一组检测kras基因多位点突变的核酸序列，包括如下引物对及探针，其核苷酸序列如seq id no：001～023所示，且核酸序列在一次1孔检测中使用：
[0014][0015][0016]
以上表格中，部分引物碱基前面的“+”号表示该碱基用锁核酸lna代替普通的核苷酸；seq id no：3～9分别为检测kras-2外显子g12a、g12d、g12v、g12r、g12s、g13c、g13d突变型探针，序列的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；seq id no：12～16分别为检测kras-3外显子q61r、q61h1、q61h2、q61l、q61k突变型探针，序列的5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；seq id no：19为检测kras-4外显子a146t突变型探针,序列的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团；seq id no：20为检测kras-2外显子g12c突变型探针,序列的5’端标记a425荧光基团，3’端标记bhq淬灭基团；seq id no：23为检测fech单拷贝参考基因探针，序列的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq淬灭基团；
[0017]
本发明还公开第二种技术方案：一组检测kras基因多位点突变的试剂盒，包括如下试剂：
[0018]
(1)pcr反应液：包括dna聚合酶、mg
2+
、pcr反应缓冲液、datp、dctp、dttp和dgtp；
[0019]
(2)引物探针预混合液：反应管所示的核苷酸序列的混合液，每条引物浓度为100um，探针的浓度为100um，配置10*mix预混液；
[0020]
(3)阳性对照：包含kras基因3个外显子4种突变型的质粒与正常基因组dna(gdna)的混合溶液；
[0021]
(4)阴性对照：包含正常gdna的溶液。
[0022]
作为优选，所述阳性对照中，kras基因3个外显子4种突变型的质粒拷贝数大于500拷贝/μl，内参基因拷贝数大于1000拷贝/μl。
[0023]
作为又一优选，所述阴性对照中，内参基因拷贝数大于1000拷贝/μl。
[0024]
本发明还公开第三种技术方案：一种检测kras基因多位点突变的引物探针和试剂
盒在检测kras基因多位点突变中的应用，包括以下步骤，
[0025]
(1s)抽提血浆中的游离dna或组织dna；
[0026]
(2s)用本发明所述试剂盒进行kras基因多重pcr检测，检测5个通道，同时检测kras基因3个外显子多位点突变，覆盖97％以上的变异发生率；
[0027]
(3s)将扩增完毕的pcr板放入读取仪，对每一扩增完的样本进行荧光分析，在阴阳性对照结果正常的前提下，分别计算样本反应孔中kras基因突变的拷贝数与内参基因拷贝数，最终得出样本中kras突变基因的准确状态。
[0028]
作为优选，扩增体系如下：
[0029][0030]
pcr扩增条件如下：
[0031][0032]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0033]
(1)目前市场上检测kras基因突变的试剂盒有三类：荧光定量pcr试剂盒，其特异性强，灵敏度高，速度快，全封闭反应等优点已成为分子生物学研究中的重要工具，常用于检测最常见的kras12、13位密码子的突变或kras 3、4外显子突变。但是目前荧光探针价格比较昂贵，且一对探针只能对应检测一种突变类型，通用性不强，如果同时检测3个外显子突变，需要同时检测5-10孔，浪费珍贵肿瘤样本的同时大大增加成本。而ngs试剂盒覆盖所有突变类型，但突变检测灵敏度均在1％以上，且成本高，操作步骤多，易交叉污染；本发明参考全球最全面的公开肿瘤突变数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)和最新文献，覆盖各热点位点97％以上的突变发生率；通过每一种突变设计多种不同位置替换lna修饰核苷酸，并进行一系列单孔多重检测的优化组合，筛选出互不干扰，特异性强、灵敏度高的引物探针组合，能够实现1孔检测，覆盖97％以上的突变发生率，灵敏度提升至0.01％，特异性强，适宜各种样本类型，尤其是低丰度突变的血浆样本；本发明成功实现1孔多重检测，样本需求少，低成本，高通量，操作和分析简单快速，结果准确，大大增加了kras基因突变的检出率，性能比现有的试剂有明显的改进，用于临床样本检测可获得更精准的检测结果，效果突出，可以更好的提供预测分子靶向药物的治疗效果，为临床医生提供更准确的临床指导。
[0034]
(2)本发明针对kras-g12c单独设计一个通道检测，在kras常见的突变中，g12c突变占所有kras突变的12％，g12c突变比较特殊：在第12号氨基酸的位置，原来的甘氨酸
(gly)变成了cys，这是一个半胱氨酸残基。在药物设计中，有一种不可逆抑制剂，可以与靶点分子上半胱氨酸上的巯基(-sh)形成共价键，让抑制剂紧紧地吸附在靶点分子上。此特点相当于为药物分子提供一个锚点，可被用于设计具有前期临床活性的共价抑制剂。近年来，kras g12c靶向药物的开发显示出了良好的临床应用前景。sorasasib(amg510)是近期新获批的用于kras g12c突变的nsclc晚期肺癌患者的靶向用药，它是首个获批也是目前唯一一个针对kras g12c突变的局部晚期或转移性nsclc患者的靶向药物，具有里程碑意义，该位点的超敏检测能为部分晚期肺癌患者带来更好的临床获益。
[0035]
(3)本发明采用一种基于芯片的五通道液滴式数字pcr检测系统，将每一样本的15μl反应液通过微滴生成仪分成25000～35000个独立的微滴，并用板式扩增仪对平铺微滴的芯片进行扩增；扩增完成后用微滴芯片阅读仪对微滴芯片进行高分辨率拍照扫描和计数，对浓度较低的样本，每个微滴中包含的kras基因拷贝数为1或0，通过专用软件自动检测每个微滴的荧光信号，再计数总的阳性微滴数，通过泊松分布计算就能得到准确的kras基因拷贝数。浓度较高的样本只需进行一定比例的稀释，也能得到准确的结果，从而有效指导临床靶向用药。
[0036]
(4)现有ngs技术平台和pcr技术平台，均有灵敏度低、通量小、无法准确定量突变丰度等缺陷，本发明采用具有超高灵敏度的数字pcr技术，根据不同突变类型检测效果不同，调整优化不同突变类型特异性引物的序列和浓度，使所有突变类型检测的灵敏度一致，且保证了良好的特异性；5通道同时检测且不影响结果准确性，突变型和野生型检测在同一孔中进行，即有效减少试剂和珍贵的微量肿瘤样本消耗，又最大程度降低了成本，对kras常见的14种突变实现一次性单孔检测，且保持高灵敏度，能有效提高检出率，避免了漏检，为精准靶向药物的使用提供更可靠依据，临床指导效果突出。
[0037]
(5)目前临床常用于检测kras突变的超敏技术平台是基于美国伯乐公司qx200数字pcr检测系统，该平台主要是单一位点的检测体系。该数字pcr系统为国外进口，仪器和配套试剂耗材价格昂贵，货期和价格长期受制于国外公司，无自主知识产权，供货周期长且不稳定，不适宜临床大规模应用和推广；而且该仪器迄今尚未在我国获批医疗器械注册证，仪器性能未经官方认证和认可，因此目前尚无法在临床合规使用；并且，该检测系统只提供2个荧光通道，除去内参通道，只剩1个通道可用于检测单个位点突变，检测通量低，单位点成本非常高；而本发明基于国内厂家自主研发创新5色荧光通道的多重数字pcr体系，拥有从微滴生成仪、芯片扩增仪、芯片阅读仪、通用试剂芯片等耗材的全套自主知识产权及技术，且价格只有国外类似产品的1/3以下，结合多位点多通道检测，可降低模板用量至1/5，可降低单位点成本至国外产品的1/10；仪器和通用试剂耗材均已获批医疗器械注册证，性能达到进口主流产品。
[0038]
(6)从各位点单一检测的进口数字pcr系统及基于流式荧光检测的微滴检测系统转换至国产多通道微滴芯片式数字pcr系统及基于拍照扫描的微滴阅读系统，因国产基于拍照扫描的微滴阅读系统荧光本底相对较高，阴阳性荧光对比度较基于流式荧光检测的进口检测系统低，因此对引物探针的扩增效率有更高的要求，需要考虑到相对染色体位置，避免互相干扰，优化组合；各荧光通道本底荧光和最终荧光强度的不同影响位点检测对比度和区分度，选择荧光通道非常关键。本发明通过大量的优化设计和研究，不断测试比对各位点引物探针在不同荧光通道的表现，部分位点经过多次优化已满足特定荧光通道要求，筛
选出满足各位点阴阳性对比度的最优荧光通道；重新优化引物探针和扩增反应试剂等反应体系及退火温度、时间等扩增条件，最终优化至同一孔内各位点反应条件统一，均能实现高效、等效扩增，有效避免了竞争性抑制和偏向扩增导致的位点突变丰度失真；重新更新检索突变数据库，去掉了一些近年统计的发生率低的突变种类，保证突变检出覆盖率不下降；修改了部分引物探针序列及荧光标记以提高检测效果，提高阴阳性对比度，从而保证了本发明5重检测体系的灵敏度和特异性表现突出，能有效满足临床需求。
[0039]
(7)目前临床上检测kras基因突变多采用mgb探针，但是在检测位点突变时，由于突变型与野生型通常只存在1个碱基的差异，mgb探针的野生型和突变型往往tm值差异较小，很容易产生非特异性扩增，无法有效区分，多重检测则更加难以实现；尤其是在存在大量野生型模板的稀少突变时，引物探针效果直接关系到检测的特异性，优化设计至关重要。本发明对位点检测引物探针进行优化改进，部分采用lna修饰核苷酸，其突出特点在于探针设计更短，特异性更强，即使一个碱基错配，也能有效增加野生型和突变型探针的tm值差异，从而大大提高数字pcr检测的特异性和灵敏度；同时，采用5通道超敏数字pcr检测体系，该系统可实现绝对定量，准确获得突变型拷贝数，可用于靶向药物疗效监测和后续复发监控，精准指导临床靶向用药。
[0040]
(8)本发明所述的试剂盒采用基于芯片的多通道液滴式的数字pcr检测系统，配置简单，整个流程自动化程度高，可重复检测，操作非常简便易上手，灵敏度高，特异性强，结果分析直观易懂；单孔超敏定量检测14种靶向用药相关突变，节省样本和试剂，成本低廉，适宜临床大规模应用及推广。
附图说明
[0041]
图1为本发明实施例5中理论浓度突变率和检测突变率的2d图：以理论浓度为横坐标，以实际结果为纵坐标，绘制线性曲线；
[0042]
图2为阳性对照品和阴性对照品检测结果2d图：纵坐标分别是a425、fam、vic、rox信道，检测目标基因拷贝数，阳性对照品均有阳性微滴，阴性对照品无阳性微滴；横坐标为cy5信道，检测内参基因拷贝数，计算机自动换算成拷贝浓度，结果阳性对照品突变比例均在5％左右；
[0043]
图3为1例患者检测结果图：反应管纵坐标分别是a425、fam、vic、rox信道，检测目标基因拷贝数，a425信道有阳性微滴；横坐标为cy5信道，检测内参基因拷贝数，计算机自动换算成拷贝浓度，结果kras g12c突变拷贝数2.81，内参拷贝数247.05，突变比例1.14％
具体实施方式
[0044]
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明。
[0045]
实施例1：检测kras基因多位点突变的引物和探针由上海百力格生物技术有限公司合成，序列如下：
[0046][0047]
实施例2：kras基因检测突变类型如下：
[0048][0049]
实施例3：kras基因多位点突变检测试剂盒的制备方法。
[0050]
(1)pcr反应液：2*mix(购于领航基因，货号：c010301)，为2*pcr反应预混液，其中含有dna聚合酶、mg
2+
、pcr反应缓冲液、datp、dctp、dttp和dgtp等组分，-20℃保存；
[0051]
(2)数字pcr微滴式芯片、微滴生成油(领航基因，货号：c010401)。
[0052]
(3)引物探针预混合液：反应管所示的核苷酸序列的混合液，每条引物浓度为100um，探针的浓度为100um，配置10*mix预混液-20℃保存；
[0053]
(4)阳性对照：包含kras基因3个外显子4种突变型的质粒与正常基因组dna(gdna)的混合溶液，2～8℃保存；
[0054]
(5)阴性对照：包含正常gdna的溶液，2～8℃保存；
[0055]
实施例4：检测方法。
[0056]
仪器：领航基因芯片定性pcr仪，领航基因微滴生成仪，领航基因芯片阅读仪，beckman22r台式微量冷冻离心机，wh-866型涡旋振荡器(太仓华利达)，低速板式离心机(安徽中佳)。
[0057]
1.kras基因多位点突变检测样本、阳性对照、阴性对照dna模板的制备：采用qiagen公司qiaamp circulating nucleic acid kit(货号55114)或qiaamp dna ffpe tissue kit(货号56404)，按照试剂盒说明书操作。
[0058]
2.利用多重pcr进行kras基因多位点突变基因检测，具体包括如下步骤；
[0059]
(1)pcr反应液配制：从-20℃冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置pcr反应液xμl/孔：x＝(7.5μl pcr反应液+1.5μl引物探针预混合液)
×
(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
[0060]
振荡混匀后，10000rpm瞬时离心10s，按每人份9μl分装到pcr八联管中，传至样本制备区备用。
[0061]
(2)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入kras基因多位点突变检测样本、阳性对照、阴性对照dna模板6μl(若模板保存在-20℃，使用前置室温解冻，10000rpm离心10s)，空白对照孔加入6μl双蒸水。盖上八联管盖，涡旋震荡，板式离心机2000rpm离心1min。
[0062]
(3)微滴生成：将pcr八联管中的15μl pcr反应液转移至芯片样本行中，再加入14ul微滴生成油，放入微滴生成仪中，自动生成微滴；
[0063]
(4)pcr扩增：将生成好微滴的芯片平行转移至芯片式定性pcr仪中，反应条件如下：95℃10min；40个循环(98℃15s，60℃60s)，28℃5min；28℃，hold。扩增完成降至28℃时即可取出。
[0064]
3.微滴读取仪进行结果分析，具体包括如下步骤：
[0065]
(1)简单设置每个反应孔样本信息，开始运行，仪器会自动对每孔约20000～30000个微滴进行荧光读取和分析，并自动计算浓度结果，也可手动微调：检测合格标准：
[0066]
阳性对照，kras基因3个外显子4种突变型质粒拷贝数大于25拷贝/μl,内参基因拷贝数大于500拷贝/μl；阴性对照，kras基因突变型基因拷贝数小于0.1拷贝/μl，内参基因拷贝数大于7000拷贝/μl；
[0067]
样本结果：样本中kras基因突变比例的准确计算公式如下：
[0068]
样本中kras基因突变比例准确计算＝测试孔kras基因某突变型浓度结果(拷贝/μl)/(测试孔内参基因浓度结果(拷贝/μl)
[0069]
(2)如果样本中kras基因突变型或野生型浓度过高，将导致测试孔中浓度结果超过5000拷贝/μl，为了达到最佳准确性，需对样本进行10倍稀释后，再进行检测。
[0070]
实施例5：kras基因突变质粒检测灵敏度测试
[0071]
(1)引物探针预混合液根据实施例1和4中的探针引物混合方式：每条引物浓度为100um，探针的浓度为100um，配置10*mix预混液；最终形成引物/探针在反应体系中的浓度约为900/200nm。-20℃保存；
[0072]
(2)合成各检测位点突变的单阳性质粒，由上海生工生物工程有限公司合成；此外，合成一条用于测试和优化多重检测体系的包含各位点最常见突变型的长片段质粒，并
引入hindiii酶切位点，质粒酶切后可保证各位点突变丰度一致，并且片段化质粒有助于提高扩增效率；长片段混合突变质粒序列具体如下表：
[0073][0074][0075]
注：*突变对应id号及突变形式数据来源于全球最大的实体肿瘤突变公共数据库：(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)
[0076]
(3)根据实施例4进行kras基因突变质粒检测灵敏度测试：
[0077]
本实验是包含各位点最常见突变型的已知浓度的突变质粒与gdna混合的参考品，进行灵敏度测试。检测结果如下表；
[0078][0079][0080]
结果汇总如下：
[0081][0082]
以理论浓度为横坐标，以实际结果为纵坐标，绘制线性曲线如图1；
[0083]
结果如上表，高野生型背景下，0.01％突变比例样本10孔均能稳定检出阳性；
[0084]
实施例6标准品测试
[0085]
根据实施例4进行标准品测试，本实验采用的是已知突变比例的标准品，采购于菁良基因，货号gw-octm009,进行菁良基因标准品测试，包含g12d和a146t突变，突变频率分别是1％、0.1％和0％；货号gw-opss215，包含q61h2，突变频率5％；货号gw-ogtm006，包含g13d和g12c突变，突变频率5％，用野生型gdna稀释至0.1％。
[0086]
[0087][0088]
如上表所示，本方法在检测标准品实验中，检出结果与标准品结果基本一致。标准品gw-octm009或标准品gw-ogtm006稀释后检测，r2值都控制在0.99以上，充分说明了本方法学对低突变频率样本检测的高特异性、高灵敏度和高稳定性。
[0089]
实施例7：重复性试验
[0090]
(1)引物探针预混合液根据实施例1和4中的探针引物混合方式：每条引物浓度为
100um，探针的浓度为100um，配置10*mix预混液；最终形成引物/探针在反应体系中的浓度约为900/200nm。-20℃保存；
[0091]
(2)样本采用实施例5合成的包含kras基因3个外显子4种突变型的质粒与正常基因组dna(gdna)的混合溶液，约5％左右的突变比例；
[0092][0093]
如上表结果所示，中高浓度样本重复性很好，cv≤5％。
[0094]
实施例8：特异性试验
[0095]
本次实验采用正常gdna样本，上样量控制在5000-10000拷贝之间，20孔重复测试，检测各通道假阳性点数量。
[0096][0097][0098]
如上表结果所示，阴性样本20孔重复测试后，各通道假阳性点都控制在≤1个以内，特异性高。
[0099]
实施例9：部分临床样本检测
[0100]
将本发明所述的检测试剂盒用于自制标准品(生工合成并经测序确认的突变型质
粒与野生型gdna混合为原始突变比例约5％、1％、0.1％)和部分肺癌临床患者血浆样本的检测，方法参照实施例4，结果与市售的标定性能最高的kras基因突变试剂盒进行比较，目前市售的kras基因突变试剂盒没有同时检测3个外显子的商品，需要kras基因12、14密码子突变检测试剂盒和kras基因3、4外显子突变试剂盒组合进行比对，检测结果如表2：
[0101]
表2样品检测结果对照表
[0102]
[0103][0104][0105]
对自制阳性参考品的比对实验结果显示，高浓度突变比例(5％)时两种方法学一致性较好，但是采用中浓度(1％)的突变比例模板时，多重数字pcr能够准确检出，而arms-pcr方法则因其检出限为0.5～1％，导致检出不完全，待低浓度(0.1％，检出限附近)的突变比例模板时，多重数字pcr能够全部准确检出，而arms-pcr方法则因灵敏度达不到导致完全
无法检出；50例临床样品的比对实验结果显示，符合率为88％左右，本方法学比arms-pcr方法多检出6例；差异结果显示，对于组织和胸腹水这类高浓度dna样本，arms-pcr方法的检出率勉强满足，而本方法多检出的2例样本也是由于突变比例仅在0.71％和0.43％左右，灵敏度优于arms-pcr方法。但是对于血浆这类低dna含量样本，arms-pcr方法在检出率方面就明显不足，而多重数字pcr方法就可以凸显优势，比arms-pcr方法多检出4例。这4例样本都是突变比例比较低的样本，36号kras-12/13突变率0.13％，39号kras-12/13突变率0.07％，45号kras-g12c突变率0.09％，48号kras-12/13突变率0.32％。本发明通过每一种突变设计多种不同位置替换lna修饰核苷酸，并进行一系列单孔多重检测的优化组合，筛选出互不干扰，特异性强、灵敏度高的引物探针组合，能够实现单孔检测，覆盖97％以上的变异发生率，灵敏度提升至0.01％，特异性强；操作简便快速，结果分析非常直观易懂；适宜各种样本类型，尤其是低丰度突变的血浆样本，单孔多重，样本需求少，成本低，高通量，分析简单快速，结果准确，大大增加了kras基因多突变的检出率，性能比现有的试剂盒有明显的改进，用于临床检测可获得更精准的检测结果，尤其针对肺癌靶向用药疗效预测、治疗预后及复发监控提供了重要参考依据。
[0106]
本发明操作简便、结果准确、判读直观、成本低廉、通量高，相比已有的研究或产品性能具有显著的改进和提升，位点通量高，单孔检测14种常见突变，节省珍贵样本和试剂；低成本高灵敏度的kras靶向相关位点变异多重检测体系用于kras基因突变检测能更好地满足临床高灵敏度、高特异性、高准确性的精准诊断和治疗的需求，具有很好的临床应用前景。

技术特征：
1.一组检测kras基因多位点突变的核酸序列，其特征在于，包括如下引物对及探针，其核苷酸序列如seq id no：001～023所示，且核酸序列在一次1孔检测中使用；其中部分引物碱基前面的“+”号表示该碱基用锁核酸lna代替普通的核苷酸；seq id no：3～9分别为检测kras-2外显子g12a、g12d、g12v、g12r、g12s、g13c、g13d突变型探针，序列的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；seq id no：12～16分别为检测kras-3外显子q61r、q61h1、q61h2、q61l、q61k突变型探针，序列的5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；seq id no：19为检测kras-4外显子a146t突变型探针,序列的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团；seq id no：20为检测kras-2外显子g12c突变型探针,序列的5’端标记a425荧光基团，3’端标记bhq淬灭基团；seq id no：23为检测fech单拷贝参考基因探针，序列的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq淬灭基团。2.一组检测kras基因多位点突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：(1)pcr反应液：包括dna聚合酶、mg
2+
、pcr反应缓冲液、datp、dctp、dttp和dgtp；(2)引物探针预混合液：反应管所示的核苷酸序列的混合液，每条引物浓度为100um，探针的浓度为100um，配置10*mix预混液；(3)阳性对照：包含kras基因3个外显子4种突变型的质粒与正常基因组dna(gdna)的混合溶液；(4)阴性对照：包含正常gdna的溶液。3.根据权利要求2所述用于检测kras基因多位点突变的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照中，kras基因3个外显子4种突变型的质粒拷贝数大于500拷贝/μl，内参基因拷贝数大于1000拷贝/μl。4.根据权利要求2所述用于检测kras基因多位点突变的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照中，内参基因拷贝数大于1000拷贝/μl。5.一种权利要求1-4所述的检测kras基因多位点突变的引物探针和试剂盒在检测kras基因突变中的应用，其特征在于，包括以下步骤，(1s)抽提血浆中的游离dna或组织中的dna；(2s)用本发明所述试剂盒进行kras基因多重pcr检测，检测5个通道，同时检测kras基因3个外显子多位点突变，覆盖97％以上的突变发生率；(3s)将扩增完毕的pcr板放入读取仪，对每一扩增完的样本进行荧光分析，在阴阳性对照结果正常的前提下，分别计算样本反应孔中kras基因突变的拷贝数与内参基因拷贝数，最终得出样本中kras突变基因的准确状态；(4s)结果判读：每次根据阴阳性对照设置阈值线。

技术总结
本发明公开了一组检测KRAS基因多位点突变的引物探针和试剂盒，属于分子诊断技术领域。本发明提供的检测KRAS基因多位点突变的引物及探针能特异地扩增并检测KRAS基因2、3、4外显子多基因突变。本发明还公开了一种基于多色数字PCR系统的检测KRAS基因2、3、4外显子多基因突变的检测试剂盒，能实现快速、灵敏、准确的检测KRAS基因2、3、4外显子多基因突变。本发明具有操作简便、特异性强、敏感性高、结果准确、成本低廉及高通量等优点，可用于临床KRAS基因2、3、4外显子多基因突变的快速检测，为临床肺癌、结直肠癌的精准诊断和治疗提供参考依据。结直肠癌的精准诊断和治疗提供参考依据。结直肠癌的精准诊断和治疗提供参考依据。


技术研发人员：虞闰六 宣文静 任绪义
受保护的技术使用者：杭州迪安医学检验中心有限公司
技术研发日：2022.04.26
技术公布日：2023/8/24