高产苏氨酸工程菌的构建方法与流程

1.本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高产苏氨酸工程菌的构建方法。


背景技术：

2.l-苏氨酸(l-threonin)，化学名称β-羟基-α-氨基丁酸，分子式c4h9no3，相对分子质量为119.12。l-苏氨酸是一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等诸多方面。
3.谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysc编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrb)以及苏氨酸合酶(thrc)编码。hermann sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷氨酸棒状杆菌的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(reinscheid d j,eikmanns b j,sahm h.analysis of a corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback-resistant homoserine dehydrogenase.[j].journal of bacteriology,1991,173(10):3228-3230)、lysc基因(eikmanns b j,eggeling l,sahm h.molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in corynebacterium glutamicum.[j].antonie van leeuwenhoek,1993,64(2):145-163)。继hermann sahm之后，lothar eggling通过弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glya，同时过表达苏氨酸外运蛋白thre，使得苏氨酸的产量由49mm提高到67mm(simic p,willuhn j,sahm h,et al.identification of glya(encoding serine hydroxymethyltransferase)and its use together with the exporter thre to increase l-threonine accumulation by corynebacterium glutamicum[j].applied and environmental microbiology,2002,68(7):3321-3327)。
[0004]
目前利用谷氨酸棒状杆菌生产l-苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，丙酮酸-草酰乙酸代谢节点与合成途径组合等方面的报道较少，且现有报道仅对l-苏氨酸合成路径做了初步研究，并未形成系统。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种高产苏氨酸工程菌的构建方法。
[0006]
为了实现本发明目的，本发明通过加强苏氨酸合成路径中的酶同时加强前体的供应使菌株生产l-苏氨酸的能力得到提升。
[0007]
第一方面，本发明提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。
[0008]
优选地，天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮
酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶在ncbi上的参考序列编号分别为wp_011013497.1、wp_003855724.1、wp_003854900.1、wp_011014964.1、wp_011013816.1、wp_011014465.1、wp_011014814.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
[0009]
优选地，酶的活性的增强是由选自以下1)～5)，或任选的组合实现的：
[0010]
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
[0011]
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
[0012]
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
[0013]
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
[0014]
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强。
[0015]
进一步地，天冬氨酸氨基转移酶活性的增强是通过在aspb基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的。
[0016]
进一步地，天冬氨酸激酶活性的增强是通过在lysc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将lysc基因起始密码子由gtg突变为atg、其编码蛋白的第311位氨基酸由t突变为i来实现的。
[0017]
进一步地，高丝氨酸脱氢酶活性的增强是通过在hom基因起始密码子上游插入cspb启动子，并将hom基因编码蛋白的第378位氨基酸由g突变为e来实现的。
[0018]
进一步地，苏氨酸合酶活性的增强是通过在thrc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将thrc基因起始密码子由gtg突变为atg。
[0019]
进一步地，丙酮酸羧化酶活性的增强是通过在pyc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将pyc基因编码蛋白的第458位氨基酸由p突变为s来实现的。
[0020]
进一步地，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的增强是通过在ppc基因起始密码子上游插入tuf启动子，并将ppc基因编码蛋白的第299位氨基酸由d突变为n来实现的。
[0021]
进一步地，苹果酸/醌氧化还原酶活性的增强是通过在mqo基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的。
[0022]
优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括atcc13032、atcc13870、atcc13869、atcc21799、atcc21831、atcc14067、atcc13287等(参见ncbi corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。
[0023]
第二方面，本发明提供高产苏氨酸工程菌的构建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，增强具有氨基酸生产能力的棒杆菌中的基因aspb、lysc、hom、thrc、pyc、ppc和mqo，获得天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶活性增强的菌株。
[0024]
优选地，基因aspb、lysc、hom、thrc、pyc、ppc和mqo在ncbi上的参考序列编号分别为cg0294、cg0306、cg1337、cg2437、cg0791、cg1787和cg2192。
[0025]
所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
[0026]
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
[0027]
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
[0028]
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
[0029]
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
[0030]
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
[0031]
6)通过对酶的编码基因的核苷酸序列进行改变而增强。
[0032]
第三方面，本发明提供一种生产苏氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
[0033]
a)培养所述修饰的棒状杆菌属微生物，以获得所述微生物的培养物；
[0034]
b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。
[0035]
第四方面，本发明提供基因aspb、lysc、hom、thrc、pyc、ppc和mqo的增强在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。
[0036]
进一步地，通过增强具有氨基酸生产能力的棒杆菌(corynebacterium)中的天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶的活性来提高苏氨酸的发酵产量。
[0037]
优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括atcc13032、atcc13870、atcc13869、atcc21799、atcc21831、atcc14067、atcc13287等(参见ncbi corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。
[0038]
第五方面，本发明提供所述修饰的棒状杆菌属微生物或按照上述方法构建得到的高产苏氨酸工程菌在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。
[0039]
上述有关菌株的改造方法包括基因的强化和弱化等均为本领域技术人员可知的改造方式，参见满在伟.高产l-精氨酸钝齿棒杆菌的系统途径工程改造[d].江南大学,2016；崔毅.代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产l
‑‑
亮氨酸[d].天津科技大学.；徐国栋.l-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化.天津科技大学,2015.
[0040]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0041]
本发明将天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸/醌氧化还原酶菌株联合用于棒杆菌(如谷氨酸棒状杆菌)的l-苏氨酸生产，增强上述基因表达的菌株l-苏氨酸的产量较未改造菌株有较大提高，产量可达6.3g/l。为大规模生产苏氨酸提供有效手段，应用前景广阔。
具体实施方式
[0042]
本发明提供一种生产苏氨酸的菌株，将丙酮酸-草酰乙酸代谢节点与合成途径组合用于l-苏氨酸的生产。菌株改造过程及效果：
[0043]
本发明对菌株的l-苏氨酸合成路径和丙酮酸节点进一步强化，主要包括天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸/醌氧化还原酶表达强化或解调控，以探索两者同时表达强化后对l-苏氨酸的影响。摇瓶结果显示l-苏氨酸的生产能力有所提升。
[0044]
改造过程中的表达强化包括启动子的替换，核糖体结合位点的改变、拷贝数的增加、质粒过表达等手段，且以上手段均为本领域技术人员公知手段。以上手段无法通过举例而穷尽，具体实施例中仅以启动子强化作为代表进行说明。
[0045]
具体地，
[0046]
本发明在aspb基因起始密码子上游插入sod启动子，实现对aspb基因的表达增强。
[0047]
本发明在lysc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将lysc基因起始密码子由
gtg突变为atg、其编码蛋白的第311位氨基酸由t突变为i，实现对lysc基因的增强。
[0048]
本发明在hom基因起始密码子上游插入cspb启动子，并将hom基因编码蛋白的第378位氨基酸由g突变为e，实现对hom基因的增强。
[0049]
本发明在thrc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将thrc基因起始密码子由gtg突变为atg，实现对thrc基因的增强。
[0050]
本发明在pyc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将pyc基因编码蛋白的第458位氨基酸由p突变为s，实现对pyc基因的增强。
[0051]
本发明在ppc基因起始密码子上游插入tuf启动子，并将ppc基因编码蛋白的第299位氨基酸由d突变为n，实现对ppc基因的增强。
[0052]
本发明在mqo基因起始密码子上游插入sod启动子，实现对mqo基因的增强。
[0053]
上述菌株为棒杆菌，优选谷氨酸棒状杆菌，最优选谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。
[0054]
进一步地，将上述菌株用于苏氨酸发酵生产。
[0055]
本发明涉及的蛋白及其编码基因如下：
[0056]
天冬氨酸氨基转移酶，编码基因aspb，ncbi编号：cg0294、cgl0240、ncgl0237。
[0057]
天冬氨酸激酶，编码基因lysc，ncbi编号：cg0306、cgl0251、ncgl0247。
[0058]
高丝氨酸脱氢酶，编码基因hom，ncbi编号：cg1337、cgl1183、ncgl1136。
[0059]
苏氨酸合酶，编码基因thrc，ncbi编号：cg2437、cgl2220、ncgl2139。
[0060]
丙酮酸羧化酶，编码基因pyc，ncbi编号：cg0791、cgl0689、ncgl0659。
[0061]
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，编码基因ppc，ncbi编号：cg1787、cgl1585、ncgl1523。
[0062]
苹果酸/醌氧化还原酶，编码基因mqo，ncbi编号：cg2192、cgl2001、ncgl1926。
[0063]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0064]
以下实施例中基因lysc、thrc来自谷氨酸棒状杆菌，野生型基因lysc、thrc的核苷酸序列分别如seq id no:1-2所示。
[0065]
以下实施例中使用的实验材料如下：
[0066][0067][0068]
以下实施例中涉及的实验方法如下：
[0069]
pcr扩增体系如下：
[0070]
成分体积(微升)灭菌的去离子水295
×
pfu buffer102.5mm dntp510μm上游引物210μm下游引物2
pfu1模板1(融合pcr模板最大加到2微升)共计50
[0071]
pcr扩增程序如下：
[0072][0073]
菌株改造方法：
[0074]
1、无缝组装反应程序：参照clonexpress multis one step cloning kit说明书。
[0075]
2、转化方法：参照trans1-t1 phage resistant chemically competent cell说明书。
[0076]
3、感受态细胞的制备：参照c.glutamicum handbook,charpter 23。
[0077]
实施例1菌株基因组改造质粒的构建
[0078]
1、天冬氨酸氨基转移酶方案重组质粒pk18mobsacb-p
sod-aspb的构建
[0079]
以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以p103/p104引物对进行pcr扩增得到上游同源臂up，以p105/p106引物对进行pcr扩增得到psod，以p107/p108引物对进行pcr扩增得到下游同源臂dn，以p103/p108引物对以up、psod、dn为模板进行融合pcr，获得全长片段psod-aspb。pk18mobsacb用bamhi/hindiii酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-psod-aspb。
[0080]
2、天冬氨酸激酶表达强化方案重组质粒pk18mobsacb-p
sod-lysc
g1a-t311i
的构建
[0081]
以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以p21/p22引物对进行pcr扩增得到上游同源臂up，以p23/p24引物对进行pcr扩增得到psod，以p25/p26引物对进行pcr扩增得到lysc
g1a
序列mid，以p27/p28引物对进行pcr扩增得到下游同源臂dn，以p21/p28引物对以up、psod、mid、dn为模板进行融合pcr，获得全长片段p
sod-lysc
g1a-t311i
。pk18mobsacb用bamhi/hindiii酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-p
sod-lysc
g1a-t311i
。
[0082]
其中，g1a表示lysc基因(lysc野生型基因序列见seq id no:1)起始密码子的第1位碱基由g突变为a，t311i表示lysc基因编码的天冬氨酸激酶的第311为氨基酸由t突变为i。
[0083]
3、高丝氨酸脱氢酶表达强化方案重组质粒pk18mobsacb-p
cspb-hom
g378e
的构建
[0084]
以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以p29/p30引物对进行pcr扩增得到上游同源臂up，以atcc14067基因组为模板以p31/p32引物对进行pcr扩增得到p
cspb
，以atcc13032基因组为模板以p33/p34引物对进行pcr扩增得到hom
g378
序列mid，以p35/p36引物对进行pcr扩增得到下游同源臂dn，以p29/p36引物对以up、p
cspb
、mid、dn为模板进行融合pcr，获得全长片段p
cspb-hom
g378e
。pk18mobsacb用bamhi/hindiii酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-p
cspb-hom
g378e
。
[0085]
4、苏氨酸合酶表达强化质粒pk18mobsacb-p
sod-thrc
g1a
的构建
[0086]
以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以p37/p38引物对进行pcr扩增得到上游同源臂up，以p39/p40引物对进行pcr扩增得到psod，以p41/p42引物对进行pcr扩增得到下游同源臂dn，以p37/p42引物对以up、psod、dn为模板进行融合pcr，获得全长片段p
sod-thrc
g1a
。pk18mobsacb用bamhi/hindiii酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-p
sod-thrc
g1a
。
[0087]
其中，g1a表示thrc基因(thrc野生型基因序列见seq id no:2)起始密码子的第1位碱基由g突变为a。
[0088]
5、丙酮酸羧化酶表达强化方案重组质粒pk18mobsacb-p
sod-pyc
p458s
的构建
[0089]
以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以p13/p14引物对进行pcr扩增得到上游同源臂up，以p15/p16引物对进行pcr扩增得到psod，以p17/p18引物对进行pcr扩增得到pyc
p458s
序列mid，以p19/p20引物对进行pcr扩增得到下游同源臂dn，以p13/p20引物对以up、psod、mid、dn为模板进行融合pcr，获得全长片段p
sod-pyc
p458s
。pk18mobsacb用bamhi/hindiii酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-p
sod-pyc
p458s
。
[0090]
6、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶表达强化方案重组质粒pk18mobsacb-p
tuf-ppc
d299n
的构建
[0091]
以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以p53/p54引物对进行pcr扩增得到上游同源臂up，以p55/p56引物对进行pcr扩增得到p
tuf
，以p57/p58引物对进行pcr扩增得到ppc
d299n
序列mid，以p59/p60引物对进行pcr扩增得到下游同源臂dn，以p53/p60引物对以up、p
tuf
、mid、dn为模板进行融合pcr，获得全长片段p
tuf-ppc
d299n
。pk18mobsacb用bamhi/hindiii酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-p
tuf-ppc
d299n
。
[0092]
7、天冬氨酸氨基转移酶表达强化方案重组质粒pk18mobsacb-p
sod-mqo的构建
[0093]
以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以p169/p170引物对进行pcr扩增得到上游同源臂up，以p171/p172引物对进行pcr扩增得到psod，以p173/p174引物对进行pcr扩增得到下游同源臂dn，以p169/p174引物对以up、psod、dn为模板进行融合pcr，获得全长片段p
sod-mqo。pk18mobsacb用bamhi/hindiii酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-p
sod-mqo。
[0094]
质粒构建过程中所用引物如表1所示：
[0095]
表1
[0096]
[0097][0098]
注：加粗字体及下划线为引入相应点突变的引物。
[0099]
实施例2基因组改造菌株的构建
[0100]
1、天冬氨酸氨基转移酶加强菌株的构建
[0101]
按照谷棒经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备atcc13032感受态细胞。重组质粒pk18mobsacb-psod-aspb以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为smct241。
[0102]
2、天冬氨酸激酶强化表达及解调控菌株的构建
[0103]
按照谷棒经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备smct241感受态细胞。重组质粒pk18mobsacb-p
sod-lysc
g1a-t311i
以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有
15mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为smct242。
[0104]
3、高丝氨酸脱氢酶表达强化菌株的构建
[0105]
按照谷棒经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备smct242感受态细胞。重组质粒pk18mobsacb-p
cspb-hom
g378e
以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为smct243。
[0106]
4、苏氨酸合酶表达强化菌株的构建
[0107]
按照谷棒经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备smct243感受态细胞。重组质粒pk18mobsacb-p
sod-thrc
g1a
以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为smct244。
[0108]
5、丙酮酸羧化酶表达强化菌株的构建
[0109]
按照谷棒经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备smct244感受态细胞。重组质粒pk18mobsacb-p
sod-pyc
p458s
以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为smct245。
[0110]
6、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达强化菌株的构建
[0111]
按照谷棒经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备smct245感受态
细胞。重组质粒pk18mobsacb-p
tuf-ppc
d299n
以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为smct246。
[0112]
7、苹果酸/醌氧化还原酶表达强化菌株的构建
[0113]
菌株构建方法同上，以smct246为出发菌，进行苹果酸/醌氧化还原酶表达强化菌株的改造，获得的改造菌株命名为smct247。
[0114]
按照谷棒经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备smct246感受态细胞。重组质粒pk18mobsacb-p
sod-mqo以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为smct247。
[0115]
获得的菌株如表2所示：
[0116]
表2
[0117][0118][0119]
实施例3构建菌株摇瓶验证
[0120]
1.培养基
[0121]
种子活化培养基：bhi 3.7％，琼脂2％，ph7。
[0122]
种子培养基：蛋白胨5/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，硫酸铵16g/l，尿素8g/l，磷酸二氢钾10.4g/l，磷酸氢二钾21.4g/l，生物素5mg/l，硫酸镁3g/l。葡萄糖50g/l，ph 7.2。
[0123]
发酵培养基：玉米浆50ml/l，葡萄糖30g/l，硫酸铵4g/l，mops 30g/l，磷酸二氢钾10g/l，尿素20g/l，生物素10mg/l，硫酸镁6g/l，硫酸亚铁1g/l，vb1
·
hcl 40mg/l，泛酸钙
50mg/l，烟酰胺40mg/l，硫酸锰1g/l，硫酸锌20mg/l，硫酸铜20mg/l，ph 7.2。
[0124]
2.工程菌摇瓶发酵生产l-苏氨酸
[0125]
(1)种子培养：挑取smct241、smct242、smct243、smct244、smct245、smct246、smct247斜面种子1环接至装有20ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养16h。
[0126]
(2)发酵培养：将2ml种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养24h。
[0127]
(3)取1ml发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用hplc检测工程菌与对照菌发酵液中的l-苏氨酸(表3)。
[0128]
表3 l-苏氨酸摇瓶发酵结果
[0129][0130][0131]
从表3可以看出，天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸/醌氧化还原酶一种或多种表达加强的菌株的l-苏氨酸产量有所提高，l-苏氨酸最高产量为5.9g/l。天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸/醌氧化还原酶至少一个表达强化相组合时，其l-苏氨酸的产量均有提升。
[0132]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；6)通过对酶的编码基因的核苷酸序列进行改变而增强。3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，天冬氨酸氨基转移酶活性的增强是通过在aspb基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的；和/或天冬氨酸激酶活性的增强是通过在lysc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将lysc基因起始密码子由gtg突变为atg、其编码蛋白的第311位氨基酸由t突变为i来实现的；和/或高丝氨酸脱氢酶活性的增强是通过在hom基因起始密码子上游插入cspb启动子，并将hom基因编码蛋白的第378位氨基酸由g突变为e来实现的；和/或苏氨酸合酶活性的增强是通过在thrc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将thrc基因起始密码子由gtg突变为atg；和/或丙酮酸羧化酶活性的增强是通过在pyc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将pyc基因编码蛋白的第458位氨基酸由p突变为s来实现的；和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的增强是通过在ppc基因起始密码子上游插入tuf启动子，并将ppc基因编码蛋白的第299位氨基酸由d突变为n来实现的；和/或苹果酸/醌氧化还原酶活性的增强是通过在mqo基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的。4.根据权利要求1-3任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)。5.高产苏氨酸工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段，增强具有氨基酸生产能力的棒杆菌中的基因aspb、lysc、hom、thrc、pyc、ppc和mqo，获得天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶活性增强的菌株；所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对酶的编码基因的核苷酸序列进行改变而增强。6.一种生产苏氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)培养权利要求1-4任一项所述的微生物，以获得所述微生物的培养物；b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。

技术总结
本发明提供一种高产苏氨酸工程菌的构建方法。本发明将天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸/醌氧化还原酶菌株联合用于棒杆菌(如谷氨酸棒状杆菌)的L-苏氨酸生产，增强上述基因表达的菌株L-苏氨酸的产量较未改造菌株有较大提高，产量可达6.3g/L。为大规模生产苏氨酸提供有效手段，应用前景广阔。用前景广阔。


技术研发人员：康培 宫卫波 何君 李岩
受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司
技术研发日：2022.02.10
技术公布日：2023/8/24