一类亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其制备方法及在糖蛋白的糖基化改造中的应用

1.本发明属于酶工程领域，涉及到糖蛋白的糖工程化，具体涉及到一类亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，及其制备和应用。


背景技术：

2.单克隆抗体(mab)代表用于治疗癌症、炎症性病症、以及感染性疾病的一类主要的治疗性蛋白质。目前许多实验数据已经显示，糖基化对抗体的稳定性、生物功能、以及治疗功效等有着极其重要的影响。比如，fc聚糖的核心岩藻糖基化可以显著降低抗体依赖性细胞毒性(adcc)，并且具有低含量的核心岩藻糖基化的抗体已经在抗癌治疗中显示出提高的治疗功效。另一方面，据报道，末端α-2,6-唾液酸化的fc糖型也会对抗体效果产生部分影响。然而，天然抗体和重组抗体通常作为异质糖型产生，所述异质糖型难以分离，因此，可以生产出结构明确、糖型均一的抗体的方法对于功能研究和开发更好的基于抗体的治疗剂来说是非常重要的。
3.目前，一种以化学酶法糖基化改造来获得均一抗体糖型的方法已经出现，所述方法包括完整抗体的内切糖苷酶催化的去糖基化和后续的转糖化。已显示，重组igg-fc结构域的fc聚糖可以在适当的内切糖苷酶包括endo-a、endo-d、endo-s、endo-s2、endo-f等催化下通过酶促去糖基化和转糖基改造。而在某些条件下糖基化改造效果并不是很好。比如endo-f3及其突变酶endo-f3 d165a在对岩藻糖基化的受体糖蛋白进行转糖基过程中仍需补加大量糖噁唑啉供体，才能完成完全转糖基化。
4.传统改造酶的方法主要基于对酶的序列或关键氨基酸残基进行改造，以提升相关酶的催化活性。因此，现有技术中存在开发一种新的策略来提高相关酶的催化活性的需求。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是提供一种亲和片段共价修饰的糖苷内切酶。
6.本发明的另一个目的是提供一种亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的制备方法。
7.本发明的再一个目的是提供一种基于亲和片段修饰的糖苷内切酶制备岩藻糖基化的糖蛋白的方法。
8.本发明的又一个目的是提供一种“一锅法”制备糖工程抗体的方法。
9.本发明的还一个目的是提供一种基于抗体保守糖基化位点的功能性抗体的制备方法。
10.本发明的一个方面，提供了一种亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其结构如下式(i)所示：
11.a-l-e
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ(i)12.其中，
13.a为亲和片段，所述亲和片段为fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列的片
段，
14.e为糖苷内切酶或其突变酶部分，
15.l为连接亲和片段a及糖苷内切酶或其突变酶部分e的连接子。
16.下文中，在a-e部分中分别对上式(i)中的各要素、要素的连接方式及式(i)的具体实例进行详细阐述。
17.a.关于式(i)中的a片段，如下进行详细描述。
18.在具体实施方式中，所述fc亲和多肽为包含以下式(ii)所示的核心序列的fc亲和多肽：
[0019][0020]
在上式中，氨基酸序列结构为n端到c端排列，cys表示半胱氨酸残基，两个半胱氨酸通过二硫键连接，x
s1
和y
s2
表示与半胱氨酸连接的s1个或s2个氨基酸残基，s1和s2各自独立地为0、1、2或3；下标t1和t2分别表示与半胱氨酸连接的s1个氨基酸残基x
s1
及s2个氨基酸残基y
s2
的重复次数，其各自独立为0-10的整数；aa1-aa9分别表示天然或非天然氨基酸残基。
[0021]
在本文中，所述氨基酸残基可为衍生自天然或非天然氨基酸的氨基酸残基。
[0022]
aa1、aa2、aa3、aa5、aa7、aa8和aa9各自独立地为氨基酸残基，优选地，aa1、aa2、aa3、aa5、aa7、aa8和aa9不为半胱氨酸残基，以及
[0023]
aa4和aa6之一为侧链含nh2基团的氨基酸残基，如赖氨酸残基(k)、鸟氨酸残基(orn)、精氨酸残基(r)，并且，当aa4或aa6其中一个氨基酸为含有氨基结构时，另一个为除该氨基酸及半胱氨酸以外的任意氨基酸。
[0024]
在具体实施方式中，aa1为丙氨酸残基(a)、或甘氨酸残基(g)；
[0025]
aa2为酪氨酸残基(y)、或苯丙氨酸残基(f)；
[0026]
aa3为组氨酸残基(h)、苯丙氨酸残基(f)、酪氨酸残基(y)或甘氨酸残基(g)；
[0027]
aa4为赖氨酸残基(k)、或谷氨酰胺残基(q)；
[0028]
aa5为甘氨酸残基(g)、丝氨酸残基(s)、天冬酰胺残基(n)、谷氨酰胺残基(q)、天冬氨酸残基(d)、谷氨酸残基(e)、苯丙氨酸残基(f)、酪氨酸残基(y)、色氨酸残基(w)、组氨酸残基(h)、苏氨酸残基(t)、亮氨酸残基(l)、丙氨酸残基(a)、缬氨酸残基(v)、异亮氨酸残基(i)、或精氨酸残基(r)；
[0029]
aa6为赖氨酸残基(k)、或苯丙氨酸残基(f)；
[0030]
aa7为亮氨酸残基(l)、异亮氨酸残基(i)或正亮氨酸残基(nle)；
[0031]
aa8为缬氨酸(v)、异亮氨酸残基(i)、或亮氨酸残基(l)；
[0032]
aa9为色氨酸残基(w)、或苯丙氨酸残基(f)。
[0033]
在具体实施方式中，亲和片段a选自以下环肽结构：
[0034]
[0035]
其中，多肽从左至右为n端到c端，ac表示n端的乙酰化，-nh2表示c端的胺化，代表连接位点。
[0036]
在具体实施方式中，所述fc亲和多肽(下文中被命名为fcbp)为fc亲和环肽，其选自以下：
[0037]
[0038][0039]
其中，较佳地，在实施例中，*标注位置为fcbp与连接子l的连接位置，优选地，fcbp与l通过酰胺键连接。
[0040]
b.关于式(i)中的连接子l，如下进行详细描述。
[0041]
在具体实施方式中，所述l为具有双功能团结构的双价连接子，其结构中可包括聚乙二醇、脂肪烃、酰胺键、酯、硫酯、马来酰亚胺结构，优选地，l选自以下：
s2，或其突变酶；肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)来源的糖苷内切酶endo-d，或其突变酶；嗜粉菌(coprinopsis cinerea)来源的糖苷内切酶endo-cc，或其突变酶；秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)来源的糖苷内切酶endo-ce，或其突变酶；毛霉菌(mucor hiemalis)来源的糖苷内切酶endo-m，或其突变酶；原生节杆菌(arthrobacter protophormiae)来源的糖苷内切酶endo-a，或其突变酶；脑膜败血伊丽莎白菌(elizabethkingia meningoseptica)来源的糖苷内切酶endo-f1，或endo-f2，或endo-f3，或其突变酶；链霉菌(streptomyces plicatus)来源的糖苷内切酶endo-h，或其突变酶；ogatea minuta来源的糖苷内切酶endo-om，或其突变酶；脑膜败血伊丽莎白菌(elizabethkingia meningoseptica)来源的糖苷内切酶endo-f3，或其突变酶。
[0048]
在一个实施方式中，所述糖苷内切酶或其突变体部分e的糖苷内切酶或其突变体为脑膜败血伊丽莎白菌(elizabethkingia meningoseptica)来源的糖苷内切酶endo-f3，或其突变酶d165a(seq id no.1)(下文也称为endo-f3d165a或d165a)；或者包含与seq id no:1具有80％以上，例如85％，90％，95％，98％的同源性序列的酶。
[0049]
在本文中，任何含有endo-f3 d165a的结构域或片段可以与其他蛋白质融合，所述其他蛋白质包括但不限于半胱氨酸蛋白酶结构域(cpd)、麦芽糖结合蛋白(mbp)或fc受体等。催化结构域和特异性结合位点对于酶活性很重要，因此，酶上的其他位点可以被修饰或截短，如末端，而不会影响大部分的糖苷内切酶的活性。
[0050]
在具体实施方式中，式(i)中，所述e为与cpd融合的endo-f3 d165a。
[0051]
在本文中，式(i)所示的a-l-e中的各部分结构可以进一步被修饰。特别是，糖苷内切酶或其突变酶部分e中的糖苷内切酶或其突变酶可以是经修饰的糖苷内切酶或其突变酶。例如，糖苷内切酶或其突变酶部分e中的部分天然氨基酸可以被非天然氨基酸取代，非天然氨基酸包括天然氨基酸的类似物或修饰物；天然氨基酸的类似物包括：酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物。天然氨基酸的修饰物包括：烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤代、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒代、酯、硫代酸、硼酸酯、有机硼酸酯、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮、或氨基取代的氨基酸或任何组合。
[0052]
d.关于式(i)中的a、l和e的具体连接方式，如下进行详细描述。
[0053]
在具体实施方式中，所述l连接到e的半胱氨酸的巯基、赖氨酸的氨基、n端的氨基、精氨酸的胍基、丝氨酸的羟基、酪胺酸的羟基、谷氨酸的羧基或者天冬氨酸的羧基，优选地，连接在e的半胱氨酸的巯基；和/或所述l连接在a的氨基、羟基、羧基、巯基或胍基基团，优选地，连接在a的氨基。
[0054]
在具体实施方式中，l连接在e部分，优选endo-f3 d165a的半胱氨酸残基。
[0055]
在具体实施方式中，l连接在a的赖氨酸残基，例如赖氨酸(k)或精氨酸(r)的氨基或n端氨基。
[0056]
e.式(i)的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的具体形式
[0057]
在具体实施方式中，所述亲和片段共价修饰的糖苷内切酶选自以下各结构：
[0058][0059][0060]
其中，n为大于0的整数，例如n为4或8，以上各结构式中的结构片段d165a-cpd表示与cpd融合的endo-f3 d165a。
[0061]
本发明的又一个方面，提供一种上述亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的制备方法，
[0062]
所述方法包括以下步骤：
[0063]
s1.fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列与连接子化合物通过化学方法形成共价结构，
[0064]
s2.步骤s1形成的共价结构与糖苷内切酶或其突变体反应形成式i的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶；
[0065]
或者，
[0066]
所述方法包括以下步骤：
[0067]
s1’.糖苷内切酶或其突变体e与连接子化合物l通过化学方法形成共价结构，
[0068]
s2’.步骤s1’形成的共价结构与fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列反应形成式i的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶。
[0069]
在上述方法中，所述糖苷内切酶可通过化学全合成方法合成或为来自于细菌表达的天然糖苷内切酶，以及所述fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列可通过化学全合成方法合成或为来自于天然存在的fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列。
[0070]
在具体实施方式中，在所述亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的制备中，步骤1和2和/或步骤1’和2’所涉及的反应包括但不限于以下反应：酰胺缩合、酯缩合、硫酯缩合、成醚、成硫醚、还原胺化、成肟反应、成环反应、点击反应和羟醛缩合反应。
[0071]
本发明的再一方面，提供了上述亲和片段共价修饰的糖苷内切酶在糖工程抗体的糖基化改造中的应用。
[0072]
本发明的再一个方面，提供了一种基于上述亲和片段共价修饰的糖苷内切酶制备岩藻糖基化的糖蛋白的方法，
[0073]
所述方法包括：在上述式(i)(a-l-e)表示的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的作用下，将不同单一结构的n-糖链噁唑啉底物连接至糖蛋白上，得到糖基化改造的糖蛋白，
[0074]
优选地，在所述糖蛋白是抗体的情况下，所述方法如下进行：
[0075][0076]
其中，ox为n-糖链噁唑啉底物，r为单糖、聚糖或携带标签的单糖、聚糖，
■
表示n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)，
▲
表示岩藻糖(fuc)，所述糖基化位点为fc保守糖基化位点。
[0077]
如以上反应式所示，所述方法包括：
[0078]
(a)提供一种含有核心岩藻糖化的glcnac的受体蛋白，该蛋白来自于化学全合成方法或来自于糖苷内切酶处理的天然糖蛋白；
[0079]
(b)在本发明的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶(式i：a-l-e)的作用下，将不同单一结构的n-糖链噁唑啉底物连接至上述核心岩藻糖化的glcnac受体蛋白上，得到fc结构域
的糖基化改造的糖蛋白。
[0080]
在具体实施方式中，所述糖蛋白是抗体、fc片段、或者含有fc片段的融合蛋白，优选地，所述糖蛋白是去糖基化的岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的抗体。
[0081]
在具体实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体、人源fc片段、或者含有人源fc片段的抗体或融合蛋白。
[0082]
在具体实施方式中，所述n-糖链噁唑啉底物为天然的n-聚糖噁唑啉或者人为合成的聚糖噁唑啉。
[0083]
在具体实施方式中，所述人为合成的聚糖噁唑啉是二糖噁唑啉、三糖噁唑啉、四糖噁唑啉、五糖噁唑啉、六糖噁唑啉、七糖噁唑啉、八糖噁唑啉、九糖噁唑啉、十糖噁唑啉、十一糖噁唑啉、十二糖噁唑啉、十三糖噁唑啉或十四糖噁唑啉，或其带有标签的糖结构。
[0084]
在具体实施方式中，所述标签可包括毒素、药物、生物正交基团、荧光探针、聚乙二醇、脂质、多肽、纳米抗体、dna及相关药物、rna及相关药物、胆固醇、抗生素或放射性同位素标记、造影剂、核磁共振成像剂。
[0085]
在具体实施方式中，所述生物正交基团可选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基。
[0086]
本发明的又一个方面，提供了一种“一锅法”制备糖工程抗体的方法，所述方法包括：
[0087][0088]
如以上反应式所示，在β-n-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶及其突变酶特异性水解作用下，igg抗体的fc结构域的n-聚糖水解，得到糖型结构为岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的抗体，在上述制备的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶作用下，将不同单一结构的n-糖链噁唑啉(ox)底物连接至上述水解得到的抗体上，得到fc结构域的糖基化改造的糖工程抗体。
[0089]
在本文中，所述亲和片段共价修饰的糖苷内切酶高效催化糖底物连接到抗体fc结构域的n-糖基化位点asn297。天然抗体的去糖基化应用野生型酿脓链球菌糖苷内切酶-s
(endo-s)，该糖苷酶特异性切除抗体fc结构域的n-聚糖，得到岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的去糖基化抗体。在亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的作用下，将不同单一结构的n-糖链噁唑啉底物连接在fc结构域糖基化位点asn297，从而提供了均一的糖基化产物/均一的功能性糖基化抗体。
[0090]
在具体实施方式中，在n-糖链噁唑啉底物ox中的r中的标签可包括毒素、小分子药物、生物正交基团、荧光探针、生物素、聚乙二醇、脂质、多肽、纳米抗体、dna及相关药物、rna及相关药物、胆固醇、抗生素或放射性同位素标记、造影剂、核磁共振成像剂。
[0091]
所述生物正交基团选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基。
[0092]
本发明的还一个方面，提供了一种基于抗体保守糖基化位点的功能性抗体的制备方法，所述方法包括：
[0093]
s1：将n-单糖或n-聚糖先末端氧化获得醛基活性基团，再通过羟胺缩合或还原胺化获得带有生物正交基团的n-单糖或n-聚糖，然后通过环合反应获得带有生物正交基团的n-糖链噁唑啉底物(ox)；
[0094]
s2：通过上述一锅法制备糖工程抗体的方法获得带有生物正交基团的糖工程抗体，生物正交基团共价修饰在抗体的糖基化位点；以及
[0095]
s3：通过生物正交反应，将功能性分子共价偶联到抗体的糖基化位点，获得如下式(iv)所示的功能性分子修饰的抗体：
[0096]
ab-g-l1-b
’‑
l2-f(iv)，
[0097]
其中，ab为抗体，g为抗体fc保守糖基化位点，l1为连接聚糖和生物正交基团的连接片段，优选地，为
[0098][0099]
n1为0-10的整数；
[0100]
b’为生物正交反应形成的连接片段，优选地，选自以下
[0101][0102]
n2为0-10的整数；
[0103]
l2为连接f和生物正交基团的连接片段；优选地，l2选自以下：
[0104][0105]
m和n3各自独立为0-30的整数；
[0106]
f为功能性分子的片段；
[0107]
在以上各结构式中，代表连接位点；
[0108]
生物正交基团选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基。
[0109]
或者，所述方法包括：
[0110]
s1：n-聚糖先末端氧化获得醛基活性基团，再通过羟胺缩合、还原胺化或酰胺缩合获得带有功能性分子的n-聚糖，然后通过环合反应制备得到如式(v)所示的带有功能性分子的聚糖噁唑啉结构：
[0111]
f-l3-g-ox
ꢀꢀꢀꢀ
(v)
[0112]
在式(v)中，f为功能性分子的片段，g为聚糖结构，l3为偶联f与g的连接片段，优选地，l3可以与上述l1相同，亦可以为上述l1和上述l2的组合或上述l1、b’和l2的组合；ox代表噁唑啉结构；
[0113]
s2：运用上述“一锅法”制备糖工程抗体的方法，直接获得如式(vi)所示带有功能性分子的抗体：
[0114]
f-l3-g-ab
ꢀꢀꢀꢀ
(vi)
[0115]
在式(vi)中，f、l3、g、ab分别如上所定义。
[0116]
在具体实施方式中，在式iv-vi中的功能性分子包括：毒素、药物、生物正交基团、荧光探针、聚乙二醇、脂质、多肽、纳米抗体、dna及相关药物、rna及相关药物、胆固醇、抗生素或放射性同位素标记、造影剂、核磁共振成像剂，或它们的任意组合。
[0117]
有益效果
[0118]
本发明人利用fc结构域的保守n-糖基作为糖基化位点，利用抗体fc结构域的抗体糖基化方法，设计并制备了亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，通过酶催化反应定点连接在fc结构域糖基化位点asn297，提供了均一的糖基化产物和均一的功能性糖基化抗体。
[0119]
本发明的优势在于利用通过亲和片段共价修饰的糖苷内切酶增强其与抗体的亲和力作用，从而增强糖基化改造效率。
附图说明
[0120]
图1中示出endo-f3 d165a糖苷内切酶的氨基酸序列(seq id no:1)。
[0121]
图2中示出本发明实施例1-9中制备的9种亲和片段共价修饰的糖苷内切酶结构中的a-l片段示意图，即fcbp-d165a偶联物中fcbp-连接子的示意图。
[0122]
图3中示出本发明实施例10-18中制备的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶a-l-e即fcbp-d165a偶联物的质谱图(已解卷积)。a：fcbp1-mcc-d165a；b：fcbp1-peg
4-mcc-d165a；c：fcbp1-peg
8-mcc-d165a；d：fcbp2-mcc-d165a；e：fcbp2-peg
4-mcc-d165a；f：fcbp2-peg
8-mcc-d165a；g：fcbp3-mcc-d165a；h：fcbp3-peg
4-mcc-d165a；i：fcbp3-peg
8-mcc-d165a。
[0123]
图4中示出典型的igg抗体和fc n-聚糖的结构。a：显示功能区的人类igg的α骨架结构(pdb代码1hzh)；b：与fc结构域中的asn-297相连的全长双分支复杂型n-聚糖的结构。
[0124]
图5中示出用于将岩藻糖基化的利妥昔单抗糖基化改造成均质糖型的方案，r’表示结构均一或携带标签的单糖、聚糖，r表示在r’上再额外连接一个n-乙酰葡萄糖胺的糖结构。
[0125]
图6中示出利妥昔单抗的糖基化改造的sds-page和esi-ms分析。
[0126]
(a)sds-page分析：泳道m：蛋白分子量指示剂；泳道1：endos去糖基化的利妥昔单抗(1)；泳道2：来自endo-f3 d165a催化的(1)与唾液酸复杂聚糖唑啉(2)之间的反应的转糖基产物；泳道3：来自fcbp2-peg8-mcc-d165a催化的(1)和(3)的反应的转糖基产物(6)；泳道
4：来自endo-f3 d165a催化的(1)与高甘露糖噁唑啉(3)之间的反应的转糖基产物；泳道5：来自fcbp2-peg8-mcc-d165a催化的去糖基化的利妥昔单抗(1)与高甘露糖噁唑啉(3)之间的反应的转糖基产物(7)；泳道6：来自endo-f3 d165a催化的(1)与gn2m3噁唑啉(4)之间的反应的转糖基产物；泳道7：来自fcbp2-peg8-mcc-d165a催化的去糖基化的利妥昔单抗(1)与gn2m3噁唑啉(3)之间的反应的转糖基产物(8)；泳道8：来自endo-f3 d165a催化的(1)与ct噁唑啉(5)之间的反应的转糖基产物；泳道9：来自fcbp2-peg8-mcc-d165a催化的去糖基化的利妥昔单抗(1)与ct噁唑啉(5)之间的反应的转糖基产物(9)；
[0127]
(b)市售的利妥昔单抗的esi-ms(解卷积)；(c)去糖基化的利妥昔单抗(1)的esi-ms。(d)endo-f3 d165a催化的转糖基唾液酸杂合型产物的esi-ms；(e)fcbp2-peg
8-mcc-d165a催化的转糖基唾液酸杂合型产物(6)的esi-ms；(f)endo-f3 d165a催化的转糖基高甘露糖man3噁唑啉的产物的esi-ms；(g)fcbp2-peg8-mcc-d165a催化的转糖基高甘露糖man3噁唑啉的产物(7)的esi-ms；(h)endo-f3 d165a催化的转糖基gn2m3噁唑啉的产物的esi-ms；(i)fcbp2-peg8-mcc-d165a催化的转糖基gn2m3噁唑啉的产物(8)的esi-ms；(j)endo-f3 d165a催化的转糖基ct噁唑啉的产物的esi-ms；(k)fcbp2-peg8-mcc-d165a催化的转糖基ct噁唑啉的产物(9)的esi-ms。
[0128]
图7中示出以sct噁唑啉为糖底物供体，以endos去糖基化的利妥昔单抗为受体，endo-f3 d165a和本发明中优选的9种fcbp-d165a偶联物催化去糖基化的利妥昔单抗糖基化的sds-page。(a)sds-page分析：催化反应15分钟；(b)sds-page分析：催化反应30分钟；(c)sds-page分析：催化反应60分钟；(d)sds-page分析：催化反应120分钟。每张sds-page，泳道m：蛋白分子量指示剂；泳道1：去糖基化的利妥昔单抗；泳道2：endo-f3d165a催化反应结果；泳道3：fcbp3-mcc-d165a催化反应结果；泳道4：fcbp3-peg
8-mcc-d165a催化反应结果；泳道5：fcbp3-peg
4-mcc-d165a催化反应结果；泳道6：fcbp1-mcc-d165a催化反应结果；泳道7：fcbp1-peg
4-mcc-d165a催化反应结果；泳道8：fcbp1-peg
8-mcc-d165a催化反应结果；泳道9：fcbp2-mcc-d165a催化反应结果；泳道10：fcbp2-peg
4-mcc-d165a催化反应结果；泳道11：fcbp2-peg
8-mcc-d165a催化反应结果。(e)endo-f3 d165a和本发明中优选的9种fcbp-d165a偶联物催化去糖基化的利妥昔单抗糖基化效率。
[0129]
图8中示出以不同底物浓度的sct噁唑啉为糖底物供体，分别以endo-f3d165a、fcbp2-peg
4-mcc-d165a和fcbp2-peg
8-mcc-d165a催化转糖基效率的sds-page分析。(a)-(c)：sct噁唑啉底物浓度分别为0.5mm、1mm和2mm的sds-page分析；泳道m：蛋白分子量指示剂；泳道1：去糖基化的利妥昔单抗；泳道2、5、8、11：endo-f3 d165a催化反应结果；泳道3、6、9、12：fcbp2-peg
4-mcc-d165a催化反应结果；泳道4、7、10、13：fcbp2-peg
8-mcc-d165a催化反应结果。(d)-(f)sct噁唑啉底物浓度分别为0.5mm、1mm和2mm的转糖基效率曲线图。
[0130]
图9中示出以带叠氮标签的sct糖噁唑啉为供体，以fcbp2-peg
8-mcc-d165a进行转糖基sds-page和esi-ms分析。(a)sds-page分析：(b)荧光sds-page分析。泳道m：蛋白分子量指示剂；泳道1：市售的利妥昔单抗；泳道2：去糖基化的利妥昔单抗；泳道3：带叠氮标签的sct糖噁唑啉转糖基产物；泳道4：带叠氮标签的sct糖噁唑啉转糖基产物与dbco-cy3分子反应产物。(c)带叠氮标签的sct糖噁唑啉转糖基产物的esi-ms。
[0131]
图10中示出(a)用fcbp-d165a偶联物将曲妥珠单抗进行糖基化改造的方案。(b)市售曲妥珠单抗的esi-ms；(c)去糖基化的曲妥珠单抗(11)的esi-ms；(d)以sct噁唑啉为供体
的转糖基产物(12)(s2g2f-曲妥珠单抗)的esi-ms；(e)以带叠氮标签的sct噁唑啉为供体的转糖基产物(13)的esi-ms。
[0132]
图11中示出用fcbp2-peg
4-mcc-d165a将不同浓度的生物素功能性片段(biotin)催化修饰曲妥珠单抗的sds-page分析图(a)和反应效率图(b)。sds-page分析中，泳道m：蛋白分子量指示剂；泳道1：去糖基化的利妥昔单抗；泳道2：0.5mm的biotin-sct，反应15分钟；泳道3：0.5mm的biotin-sct，反应30分钟；泳道4：0.5mm的biotin-sct，反应60分钟；泳道5：0.5mm的biotin-sct，反应120分钟；泳道6：1mm的biotin-sct，反应15分钟；泳道7：1mm的biotin-sct，反应30分钟；泳道8：1mm的biotin-sct，反应60分钟；泳道9：1mm的biotin-sct，反应120分钟。
具体实施方式
[0133]
本发明提供了一类亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的制备。选取了与抗体fc片段高度亲和的多肽结构和糖苷内切酶突变体endo-f3 d165a化学偶联而成的偶联物(被命名为fcbp-d165a偶联物)，所合成的偶联物显示出显著提高的转糖基效率，能够实现抗体保守糖基化位点n297位的糖基化改造，制备糖结构均一的糖工程抗体。在本发明中，fcbp-d165a偶联物可以有效作用于抗体的糖工程改造以提供具有不同糖型结构的糖工程抗体。如本发明所述，原始糖苷内切酶突变体endo-f3 d165a的转糖基活性较弱，通过在endo-f3 d16a上化学偶联与抗体fc高度亲和的结合肽而成的fcbp-d165a偶联物具有显著提升的与抗体的结合力，以及显著提升的转糖基活性而没有明显的产物水解活性。如本发明所述，描述了糖苷内切酶突变体endo-f3d165a分别通过3个位点和抗体fc片段高度亲和多肽的偶联方法。此外，如本发明进一步所述，描述了利用该fcbp-d165a偶联物对两种治疗性单克隆抗体利妥昔单抗和曲妥珠单抗的高效糖基化改造过程。
[0134]
如本文说明书中所用，不带具体数量的指称可以意指一个或多个。如本文在一项或多项权利要求中所用，当结合词语“包含”使用时，不带具体数量的指称可以意指一个或多个。如本文所用的“另外的”可以意指至少第二个或更多。
[0135]
如本文所用，术语“氨基酸残基”是指氨基酸的n端-nh2脱去一个h，c端的-cooh脱去-oh所形成的基团。除非另有定义，在本文中，氨基酸包括天然氨基酸或非天然氨基酸，包括d型和/或l型氨基酸。
[0136]
如本文所用的“糖“指的是氧化或未氧化的含有碳水化合物的分子，包括单糖、二糖、三糖、低聚糖、或多糖，包括例如l-异构体或d-异构体的n-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖、n-乙酰神经氨酸(唾液酸)、葡萄糖、果糖、岩藻糖、山梨糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、n-乙酰半乳糖胺、二羟基丙酮、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘油醛、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖或其任何组合。糖还指天然、重组、合成和/或半合成产生的这样的分子。
[0137]
本发明中所用的“抗体”指的是含有特异性结合抗原的抗原结合位点或结合细胞受体的带有fc区域的分子。在结构上，最简单的天然存在的抗体(例如igg)包含四条多肽链，即两条重(h)链和两条轻(l)链，它们由二硫键相互连接。所述术语还涵盖杂合抗体、或变更的抗体、以及其片段，包括fc片段。抗体可以使用如本文所述的常规技术片段化并且按照与对于全抗体所述的方式相同的方式筛选所述片段以加以利用。
[0138]
如本发明中所用，对于抗体，它的天然状态下伴随它的那些污染物或在获得抗体
的过程中产生或使用的那些污染物不被涉及其中。本发明中所述抗体包括天然、重组、或合成产生的抗体。
[0139]
设想的是，许多不同的岩藻糖基化的糖蛋白可以根据本发明提供的方法进行修饰或用于其他修饰分子与末端糖结合，包括治疗性蛋白如抗体(利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕托珠单抗、阿达木单抗、达利珠单抗、依法利珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、莫罗单抗-cd3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、i-131托西莫单抗、依法利珠单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、ign101、伏洛昔单抗、抗cd80mab、抗cd23mab、艾拉普妥珠单抗、马妥珠单抗、扎木单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、地诺单抗、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、奥瑞珠单抗、贝利单抗、依帕珠单抗、mln1202、维西珠单抗、托珠单抗、奥克尔利珠单抗、聚乙二醇化赛妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、兰尼子木单抗、美泊利单抗)。
[0140]
可以对改造的糖蛋白，如抗体进行任何进一步的结构修饰，这些结构修饰包括但不限于糖基化修饰和选择性连接(例如点击化学)以引入另外的功能分子或标签。功能性分子可以是任何合适的类型，包括用于偶联制备抗体药物偶联物的毒素分子、特殊抗原、放射性物质、光敏性物质、聚乙二醇peg、酶等。
[0141]
在本技术中，在复杂型聚糖结构中，符号
▲
表示岩藻糖，
●
表示甘露糖，
○
表示半乳糖，
■
表示n-乙酰氨基葡萄糖，
◆
表示唾液酸。
[0142]
在本技术中，在糖结构中的“ox”可指代噁唑啉。
[0143]
下文中简写化学品所对应的的中文全称如下：
[0144]
dmf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n，n-二甲基甲酰胺
[0145]
smcc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
[0146]
nhs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n-羟基丁二酰亚胺
[0147]
edci
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
[0148]
tfa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三氟乙酸
[0149]
pbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
磷酸盐缓冲液
[0150]
peg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚乙二醇
[0151]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施不限于此。
[0152]
i.通用操作
[0153]
通用操作1：fc结合肽的环化
[0154]
在反应管中加入线性的fc结合肽(20mm的dmso溶液，100μl)，之后加入氨水(400mm，100μl)，再加入双氧水(40mm，100μl)，最后加入双蒸水(100μl)，混匀，室温反应4小时。
[0155]
通用操作2：马来酰亚胺结构的peg片段修饰
[0156]
在反应管中加入dmf(140μl)，加入一端是羧酸，一端是氨基的peg片段(500mm的dmf溶液，20μl)，之后加入smcc(600mm的dmf溶液，20μl，1.2当量)，混匀；之后加入dipea(600mm的dmf溶液，20μl，1.2当量)，混匀。室温反应2小时。
[0157]
通用操作3：马来酰亚胺修饰结构的nhs酯化(a-l-e结构中的l部分)
[0158]
在反应管中加入dmf(120μl)，加入上述通用操作2制备的已被peg片段修饰的马来
酰亚胺修饰结构(500mm的dmf溶液，20μl)，之后加入nhs(1m的dmf溶液，20μl，2当量)，混匀；之后加入edci(1m的dmf溶液，20μl，2当量)，混匀；最后加入dipea(1m的dmf溶液，20μl，2当量)，混匀。室温反应12小时。
[0159]
通用操作4：fc结合肽上马来酰亚胺结构的引入(a-l-e结构中的a-l部分)
[0160]
在反应管中加入dmf(70μl)，之后加入smcc或上述通用操作3制备的nhs酯化的马来酰亚胺被修饰结构(50mm的dmf溶液，10μl)，之后加入上述通用操作1制备的与糖蛋白fc片段有亲和力的多肽(60mm的dmf溶液，10μl，1.2当量)，混匀；之后加入dipea(60mm的dmf溶液，10μl，1.2当量)，混匀。室温反应2小时。
[0161]
通用操作5：修饰后的fc结合肽与d165a上的半胱氨酸残基反应形成偶联物(a-l-e)
[0162]
在反应管中加入endo-f3或其突变体(例如d165a)(27mg/ml的pbs溶液，10μl)，之后加入磷酸盐缓冲液(50mm，ph 7.5，88μl)，混匀；最后加入引入了上述通用操作4制备的含有马来酰亚胺结构的fc结合肽(5mm的dmso溶液，2μl，2当量)，混匀，室温反应2.5小时。
[0163]
通用操作6：市售抗体的去糖基化
[0164]
在反应管中加入市售的抗体(10mg)，加入磷酸盐缓冲溶液(50mm，ph6.5，830μl)，混匀，加入endo-s(0.249μg)，混匀，于37℃下反应12小时。
[0165]
通用操作7：抗体的糖基化修饰过程
[0166]
在反应管中先加入上述通用操作6制备的去糖基化的抗体(1mg)，加入磷酸盐缓冲溶液(50mm，ph7.4,200μl)，混匀；加入噁唑啉(0.2μmol)，混匀；加入上述通用操作5制备的fcbp-d165a偶联物(20μg)，混匀。于30℃下反应1小时。
[0167]
通用操作8：小分子的纯化方法
[0168]
使用装备了半制备性色谱柱(waters，c18，obd，5μm，19
×
250mm)的半制备型高效液相色谱仪(beijing chuangxintongheng lc3000)，流动相a：双蒸水(溶有0.1％的液相色谱级tfa)，流动相b：液相色谱级乙腈(溶有0.1％的液相色谱级tfa)，色谱柱用流动相稳定梯度洗脱，洗脱梯度为2％到90％流动相b，洗脱时间为40分钟。
[0169]
通用操作9：fcbp-d165a偶联物的纯化方法
[0170]
将上一步的反应溶液转移至最大截留为10kda的超滤管中，在4℃下，以8000r/min的转速，离心10分钟，加入200μl的pbs缓冲液，以上述条件再次离心10分钟，重复两次。将离心所得的浓缩液用蛋白浓度试剂盒测定最终产物浓度。
[0171]
通用操作10：抗体的纯化方法
[0172]
使用蛋白a亲和法纯化。纯化抗体质量和蛋白a的柱体积比值为2mg：100μl。将蛋白a填装进上样管中，使用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph7.4)洗脱蛋白a，洗脱30次，每次1个柱体积；将反应液上样，洗脱下来的反应液重复上样8次；使用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph7.4)洗脱30次，每次1个柱体积，每次将蛋白a吹散；使用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph5.05)洗脱30次，每次1个柱体积，每次将蛋白a吹散；使用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph3.04，含0.1m甘氨酸)洗脱10次，每次1个柱体积，每次洗脱的液体单独收集并用tris-hcl(0.2m，ph8.5)调节ph为7.0；合并洗脱液转移至最大截留为30kda的超滤管中在4℃于4500转/分钟下离心10分钟。加入两倍柱体积量的pbs缓冲液，离心10分钟，重复两次。将离心所得的浓缩液用蛋白浓度试剂盒测定最终产物浓度。
[0173]
ii.a-l的具体合成实例
[0174]
实施例1：fcbp1-mcc的合成
[0175][0176]
(1)线性fcbp1由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0177]
(2)步骤(1)的纯化物与smcc由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0178]
实施例2：fcbp1-peg
4-mcc的合成
[0179][0180]
(1)线性fcbp1由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0181]
(2)smcc与peg4片段由通用操作2处理，由通用操作8纯化；
[0182]
(3)步骤(2)的纯化物由通用操作3处理，由通用操作8纯化；
[0183]
(4)步骤(1)的纯化物与步骤(3)的纯化物由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0184]
实施例3：fcbp1-peg
8-mcc的合成
[0185][0186]
(1)线性fcbp1由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0187]
(2)smcc与peg8片段由通用操作2处理，由通用操作8纯化；
[0188]
(3)步骤(2)的纯化物由通用操作3处理，由通用操作8纯化；
[0189]
(4)步骤(1)的纯化物与步骤(3)的纯化物由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0190]
实施例4：fcbp2-mcc的合成
[0191][0192]
(1)线性fcbp2由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0193]
(2)步骤(1)的纯化物与smcc由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0194]
实施例5：fcbp2-peg
4-mcc的合成
[0195][0196]
(1)线性fcbp2由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0197]
(2)smcc与peg4片段由通用操作2处理，由通用操作8纯化；
[0198]
(3)步骤(2)的纯化物由通用操作3处理，由通用操作8纯化；
[0199]
(4)步骤(1)的纯化物与步骤(3)的纯化物由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0200]
实施例6：fcbp2-peg
8-mcc的合成
[0201][0202]
(1)线性fcbp2由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0203]
(2)smcc与peg8片段由通用操作2处理，由通用操作8纯化；
[0204]
(3)步骤(2)的纯化物由通用操作3处理，由通用操作8纯化；
[0205]
(4)步骤(1)的纯化物与步骤(3)的纯化物由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0206]
实施例7：fcbp3-mcc的合成
[0207][0208]
(1)线性fcbp3由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0209]
(2)步骤(1)的纯化物与smcc由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0210]
实施例8：fcbp3-peg
4-mcc的合成
[0211][0212]
(1)线性fcbp3由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0213]
(2)smcc与peg4片段由通用操作2处理，由通用操作8纯化；
[0214]
(3)步骤(2)的纯化物由通用操作3处理，由通用操作8纯化；
[0215]
(4)步骤(1)的纯化物与步骤(3)的纯化物由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0216]
实施例9：fcbp3-peg
8-mcc的合成
[0217][0218]
(1)线性fcbp3由通用操作1处理，以通用操作8纯化；
[0219]
(2)smcc与peg8片段由通用操作2处理，由通用操作8纯化；
[0220]
(3)步骤(2)的纯化物由通用操作3处理，由通用操作8纯化；
[0221]
(4)步骤(1)的纯化物与步骤(3)的纯化物由通用操作4处理，由通用操作8纯化。
[0222]
iii.a-l-e的具体合成实例
[0223]
实施例10：fcbp1-mcc-d165a的合成
[0224][0225]
fcbp1-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0226]
实施例11：fcbp1-peg4-mcc-d165a的合成
[0227][0228]
fcbp1-peg4-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0229]
实施例12：fcbp1-peg8-mcc-d165a的合成
[0230][0231]
fcbp1-peg8-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0232]
实施例13：fcbp2-mcc-d165a的合成
[0233][0234]
fcbp2-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0235]
实施例14：fcbp2-peg4-mcc-d165a的合成
[0236][0237]
fcbp2-peg4-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0238]
实施例15：fcbp2-peg8-mcc-d165a的合成
[0239][0240]
fcbp2-peg8-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0241]
实施例16：fcbp3-mcc-d165a的合成
[0242][0243]
fcbp3-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0244]
实施例17：fcbp3-peg4-mcc-d165a的合成
[0245][0246]
fcbp3-peg4-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0247]
实施例18：fcbp3-peg8-mcc-d165a的合成
[0248][0249]
fcbp3-peg8-mcc与和cpd融合的endo f3-d165a由通用操作5处理，由通用操作9纯化。
[0250]
iv.利用上述制备的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶(a-l-e)的抗体糖基化改造
[0251]
实施例19：s2g2f-利妥昔单抗的合成
[0252]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0253]
(2)sct噁唑啉的制备：
[0254][0255]
在反应管中加入唾液酸糖肽(10μmol,1eq)和磷酸缓冲液(50mm，ph6.5，100μl)，用1m盐酸和1m氢氧化钠调节ph至6.5，往上述混合体系中加入endo-m(30mg/ml，1.7μl)，30℃孵育，6h后使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，得到含glcnac-peptide和唾液酸化复杂型寡糖链的反应体系。往上述反应体系中依次加入蒸馏水(390μl)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(150μmol,15eq)和三乙胺(450μmol,45eq)，混合均匀后置于冰上反应2h，得到含唾液酸化复杂型寡糖链噁唑啉(即sct噁唑啉)的反应体系，可使用葡聚糖g-25凝胶柱纯化，收集产物部分冷冻干燥。
[0256]
(3)步骤(1)的纯化物与步骤(2)的sct噁唑啉反应由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0257]
实施例20：man3-利妥昔单抗的合成
[0258]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0259]
(2)man3-ox的制备：
[0260][0261]
在反应管中加入唾液酸糖肽(10μmol,1eq)和磷酸缓冲液(50mm，ph6.5，100μl)，用1m盐酸和1m氢氧化钠调节ph至6.5，往上述混合体系中加入endo-m(30mg/ml，1.7μl)，再加入额外的唾液酸苷酶、β1,4半乳糖苷酶和β乙酰葡萄糖胺糖苷酶，于30℃孵育，6h后使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，得到含核心四糖糖链的反应体系。往上述反应体系中依次加入蒸馏水(390μl)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(150μmol,15eq)和三乙胺(450μmol,45eq)，混合均匀后置于冰上反应2h，得到核心四糖噁唑啉(即man3噁唑啉)的反应体系，可使用葡聚糖g-25凝胶柱纯化，收集产物部分冷冻干燥。
[0262]
(3)步骤(1)的纯化物与步骤(2)的man3噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0263]
实施例21：gn2m3-利妥昔单抗的合成
[0264]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0265]
(2)gn2m3-ox的制备：
[0266][0267]
在反应管中加入唾液酸糖肽(10μmol,1eq)和磷酸缓冲液(50mm，ph6.5，100μl)，用1m盐酸和1m氢氧化钠调节ph至6.5，往上述混合体系中加入endo-m(30mg/ml，1.7μl)，再加入额外的唾液酸苷酶、β1,4半乳糖苷酶，于30℃孵育，6h后使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，得到含去半乳糖化寡糖糖链的反应体系。往上述反应体系中依次加入蒸馏水(390μl)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(150μmol,15eq)和三乙胺(450μmol,45eq)，混合均匀后置于冰上反应2h，得到去半乳糖化寡糖噁唑啉(即gn2m3噁唑啉)的反应体系，可使用葡聚糖g-25凝胶柱纯化，收集产物部分冷冻干燥。
[0268]
(3)步骤(1)的纯化物与步骤(2)的gn2m3噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0269]
实施例22：g2f-利妥昔单抗的合成
[0270]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0271]
(2)ct-ox的制备
[0272][0272][0273]
在反应管中加入唾液酸糖肽(10μmol,1eq)和磷酸缓冲液(50mm，ph6.5，100μl)，用1m盐酸和1m氢氧化钠调节ph至6.5，往上述混合体系中加入endo-m(30mg/ml，1.7μl)，再加
入额外的唾液酸苷酶，于30℃孵育，6h后使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，得到含复杂寡糖糖链的反应体系。往上述反应体系中依次加入双蒸水(390μl)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(150μmol,15eq)和三乙胺(450μmol,45eq)，混合均匀后置于冰上反应2h，得到复杂寡糖噁唑啉(即ct噁唑啉)的反应体系，可使用葡聚糖g-25凝胶柱纯化，收集产物部分冷冻干燥。
[0274]
(3)步骤(1)的纯化物与步骤(2)的ct噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0275]
实施例23：az-s2g2f-利妥昔单抗的合成
[0276]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0277]
(2)az-sct-ox的制备
[0278][0279]
在反应管中加入唾液酸糖肽(100μmol,1eq)和磷酸缓冲液(50mm，ph6.5，1ml)，用1m盐酸和1m氢氧化钠调节ph至6.5，往上述混合体系中加入endo-m(30mg/ml，17μl)，再加入额外的唾液酸苷酶，于30℃孵育，6h后使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱分析，显示反应完全，得到含复杂寡糖糖链的反应体系。可先使用半制备型高效液相色谱纯化，再使用葡聚糖g-25凝胶柱用水纯化洗脱，收集产物部分冷冻干燥得到唾液酸化复杂型寡糖sct。
[0280]
取上述sct(100mg)在反应管中溶于磷酸缓冲液(50mm，ph 7.1，5ml)，加入高碘酸钠水溶液(43mm，5ml)，搅拌于冰浴上避光反应15分钟，使用葡聚糖g-25凝胶柱用水纯化洗脱，收集产物部分冷冻干燥得到醛基sct(cho-sct)。
[0281]
取上述醛基sct(20mg)在反应管中溶于磷酸缓冲液(50mm，ph 7.5，200μl)，加入o-(2-叠氮基乙基)羟胺盐酸盐(市售，42.2μmol，4eq)，在室温下搅拌2小时，使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱分析，显示反应完全，再使用半制备型高效液相色谱纯化，收集产物部分冷冻干燥得到az-sct。
[0282]
将上述纯化的产物az-sct溶于双蒸水(200μl)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(158μmol,15eq)和三乙胺(474μmol,45eq)，混合均匀后置于冰上反应2h，得到的az-sct-ox反应体系，可使用葡聚糖g-25凝胶柱用水洗脱纯化，收集产物部分冷冻干燥得到az-sct-ox。
[0283]
(3)步骤(1)的纯化物与步骤(2)的az-sct噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0284]
实施例24：带有功能性物质cy3-利妥昔单抗的合成
[0285]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0286]
(2)步骤(1)的纯化物与实施例23制备的az-sct噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0287]
(3)在反应管中加入磷酸盐缓冲液(50mm,ph 7.5，2ml)，加入叠氮基团标记抗体(0.5mg/ml，1mg)与dbco-cy3(61μg,10当量)于30℃下反应8小时。
[0288]
实施例25：s2g2f-曲妥珠单抗的合成
[0289]
(1)市售曲妥珠单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0290]
(2)步骤(1)的纯化物与实施例19制备的sct噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0291]
实施例26：az-s2g2f-曲妥珠单抗的合成
[0292]
(1)市售曲妥珠单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0293]
(2)步骤(1)的纯化物与实施例23制备的az-sct噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。
[0294]
实施例27：不同fcbp-d165a偶联物的转糖基效率比较实验
[0295]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0296]
(2)步骤(1)的纯化物、sct噁唑啉分别用fcbp1-mcc-d165a、fcbp1-peg4-mcc-d165a、fcbp1-peg8-mcc-d165a、fcbp2-mcc-d165a、fcbp2-peg4-mcc-d165a、fcbp2-peg8-mcc-d165a、fcbp3-mcc-d165a、fcbp3-peg4-mcc-d165a和fcbp3-peg8-mcc-d165a由通用操作7处理，在15分钟、在30分钟、60分钟、120分钟取样由sds-page分析比较，结果如图7所示，此九种fcbp-d165a偶联物的转糖基效率相较于原始的endo f3-d165a都有显著提升；同时，其中fcbp2-peg8-mcc-d165a和fcbp3-peg8-mcc-d165a效果最佳，fcbp1-peg4-mcc-d165a、fcbp1-peg8-mcc-d165a、fcbp2-mcc-d165a、fcbp2-peg4-mcc-d165a、fcbp3-mcc-d165a、fcbp3-peg4-mcc-d165a略弱于fcbp2-peg8-mcc-d165a和fcbp3-peg8-mcc-d165a，而fcbp1-mcc-d165a的转糖基效率是九种fcbp-d165a偶联物最弱的，但依然比原始的endo f3-d165a有明显提升。
[0297]
实施例28：不同sct噁唑啉浓度下的转糖基效率比较实验
[0298]
(1)市售利妥昔单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0299]
(2)步骤(1)的纯化物分别与0.5mm、1mm或2mm的sct噁唑啉分别用endo-f3 d165a、fcbp2-mcc-d165a、fcbp2-peg4-mcc-d165a和fcbp2-peg8-mcc-d165a由通用操作7处理，在15分钟、在30分钟、60分钟、120分钟取样由sds-page分析比较，结果如图8所示。在同浓度的sct噁唑啉下，均显示fcbp2-peg8-mcc-d165a的效率最高，其次是fcbp2-peg4-mcc-d165a，相较于endo-f3 d165a两者均显著提高转糖基效率；而以同种fcbp-d165a偶联物催化下，1mm与2mm的sct噁唑啉浓度下效率几乎相同，两者相较于0.5mm的sct噁唑啉而言效率均更高，故最终选定1mm浓度的sct噁唑啉即可。
[0300]
实施例29：功能性片段(生物素化)修饰抗体的合成
[0301]
(1)市售曲妥珠单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0302]
(2)生物素化寡糖噁唑啉制备：
[0303][0304]
按实施例23中所制得的醛基sct(20mg)在反应管中溶于磷酸缓冲液(50mm，ph 7.5，200μl)，加入biotin-nh2(市售，52.8μmol，5eq)，在室温下搅拌2小时，使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱分析，显示反应完全，再使用半制备型高效液相色谱纯化，收集产物部分冷冻干燥得到biotin-sct。
[0305]
将上述纯化的产物biotin-sct溶于双蒸水(200μl)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(158μmol,15eq)和三乙胺(474μmol,45eq)，混合均匀后置于冰上反应2h，得到的biotin-sct-ox反应体系，可使用葡聚糖g-25凝胶柱用水洗脱纯化，收集产物部分冷冻干燥得到biotin-sct噁唑啉(biotin-sct-ox)。
[0306]
(3)步骤(1)的纯化物与biotin-sct噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化，实验结果如图11所示。
[0307]
实施例30：功能性片段(药物分子)修饰抗体的合成
[0308]
(1)市售曲妥珠单抗由通用操作6处理，以通用操作10纯化。
[0309]
(2)药物-寡糖噁唑啉制备：
[0310][0311]
按实施例23中所制得的醛基sct(20mg)在反应管中溶于磷酸缓冲液(50mm，ph 7.5，100μl)与甲醇(100μl)的混合液中，加入nh2o-va-pab-mmae(市售，31.7μmol，3eq)，加入氰基硼氢化钠(市售，21..1μmol，2eq)在冰浴上搅拌3小时，使用分析型hplc监测反应体系并进行质谱分析，显示反应完全，再使用半制备型高效液相色谱纯化，收集产物部分冷冻干燥得到药物-寡糖(mmae-sct)。
[0312]
将上述纯化的产物mmae-sct溶于双蒸水(200μl)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(158μmol,15eq)和三乙胺(474μmol,45eq)，混合均匀后置于冰上反应2h，得到的mmae-sct-ox反应体系，可使用葡聚糖g-25凝胶柱用水洗脱纯化，收集产物部分冷冻干燥得到mmae-sct噁唑啉(mmae-sct-ox)。
[0313]
(3)步骤(1)的纯化物与mmae-sct噁唑啉由通用操作7处理，由通用操作10纯化。

技术特征：
1.一种亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其结构如下式(i)所示：a-l-e
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(i)其中，a为亲和片段，所述亲和片段为fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列的片段，e为糖苷内切酶或其突变酶部分，l为连接亲和片段a及糖苷内切酶或其突变酶部分e的连接子。2.根据权利要求1所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，所述fc亲和多肽为包含以下式(ii)所示的核心序列的fc亲和多肽：在上式ii中，氨基酸序列结构为n端到c端排列，cys表示半胱氨酸残基，两个半胱氨酸通过二硫键连接，x
s1
和y
s2
表示与半胱氨酸连接的s1个或s2个氨基酸残基，s1和s2各自独立地为0、1、2或3；下标t1和t2分别表示与半胱氨酸连接的s1个氨基酸残基x
s1
及s2个氨基酸残基y
s2
的重复次数，其各自独立为0-10的整数；aa1-aa9分别表示天然或非天然氨基酸残基。3.根据权利要求2所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，在式(ii)中，aa1、aa2、aa3、aa5、aa7、aa8和aa9各自独立地为不为半胱氨酸残基的氨基酸残基，并且aa4和aa6之一为侧链含nh2基团的氨基酸残基，如赖氨酸残基(k)、鸟氨酸残基(orn)、精氨酸残基(r)，并且，当aa4或aa6其中一个氨基酸为含有氨基结构时，另一个为除该氨基酸及半胱氨酸以外的任意氨基酸。4.根据权利要求2所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，在式(ii)中，aa1为丙氨酸残基(a)、或甘氨酸残基(g)；aa2为酪氨酸残基(y)、或苯丙氨酸残基(f)；aa3为组氨酸残基(h)、苯丙氨酸残基(f)、酪氨酸残基(y)或甘氨酸残基(g)；aa4为赖氨酸残基(k)、或谷氨酰胺残基(q)；aa5为甘氨酸残基(g)、丝氨酸残基(s)、天冬酰胺残基(n)、谷氨酰胺残基(q)、天冬氨酸残基(d)、谷氨酸残基(e)、苯丙氨酸残基(f)、酪氨酸残基(y)、色氨酸残基(w)、组氨酸残基(h)、苏氨酸残基(t)、亮氨酸残基(l)、丙氨酸残基(a)、缬氨酸残基(v)、异亮氨酸残基(i)、或精氨酸残基(r)；aa6为赖氨酸残基(k)、或苯丙氨酸残基(f)；aa7为亮氨酸残基(l)、异亮氨酸残基(i)或正亮氨酸残基(nle)；aa8为缬氨酸(v)、异亮氨酸残基(i)、或亮氨酸残基(l)；aa9为色氨酸残基(w)、或苯丙氨酸残基(f)。5.根据权利要求2所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，所述亲和片段a选自以下环肽结构：
其中，多肽从左至右为n端到c端，ac表示n端的乙酰化，-nh2表示c端的胺化，代表与式(i)其他部分的连接位置。6.根据权利要求2所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，所述fc亲和多肽(称为fcbp)选自以下：
其中，在以上各结构式中，*表示为fcbp与连接子l的连接位置，优选地，fcbp与连接子l通过酰胺键连接。7.根据权利要求1所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，在式(i)中，所述l为具有双功能团结构的双价连接子，优选其结构中包括聚乙二醇、脂肪烃、酰胺键、酯、硫酯、马来酰亚胺结构，更优选地，l选自以下：
m和n各自独立为0-30的整数；其中代表连接位点，还更优选地，l为n为0-8之间的整数。8.根据权利要求1所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，在式(i)中，所述糖苷内切酶或其突变酶部分e的糖苷内切酶或其突变酶选自：酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)来源的糖苷内切酶endo-s，或其突变酶；酿脓链球菌血清型m49(streptococcus pyogenes serotype m49)来源的糖苷内切酶endo-s2，或其突变酶；肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)来源的糖苷内切酶endo-d，或其突变酶；嗜粉菌
(coprinopsis cinerea)来源的糖苷内切酶endo-cc，或其突变酶；秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)来源的糖苷内切酶endo-ce，或其突变酶；毛霉菌(mucor hiemalis)来源的糖苷内切酶endo-m，或其突变酶；原生节杆菌(arthrobacter protophormiae)来源的糖苷内切酶endo-a，或其突变酶；脑膜败血伊丽莎白菌(elizabethkingia meningoseptica)来源的糖苷内切酶endo-f1，或endo-f2，或endo-f3，或其突变酶；链霉菌(streptomyces plicatus)来源的糖苷内切酶endo-h，或其突变酶；ogatea minuta来源的糖苷内切酶endo-om，或其突变酶；脑膜败血伊丽莎白菌(elizabethkingia meningoseptica)来源的糖苷内切酶endo-f3，或其突变酶，优选地，所述糖苷内切酶或其突变酶为脑膜败血伊丽莎白菌(elizabethkingia meningoseptica)来源的糖苷内切酶endo-f3，或氨基酸序列为seq id no.1的糖苷内切酶endo-f3的突变酶d165a(endo-f3 d165a)；或者为包含与seq id no:1序列具有80％以上，例如85％，90％，95％，98％的同源性序列的酶，进一步优选地，在式(i)中，所述糖苷内切酶或其突变酶部分的糖苷内切酶的突变酶为与半胱氨酸蛋白酶结构域(cpd)融合的糖苷内切酶或其突变酶，例如，与cpd融合的endo-f3 d165a。9.根据权利要求1所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，所述l连接到e的半胱氨酸的巯基、赖氨酸的氨基、n端的氨基、精氨酸的胍基、丝氨酸的羟基、酪胺酸的羟基、谷氨酸的羧基或者天冬氨酸的羧基，优选地，所述l连接在e的半胱氨酸的巯基，例如l连接在氨基酸序列为seq id no:1的糖苷内切酶endo-f3的突变酶d165a(endo-f3 d165a)的部分e的半胱氨酸残基；和/或所述l连接在a的氨基、羟基、羧基、巯基或胍基基团，优选地，l连接在a的氨基，例如l连接在a的赖氨酸残基，例如赖氨酸(k)或精氨酸(r)的氨基或n端氨基。10.根据权利要求1所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其中，所述亲和片段共价修饰的糖苷内切酶选自以下各结构：
其中，n为大于0的整数，例如n为4或8，以上各结构式中的结构片段d165a-cpd表示与cpd融合的endo-f3 d165a。11.一种通过权利要求1-10中任一项所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：s1.fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列与连接子化合物通过化学方法形成共价结构，以及s2.步骤s1形成的共价结构与糖苷内切酶或其突变体反应形成式(i)的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶；或者，所述方法包括以下步骤：s1’.糖苷内切酶或其突变体与连接子化合物l通过化学方法形成共价结构，以及s2’.步骤s1’形成的共价结构与fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列反应形成式(i)的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，在所述方法中，所述糖苷内切酶通过化学全合成方法合成或为来自于细菌表达的天然糖苷内切酶或其突变型，以及所述fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列通过化学全合成方法合成或为来自于天然存在的fc亲和多肽、protein a或g蛋白或其同源序列。12.如权利要求1-10中任一项所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶在糖工程抗体的糖基化改造中的应用。13.一种基于亲和片段共价修饰的糖苷内切酶制备岩藻糖基化的糖蛋白的方法，所述方法包括：在如权利要求1-10中任一项所述的a-l-e表示的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的作用下，将不同单一结构的n-糖链噁唑啉底物连接至糖蛋白上，得到糖基化改造的糖蛋白，优选地，在所述糖蛋白是抗体的情况下，所述方法如下进行：如以上反应式所示，在n-糖链噁唑啉底物ox中，r为单糖、聚糖，或携带标签的单糖或聚糖，
■
表示n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)，表示岩藻糖(fuc)，抗体的糖基化位点为fc保守糖基化位点，所述方法包括：(a)提供一种含有核心岩藻糖化glcnac的受体蛋白，该蛋白来自于化学全合成方法或来自于糖苷内切酶处理的天然糖蛋白；(b)在如权利要求1-10中任一项所述的a-l-e表示的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶的作用下，不同单一结构的n-糖链噁唑啉底物连接至所述核心岩藻糖化glcnac的受体蛋白
上，得到fc结构域的糖基化改造的糖蛋白。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述糖蛋白是抗体、fc片段、或者含有fc片段的融合蛋白，优选地，所述糖蛋白是去糖基化的岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的抗体；优选地，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体、人源fc片段、或者含有人源fc片段的抗体或融合蛋白；所述n-糖链噁唑啉底物为天然的n-聚糖噁唑啉或者人为合成的聚糖噁唑啉，优选地，所述人为合成的聚糖噁唑啉是二糖噁唑啉、三糖噁唑啉、四糖噁唑啉、五糖噁唑啉、六糖噁唑啉、七糖噁唑啉、八糖噁唑啉、九糖噁唑啉、十糖噁唑啉、十一糖噁唑啉、十二糖噁唑啉、十三糖噁唑啉或十四糖噁唑啉，或其带有标签的糖结构；所述标签包括毒素、药物、生物正交基团、荧光探针、聚乙二醇、脂质、多肽、纳米抗体、dna及相关药物、rna及相关药物、胆固醇、抗生素或放射性同位素标记、造影剂、核磁共振成像剂，优选地，所述生物正交基团选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基。15.一种一锅法制备糖工程抗体的方法，所述方法包括：s1：在β-n-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶及其突变酶特异性水解作用下，igg抗体的fc结构域的n-聚糖水解，得到糖型结构为岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的抗体，以及s2：在权利要求1-10中任一项所述的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶作用下，将不同单一结构的n-糖链噁唑啉底物(ox)连接至s1水解得到的抗体上，得到fc结构域的糖基化改造的糖工程抗体。16.一种基于抗体保守糖基化位点的功能性抗体的制备方法，所述方法包括：s1：将n-单糖或n-聚糖先末端氧化获得醛基活性基团，再通过羟胺缩合或还原胺化获得带有生物正交基团的n-单糖或n-聚糖，然后通过环合反应获得带有生物正交基团的n-糖链噁唑啉底物(ox)；s2：通过如权利要求15所述的一锅法制备糖工程抗体方法获得带有生物正交基团的糖工程抗体，生物正交基团共价修饰在抗体的糖基化位点；以及s3：通过生物正交反应，将功能性分子共价偶联到抗体的糖基化位点，获得如下式(iv)所示的功能性分子修饰的抗体：ab-g-l1-b
’‑
l2-f
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(iv)，其中，ab为抗体，g为抗体fc保守糖基化位点，l1为连接聚糖和生物正交基团的连接片段，优选地，为n1为0-10的整数；b’为生物正交反应形成的连接片段，优选地，选自以下
n2为0-10的整数；l2为连接f和生物正交基团的连接片段；优选地，l2选自以下：m和n3各自独立为0-30的整数；f为功能性分子的片段；在以上各结构式中，代表连接位点，优选地，所述生物正交基团选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基。
17.一种基于抗体保守糖基化位点的功能性抗体的制备方法，所述方法包括：s1：n-聚糖先末端氧化获得醛基活性基团，再通过羟胺缩合、还原胺化或酰胺缩合获得带有功能性分子的n-聚糖，然后通过环合反应制备得到如式(v)所示的带有功能性分子的聚糖噁唑啉结构：f-l3-g-ox
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(v)在式(v)中，f为功能性分子的片段，g为聚糖结构，l3为偶联f与g的连接片段，其中，l3与权利要求16中l1的定义相同，或者l3为权利要求16中l1和l2的组合或l1、b’和l2的组合；ox代表噁唑啉结构；以及s2：运用如权利要求15所述的一锅法制备糖工程抗体的方法，直接获得如式(vi)所示带有功能性分子的抗体：f-l3-g-ab
ꢀꢀꢀꢀ
(vi)在式(vi)中，f、l3、g分别如式v中所定义，ab表示抗体。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，所述功能性分子包括：毒素、药物、生物正交基团、荧光探针、聚乙二醇、脂质、多肽、纳米抗体、dna及相关药物、rna及相关药物、胆固醇、抗生素或放射性同位素标记、造影剂或核磁共振成像剂，或它们的任意组合。

技术总结
本发明涉及一类亲和片段共价修饰的糖苷内切酶，其制备方法及在糖蛋白的糖基化改造中的应用。本发明的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶由式(I)：A-L-E表示，其中，A为亲和片段，所述亲和片段为Fc亲和多肽、Protein A或G蛋白或其同源序列的片段，E为糖苷内切酶或其突变酶部分，L为连接亲和片段A及糖苷内切酶或其突变酶部分E的连接子。相对于未经修饰的糖苷内切酶，本发明提供的亲和片段共价修饰的糖苷内切酶与抗体的亲和力得到增强，从而可用于增强抗体糖基化改造的效率。糖基化改造的效率。


技术研发人员：黄蔚 唐峰 邹湘曼 刘志
受保护的技术使用者：中国科学院上海药物研究所
技术研发日：2022.02.10
技术公布日：2023/8/24