用于颊部释放蛋白质的系统

用于颊部释放蛋白质的系统
1.本发明涉及用于颊部释放蛋白质的粘膜粘附贴剂形式的系统。


背景技术：

2.医药产品的口服给药是最广泛使用的给药途径。然而，由于蛋白质对胃肠道酶的作用高度敏感，很难通过这种途径释放具有治疗意义的蛋白质。颊粘膜代表了一种有吸引力的替代给药途径，因为它使得可以避免首过效应，具有低酶活性和生理ph范围，并且在解剖学上可及且血管化良好。因此，颊部释放系统可以提供蛋白质的局部(粘膜)释放或全身(跨粘膜)释放。
3.仍然对如下粘膜粘附系统存在着尚未满足的需求：该系统具有优化的渗透能力，将有助于显著减少所给药的治疗剂量，以及更好地控制吸收。


技术实现要素：

4.为解决这一需求，发明人开发出一种由两种多糖的组合组成的粘膜粘附贴剂：壳聚糖(chi)以及阴离子多糖，如透明质酸(hya)。
5.附着到颊部或舌下粘膜上的本发明的贴剂称为“颊部”或“舌下”贴剂。
6.本发明因此提供了一种粘膜粘附贴剂，该粘膜粘附贴剂旨在用于颊部或舌下释放蛋白质或多肽，所述贴剂包含至少100个双层，这些双层各自由一个壳聚糖(chi)层以及一个分子量为500至1000kda的阴离子多糖或其盐的层构成，与粘膜接触的层以及与贴剂的颊部或舌下环境接触的层由壳聚糖(chi)组成，所述蛋白质或所述多肽被引入所述贴剂中并且/或者吸附在所述贴剂的表面上。
7.在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种包含蛋白质或多肽的颊部或舌下粘膜粘附贴剂，所述贴剂包含100至200个双层，这些双层各自由一个壳聚糖(chi)层以及一个分子量为500至1000kda的阴离子多糖或其盐的层构成，所述阴离子多糖是透明质酸，与粘膜接触的层以及与贴剂的颊部或舌下环境接触的层由壳聚糖(chi)组成，所述蛋白质或所述多肽被引入所述贴剂中并且/或者吸附在所述贴剂的表面上，并且旨在用于颊部或舌下释放。
8.由于存在能够降解这两种多糖的酶，该贴剂是自支撑的并溶解在唾液中。
9.本发明进一步涉及一种用于产生所述贴剂的方法，该方法包括由以下组成的步骤：
10.i)通过在基底上逐层沉积的方法来形成chi/阴离子多糖多层膜；
11.ii)将所述多层膜从基底上分离；
12.iii)使多层膜与蛋白质接触，由此多层膜负载蛋白质。
13.本发明进一步涉及可通过如此处所述的方法获得的根据本发明的贴剂。
附图说明
14.图1：(chi/hya)
100
自支撑膜的厚度和降解曲线.(a)膜厚度，作为hya分子量(660或
1020kda，分别对应于hya.lw和hya.hw)或沉积时间的变化的函数：短周期或长周期。使用具有一个受控因素的anova测试来确定两组之间差异的统计显著性：ns，不显著；****p《0.0001。(b)浸入人工唾液中的膜的降解曲线，表示为作为膜的不同制备参数的函数的重量损失百分比。(c)浸入人工唾液中30分钟、1小时或3小时的短周期(chi/hya
660
)-chi膜的扫描电镜(sem)图像。比例尺对应于44μm。(d)处于人工唾液中30分钟、3小时、6小时或24小时后通过共焦显微镜获得的短周期(chi
fitc
/hya
660
)-chi
fitc
膜的图像。对照条件对应于将膜浸入乙酸盐缓冲液中24小时。a、b、c、d、e：膜表面；下部：相同膜的深度截面(z截面)的图像。水平比例尺对应于50μm。
15.图2：膜的降解产物对人上皮细胞未展现毒性.将(a)hela细胞和(b)ho-1u-1细胞与降解产物一起孵育24小时后的细胞活力。膜：(chi/hya)
100
膜；膜.hcl：经盐酸(hcl)处理的(chi/hya)
100
膜。使用具有单一受控因素的anova检验来确定两组之间差异的统计显著性：ns，不显著。
16.图3：通过用hcl处理膜而受控的舌下粘膜炎症.在施用膜或1-氟-2,4-二硝基苯(dnfb)后，在全粘膜(上皮和固有层)中评价粘膜厚度(a)和mhcii阳性(mhcii+)细胞的募集(b)。将原生膜(贴剂)给药30分钟或60分钟，并且将经hcl(hcl贴剂)或nacl(nacl贴剂)处理的膜施用30分钟。提供的每个值对应于来自3个单独个体(n＝3)的至少3次测量的平均值。使用具有单一受控因素的anova检验来确定两组之间差异的统计显著性：*,p《0.05。(c)代表在粘膜水平上mhcii+细胞募集的图像，通过组织学标记获得。比例尺：170μm。(d/e/f)在小鼠中施用膜6小时后所测量的舌和舌下组织中炎性细胞因子的水平：il-1β(d)、il-6(e)和tnf-α(f)。使用具有单一受控因素的anova检验来确定两组之间差异的统计显著性：ns，不显著；*,p《0.05，***p《0.001，****，p《0.0001。
17.图4：在逐层(lbl)组装中由ph变化掺入蛋白质的示意图.在通过蛋白质捕获功能化后，lbl膜变成生物活性贴剂，随时施用。chi：壳聚糖，hya：透明质酸。
18.图5：用alexa fluor 647(ova
alexa f.647
)标记的卵清蛋白的掺入和从膜的释放曲线.(a)在与0.5μg蛋白质于hcl中孵育并用各种缓冲液冲洗后(chi/hya)
100-chi贴剂中ova
alexa f.647
的掺入水平。(b)用各种溶液2小时的冲洗时间内从贴剂释放ova
alexa f.647
的曲线。数据对应于三个独立实验一式三份(n＝3)的平均值和标准误差(
±
sem)。(c，上部)含有ova
alexa f.647
的贴剂的表面的共聚焦显微镜图像，比例尺对应于50μm。(c，下部)贴剂沿(z)轴的深度光学截面。虚线表示贴剂的界限。(d)ova
alexa f.647
和贴剂(chi.
mw.fitc
)沿c(下部)中所显示的箭头的荧光强度。
19.图6：贴剂在舌下粘膜上的保留时间.(a)在贴剂给药后20分钟，用与舌下粘膜接触的苏木精对(chi/hya)
100
贴剂进行染色。比例尺对应于100μm。m＝粘膜，p＝贴剂(b)溶液中或(chi/hya)
100
贴剂中引入的ova
af647
的分子荧光断层扫描。在给药后2、10、或30分钟检测荧光信号。
20.图7：给药贴剂后ova
af647
的组织渗透.在溶液中的ova
af647
给药后2分钟，或者在(chi/hya)
100
贴剂中引入的ova
af647
给药后2分钟、10分钟、30分钟和60分钟，用dapi对细胞核标记的小鼠舌切片的共聚焦显微镜分析。在给药后10分钟在角质化层中(白色箭头)以及在给药后30分钟在粘膜下层中(虚线箭头)观察到ova
af647
。比例尺：20μm。虚线对应于粘膜的界限。
21.图8：贴剂中保留细胞因子ccl20的趋化作用能力.与溶液中的ccl20相比，贴剂释放的ccl20的体外趋化性。使用25ng.ml-1
的浓度来评价dc 2.4细胞的迁移。生长培养基、单独的唾液酶和(chi/hya)
100
膜用于阴性对照。使用具有一个受控因素的anova检验来确定两组之间差异的统计显著性：ns，不显著；*,p《0.05，**p《0.01。
22.图9：(chi/hya)
100-chi或(vis/hya)
100-vis自支撑膜的厚度和降解曲线.(a)根据双层数目的膜厚度：50、100或200个双层，最后一层是hya。由100个双层制成的膜的厚度，最后一层用chi(获自sigma)或(vis)(来自flexichem)产生。每种类型的膜至少测量20次。使用具有单一受控因素的anova检验来确定两组之间的统计显著性：ns，不显著，****,p《0.0001。(b)浸入人工唾液中的膜的降解曲线，表示为作为由chi或vis制成的不同类型膜的函数的重量损失百分比。给出的每个值对应于三个独立实验一式三份(n＝3)的平均值。
23.图10：膜的ova
647
的引入和释放曲线.(a)在与nacl中的0.5μg蛋白质孵育并用各种缓冲液冲洗后(chi/hya)
100-chi贴剂中ova
af647
的引入水平。(b)用各种溶液经2小时的冲洗时间ova
af647
从贴剂的释放曲线。数据对应于三个独立实验一式三份的平均值。(c，上部)含有ova
af647
的贴剂的表面的共聚焦显微镜图像，比例尺对应于50μm。(c，下部)贴剂沿(z)轴的深度光学截面。虚线表示贴剂的界限。(d)ova
af647
和(chi
fitc
)贴剂沿图c(下部)所显示的箭头的荧光强度。
24.图11：示出了通过溶胀或收紧多层膜来捕获蛋白质或多肽的方案。
具体实施方式
25.如下文给出的实例中所示，发明人开发出一种用于颊部或舌下释放蛋白质的粘膜粘附贴剂，确保更好地控制所给药的蛋白质的剂量及其被粘膜的吸收。发明人还展示了该种类贴剂的无毒特征以及在施用该种类贴剂后粘膜不存在炎症。
26.本发明因此涉及一种粘膜粘附贴剂，该粘膜粘附贴剂旨在用于颊部或舌下释放蛋白质或多肽，所述贴剂包含至少100个双层，这些双层各自由一个壳聚糖(chi)层以及一个分子量为500至1000kda的阴离子多糖或其盐的层构成，与粘膜接触的层以及与贴剂的颊部或舌下环境接触的层由壳聚糖(chi)组成，所述蛋白质或所述多肽被引入所述贴剂中并且/或者吸附在所述贴剂的表面上。
27.定义
[0028]“贴剂”意指包含生物活性化合物如蛋白质或多肽的多层粘附系统或多层粘附膜。
[0029]“粘膜粘附”意指如本技术中所定义的贴剂，它可附着到粘膜，优选地颊部或舌下粘膜上。
[0030]“自支撑”意指没有支撑物的结构，其本身的刚度提供其稳定性。
[0031]
术语“受试者”意味着所有人类个体或动物，优选地哺乳动物，如马、羊科(ovidae)、牛、狗、猫等。
[0032]
蛋白质和多肽
[0033]
根据本发明的贴剂允许释放任何感兴趣的蛋白质或多肽。“蛋白质”典型地意指至少100个氨基酸的多肽，或组合在一起的多肽。蛋白质可优选地具有20至200kda的分子量。更具体地，蛋白质可具有低于70kda的分子量，或更高的分子量，例如100至200kda。
[0034]
在感兴趣的蛋白质中，我们可提及到例如抗体(如免疫球蛋白g)。
[0035]
可作为蛋白质片段的多肽典型地具有10至100个氨基酸，更优选地20至80或20至60个氨基酸。
[0036]
在优选的实施方案中，蛋白质或多肽是过敏原。
[0037]
如本公开中所定义的过敏原包括能够在受试者中刺激过敏反应的抗原。过敏原可包含于或者来源于食品，如乳、蛋、芝麻、小麦、大豆、鱼、海鲜、花生、坚果。过敏原也可包含于或者来源于非食物产品，如螨虫、花粉、昆虫叮咬、动物毛皮、羊毛、医药产品等。过敏原优选地为形成能够被免疫系统的细胞识别的全部或部分抗原的多肽或蛋白质，对此我们旨在诱导对过敏原的耐受性。
[0038]
在一个优选的实施方案实例中，待递送的蛋白质是卵清蛋白。在优选的食物过敏原中，我们还可提及β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、酪蛋白。
[0039]
因此，本发明涉及一种过敏原，该过敏原用于使对所述过敏原过敏的受试者脱敏，所述过敏原以如此处所述的贴剂的形式给药。受试者的脱敏(也称为过敏症免疫疗法)允许受试者变得长期耐受特定过敏原。
[0040]
多层贴剂
[0041]
根据本发明的贴剂包含至少100个双层，这些双层各自由一个壳聚糖(chi)层以及一个分子量为500至1000kda的阴离子多糖或其盐的层构成，其中与粘膜接触的层以及与颊部或舌下环境接触的层由壳聚糖(chi)组成。
[0042]
根据本发明的贴剂由包含至少100个双层的多层粘附膜形成，这些双层各自由所述壳聚糖和所述阴离子多糖构成，其中位于该膜两端或周边的两个层由壳聚糖(chi)组成。
[0043]
根据本发明的一个具体实施方案，贴剂包含100至200个chi/阴离子多糖双层。根据一个优选的实施方案，贴剂包含100或200个chi/阴离子多糖双层，并甚至更优选地100个chi/阴离子多糖双层。
[0044]
根据本发明的另一个具体实施方案，贴剂的厚度为10至20μm，优选地11至19μm、12至18μm、13至17μm、14至16μm，并甚至更优选地约15μm。
[0045]
壳聚糖是由随机分布的β-(1-4)键合的d-葡糖胺(脱乙酰化单元)和n-乙酰基-d-葡糖胺(乙酰化单元)组成的多糖。它通过甲壳质的化学脱乙酰作用(在碱性介质中)或酶促脱乙酰作用产生，甲壳质是节肢动物(甲壳类)外骨骼或头足类(枪乌贼等)内骨骼或真菌壁的组分。这种原料典型地通过用盐酸处理而脱矿物质，然后在氢氧化钠或氢氧化钾的存在下脱蛋白，并最终用氧化剂脱色。乙酰化度(da)是乙酰化单元相对于单元总数的百分比；它可以通过傅里叶变换红外光谱(ftir)或通过用强碱滴定来确定。
[0046]
优选地，本发明中选择的壳聚糖的脱乙酰度(dd)大于或等于75％，优选地大于或等于78％。壳聚糖的优势在于，它是少数天然阳离子多糖之一，可容易使用，而且具有良好的粘附特性。
[0047]
阴离子多糖是由经由糖苷键结合在一起的几种单糖构成的碳水化合物家族的聚合物。根据本发明，多糖或其盐具有500至1000kda的分子量。在阴离子多糖中，我们可提及到例如糖胺聚糖(gag)、岩藻多糖、藻酸盐、角叉菜胶以及石莼聚糖。
[0048]
糖胺聚糖(gag)是存在于几乎所有组织中的长链线性多糖。gag的基本单元是由与己糖胺结合的己糖(通常为己糖醛酸)组成的二糖。这些寡糖链的特征性特征之一是它们非
常可观的异质性。事实上，链的可变长度及其结构修饰(硫酸化、差向异构化)导致了无数的组合。取决于单糖的性质和双糖接合在一起的方式，gag分为5个主要家族：肝素(hp)和硫酸乙酰肝素(hs)、透明质酸(ha)、硫酸软骨素(cs)、硫酸皮肤素以及硫酸角质素。
[0049]
岩藻多糖是以岩藻糖为基础糖的多糖。它的名字来源于它所出现的墨角藻属类型的藻类(褐藻)。
[0050]
藻酸盐是从褐藻获得的多糖。藻酸盐是由通过β-1-4键结合在一起的两个单体(即甘露糖醛酸和古洛糖醛酸)形成的聚合物。
[0051]
角叉菜胶是从红藻中提取的多糖(半乳聚糖)。目前销售有三个主要类别：κ-角叉菜胶、ι-角叉菜胶和λ-角叉菜胶，它们的区别在于硫酸基团的数目和位置，以及3,6-脱水半乳糖桥的数量。
[0052]
石莼聚糖是从石莼类型的绿藻中提取的硫酸化阴离子多糖。它们由包含经由1-4型键与葡萄糖醛酸结合的3-硫酸鼠李糖的a型ulvanobiuronate 3-硫酸钠(sodium ulvanobiuronate 3-sulfate type a)，以及包含经由1-4型键与艾杜糖醛酸结合的3-硫酸鼠李糖的b型ulvanobiuronate 3-硫酸钠(sodium ulvanobiuronate 3-sulfate type b)构成。
[0053]
根据本发明的一个具体实施方案，阴离子多糖或其盐选自糖胺聚糖(gag)、岩藻多糖、藻酸盐、角叉菜胶，以及石莼聚糖。更具体地，糖胺聚糖(gag)或其盐选自透明质酸(ha)、肝素(hp)、硫酸乙酰肝素(hs)、硫酸软骨素(cs)、硫酸皮肤素(ds)，以及硫酸角质素(ks)，优选地透明质酸，并甚至更优选地透明质酸钠。
[0054]
优选地，如上所定义的阴离子多糖可被唾液酶水解。
[0055]
粘膜粘附贴剂的制造
[0056]
根据本发明的粘膜粘附贴剂可以通过自动浸渍工艺组装带正电荷(壳聚糖)和带负电荷(阴离子多糖)的层来生产。这种逐层(lbl)沉积的方法为本领域的技术人员所熟知，并且特别用于国际申请wo 2005/052035中以用于制备交联聚合电解质的多层膜。
[0057]
然后，使由此形成的多层膜与蛋白质或多肽接触以提供装载蛋白质或多肽的粘膜粘附贴剂。
[0058]
因此，本发明涉及一种制造如本技术中所述的贴剂的方法，该方法包括由以下组成的步骤：
[0059]
i)通过在基底上逐层(lbl)沉积的方法来形成ch/阴离子多糖多层膜；
[0060]
ii)将多层膜从基底上分离；
[0061]
iii)使多层膜与蛋白质或多肽接触，由此多层膜负载蛋白质或多肽。
[0062]
由形成ch/阴离子多糖多层膜组成的方法的步骤i)采用在基底上逐层(lbl)沉积的技术进行。这种自动化技术使用浸渍机械手，例如来自riegler&kirstein gmbh公司的dr-3机械手。更具体地，将壳聚糖和阴离子多糖(聚合电解质)的溶液在缓冲溶液(如乙酸钠缓冲溶液)中制备。可以用氢氧化钠(naoh)和乙酸(ch3cooh)将溶液的ph调节至约5.5。此外，在浸渍机械手中，用作支撑物的基底在粘合带上制备。通常使用的基底是聚丙烯。然后将基底连续浸入壳聚糖和阴离子多糖的溶液中，且在乙酸钠、水或ph 5至6的缓冲盐水溶液，优选地乙酸钠的缓冲溶液中进行至少一个洗涤步骤，优选地两个洗涤步骤。该循环包括将基底浸入壳聚糖溶液中，至少一个洗涤步骤，优选地单个洗涤步骤，继之以浸入阴离子多
糖溶液中以及至少一个洗涤步骤，优选地单个洗涤步骤，允许形成了chi/阴离子多糖双层。该循环根据需要重复多次以获得期望数目的双层。浸泡和洗涤时间可有所不同。根据一个具体实施方案，基底在聚合电解质(chi和阴离子多糖)溶液中的浸没时间为2至10分钟，优选地2至8分钟，更有利地3分钟(短循环，sc)或6分钟(长循环，lc)。根据另一个具体实施方案，洗涤时间为1至10分钟，优选地2至4分钟，更有利地2分钟(短循环，sc)或4分钟(长循环，lc)。
[0063]
由将多层膜从基底(特别是从聚苯乙烯)上分离组成的该方法的步骤ii)可以与任选的预干燥步骤一起进行。然后，可将获得的多层膜切割成期望的尺寸。
[0064]
执行该方法的步骤iii)使得用多层膜负载蛋白质或多肽成为可能。更确切地，多层膜中蛋白质或多肽的负载是通过被动扩散实现的。特别地，步骤iii)通过使蛋白质或多肽溶解在合适的缓冲溶液中以防止蛋白质变性来进行。根据一个具体实施方案，使多层膜与蛋白质或多肽在ph为2至4，优选地ph为约3的酸溶液，优选地盐酸(hcl)中进行接触。根据另一个具体实施方案，使多层膜与蛋白质或多肽在ph为5至7，优选地ph为约6.5的盐水溶液，优选地氯化钠(nacl)溶液或氯化钾(kcl)溶液中进行接触。
[0065]
优选地，多层膜与蛋白质或多肽的接触通过使至少一滴包含蛋白质或多肽的缓冲溶液沉积在多层膜的表面上进行。然后任选地干燥膜以提供粘膜粘附贴剂，其中蛋白质或多肽引入贴剂中并且/或者吸附在贴剂的表面上。
[0066]
优选地，特别是在蛋白质或多肽仍然至少部分地吸附在表面上的情况下，所得的贴剂是极化的，因为相对于下层水平上的浓度而言，蛋白质或多肽的浓度在蛋白质或多肽所沉积的上层水平上更高。
[0067]
该方法还可包括在多层膜与蛋白质或多肽接触之前对多层膜进行平衡的任选步骤(指定为iii-0的步骤)。该平衡步骤由将步骤ii)后获得的多层膜浸入ph为2至4的酸溶液，优选地盐酸(hcl)，或ph为5至7的盐水溶液，优选地氯化钠(nacl)组成。在酸性ph下平衡多层膜的该任选步骤特别地允许膜溶胀，因此有利于负载蛋白质或多肽。负载有蛋白质或多肽的多层膜可在浸泡于缓冲溶液中时任选地收缩，因此允许使蛋白质或多肽捕获在贴剂中。
[0068]
根据一个具体实施方案，因此，本发明的方法还包括由以下组成的中间步骤：在进行步骤iii)之前，将根据步骤ii)分离的多层膜用ph为2至4，优选地ph为约3的盐酸(hcl)或ph为5至7，优选地ph为约6.5的氯化钠(nacl)溶液进行平衡。
[0069]
根据本发明的优选的制造方法包括由以下组成的步骤：
[0070]
i)通过在基底上逐层(lbl)沉积的方法来形成ch/阴离子多糖多层膜；
[0071]
ii)将多层膜从基底上分离；
[0072]
iii-0)在进行步骤iii)之前，将根据步骤ii)分离的多层膜用ph为2至4，优选地ph为约3的酸溶液，优选地盐酸(hcl)溶液，或用ph为5至7，优选地ph为约6.5的盐水溶液，优选地氯化钠(nacl)溶液进行平衡。
[0073]
iii)使多层膜与蛋白质或多肽接触，由此多层膜负载蛋白质或多肽。
[0074]
贴剂的负载
[0075]
如上所述，蛋白质或多肽可引入贴剂中或吸附在其表面上。
[0076]
典型地，分子量低于70kda或80kda的蛋白质或多肽优选地完全或几乎完全引入
(即，优选地至少90％的蛋白质引入)贴剂中。较高分子量的蛋白质或多肽可以全部或部分吸附在贴剂的表面上。
[0077]
引入和/或吸附的蛋白质或多肽的量取决于蛋白质或多肽以及所期望的生物学或药理学效应。该量可能例如从50ng/cm2至5mg/cm2，优选地从10ng/cm2至1mg/cm2、1μg/cm2至1mg/cm2变化。
[0078]
施用
[0079]
如此获得的贴剂可在施用前储存于4℃或室温下。
[0080]
典型地，贴剂尺度为2-3cm2，以施用于人类受试者。贴剂可以施用于例如面颊内侧、颚上、牙龈或舌下。舌下施用(即在舌的腹面上)是特别有利的。优选地，将贴剂以使得在贴剂的制造期间其上沉积有蛋白质或多肽的壳聚糖层是与粘膜接触的层的方式施用。
[0081]
附图和实施例举例说明本发明而非对其范围进行限制。
[0082]
实施例1：粘膜粘附贴剂的制造和测试
[0083]
1.材料和方法
[0084]
1.1材料
[0085]
中等分子量的壳聚糖(chi)购自sigma-aldrich。在使用前，将chi通过过滤以及在水和乙醇中沉淀的步骤进行纯化，继之以冻干，以获得770kda的最终分子量和78％的脱乙酰度(dd)。在低ph(《6.5)下，chi是带正电荷的聚合电解质。将其与另一种多糖(vis)(获自flexichem)进行比较，后者具有不同的n-乙酰化基团分布。610kda(hya
lw
)和1020kda(hya
hw
)的两种类型的透明质酸钠(hya)购自htl,france，并且按原样使用。所有其它试剂和溶剂均不经纯化使用。
[0086]
对于所有实验，聚合电解质的溶液通过使用1mg/ml的聚合物浓度溶解于乙酸钠缓冲液(0.1m ch3cooh；0.15m nacl，ph 5.5，室温)中临时制备，以生产膜。
[0087]
1.2荧光壳聚糖
[0088]
使20ml中等重量壳聚糖(chi，770kda，10mg.ml-1
，于乙酸0.1mol.l-1
中)与20ml异硫氰酸荧光素(fitc，1mg.ml-1
，于无水甲醇中)在室温和避光下接触3小时。然后将ph增加至10以沉淀chi，然后以11000g离心15分钟，并用水洗涤数次，直到在上清液中检测不到荧光。然后将chi溶解于20ml的乙酸0.1mol.l-1
中，并通过在水中于暗处进行3天透析(spectrum,usa)，每天更换水，移除未结合的fitc残余物。chi和fitc的量通过分别在490nm和270nm处的分光光度测定进行确定。将荧光素标记的中等重量chi(chi
fitc
)分成2mg.ml-1
于乙酸0.1mol.l-1
中的等分试样，并在-20℃下储存。
[0089]
1.3chi/hya膜的制造
[0090]
自支撑膜(chi/hya)使用浸渍机械手(dr-3，riegler&kirstein gmbh)通过逐层(lbl)方法生产。这些膜使用通过在乙醇和蒸馏水中超声处理(每种溶液5分钟)清洁的聚苯乙烯基底进行制造。将基底相继浸入在乙酸钠缓冲液(ch3coona 0.2m，ch3cooh 0.2m，ph 5.5，在室温下)中浓缩至0.2％(重量/体积)的chi或以及hya(610kda的hya
lw
或1020kda的hya
hw
)的溶液中，且在聚合物溶液中的每次沉积之间使用乙酸钠缓冲液进行1次洗涤步骤。这些浸泡重复100次，天然来源的聚合物的沉积时间为3分钟，且每个洗涤步骤为2分钟。然后让膜在室温下干燥。最后，只要通过用镊子将它们牵拉下来，膜就容易地从其相应的下面的基底上分离出来。荧光膜(chi
fitc
/hya)
100-chi
fitc
)如上所述用0.5％的chi
fitc
以
2mg.ml-1
处于ph 5.5乙酸钠缓冲液中的壳聚糖溶液避光制备。
[0091]
1.4 lbl膜的厚度
[0092]
在干燥和从基底上分离后测量所产生膜的厚度。膜厚度使用千分尺(high-accuracy digimatic micrometer,mitutoyo)测定；在膜中心水平的不同位置进行20次测量。
[0093]
1.5人工唾液及酶促降解研究
[0094]
实验前对1cm2的膜进行称重。用溶解于缓冲液(0.15m nacl，20mm hepes，ph 6.5)中的α-淀粉酶、透明质酸酶和溶菌酶制备人工唾液。所有酶的最终浓度均为100μg.ml-1
。将样品浸泡在人工唾液中并在37℃下孵育，缓慢搅拌30分钟、1小时、3小时、6小时或24小时。在各孵育时段后，将膜在37℃下干燥并称重。膜在不同条件下的重量损失百分比(wl)由公式1确定，其中wi表示膜的初始干重，并且wf表示每个预定时间点后干膜的重量。对每种条件一式三份进行三次独立实验，取平均值作为重量损失百分比。
[0095]
wl＝(wi-wf)/wi
×
100
ꢀꢀ
(公式1)
[0096]
为了在共聚焦激光扫描显微术(clsm)中观察膜，将荧光膜固定在玻璃板上，并在37℃和搅拌下于人工唾液中孵育30分钟、3小时、6小时或24小时。降解通过用乙酸盐缓冲液冲洗来停止，直到采用lsm710共聚焦显微镜(carl zeiss sas,france)以clsm进行观察。使用carl zeiss zen软件和image j软件来分析所有图像。
[0097]
1.6扫描电镜(sem)
[0098]
使用扫描电镜(merlin compact vp,zeiss)在5kv的加速电压下对样品(降解前后)进行形态学分析。观察膜的两侧。观察前，使所有样品都涂覆铜(balzers med 010)。
[0099]
1.7细胞毒性测试
[0100]
将永生化ho-1u-1细胞(人细胞系，衍生自口底的鳞癌细胞，获自gimap,st etienne,france)在具有d-葡萄糖(4.5g.l-1
)、丙酮酸(1mmol.l-1
)和l-谷氨酰胺(2mmol.l-1
)、dmem/ham的f12营养混合物(1:1)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中培养，该培养基补充有10％(体积/体积)的热灭活胎牛血清(fbs)和1％(体积/体积)的青霉素/链霉素。将hela细胞(衍生自腺癌的人上皮细胞系，ccl-2)在具有d-葡萄糖(4.5g.l-1
)、丙酮酸(1mmol.l-1
)和l-谷氨酰胺(2mmol.l-1
)的dmem中培养，该dmem含有10％(体积/体积)的热灭活fbs和1％(体积/体积)的青霉素/链霉素。使细胞保持于37℃和5％co2气氛中。
[0101]
在细胞毒性测试两天前，将细胞接种在96孔培养板中。与此同时，将(chi/hya)100-chi膜切碎以调整尺寸(3cm2/ml培养基)，在70％乙醇中并通过暴露于uv光灭菌。然后将膜在含有100μg.ml-1
唾液酶(溶菌酶、α-淀粉酶和透明质酸酶)的培养基中于37℃孵育过夜。然后从孔中移除培养基，并用含有降解产物的培养基替换。将细胞在37℃下孵育24小时。然后将溴化甲基噻唑基二苯基-四唑鎓(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)(mtt，0.5mg.ml-1
)添加到每个孔中，以在37℃下孵育3小时。然后将细胞在含有10％(体积/体积)的triton x-100和hcl(0.1mol.l-1
)的无水异丙醇的增溶溶液中于37℃下避光孵育过夜。在570nm和690nm处测量吸光度(i-controlm1000pro,tecan,switzerland)。使用0.1％(体积/体积)的十二烷基硫酸钠(sds)进行阳性对照，阴性对照仅采用细胞。数据取为三个独立实验的一式三份的平均值。
[0102]
1.8小鼠
[0103]
对6至8周龄的雌性cb6f1小鼠(charles river laboratories,france)和雄性shk-1小鼠(charles river laboratories,france)进行体内研究以用于断层扫描实验。所有动物都保持在无病原体的条件下。所有动物研究均遵守欧盟的指示进行，并获得地区和国家伦理委员会(regional and national ethics committees)的批准。
[0104]
1.9膜或溶液的舌下给药
[0105]
将膜切碎以调整至小鼠舌的尺寸(2mm
×
7mm)并用uv光灭菌。然后通过舌下途径(舌腹部)将膜或液体配方给药于轻度麻醉的小鼠(异氟烷4％)。在给药后，在舌背侧施加轻微压力10秒(直到清醒)，以确保膜或液体溶液与粘膜接触。没有进行其它约束。从麻醉中恢复后，让动物自由饮水或梳理毛发。给药后30分钟内撤出水，并返回用于更久的实验。
[0106]
1.10粘膜肿胀和mhcii阳性细胞募集的组织学分析
[0107]
将原生膜、经hcl处理的膜或经nacl处理的膜给药30分钟或60分钟。体积为12.5μl的0.5％的1-氟-2,4-二硝基苯(dnfb)溶液用作炎症的阳性对照。阴性对照组不经历任何操作。每组包含3只小鼠。对于整个治疗时间，小鼠都处于警觉状态，并且前30分钟移除水。在每个时间点，将舌置于基质(optimal cutting temperature,tissue tek)中并储存于-80℃直到冷冻切片。对于冷冻切片步骤，使用恒冷箱切片机(leica)制备厚度为6μm的切片，并在-20℃下用丙酮固定在玻璃板上。为了分析粘膜肿胀，用苏木精(gill formula,vector)对舌切片进行染色，并使用倒置显微镜(nikon ti-e)捕获图像。在从腹面基部延伸2mm的长度上分析粘膜的肿胀。使用image j软件的多边形工具进行面积测量。对于mhcii的染色，首先将舌切片与过氧化物酶阻断试剂(dako)一起孵育，然后与生物素化大鼠抗小鼠抗体(bd pharmigen)一起孵育，使用vectastain elite abc试剂盒(vector)和aec过氧化物酶底物(vector)显影，最后用苏木精(gill formula,vector)反标记。使用nikon ti-e显微镜检查切片。使用image j软件的插件cell counter，在从舌下膜腹面基部延伸2mm的长度上计数mhcii阳性细胞(mhcii+)的数目。
[0108]
1.11.用于细胞因子定量的标本的制备
[0109]
每组包含3只小鼠。两组接受原生膜或经hcl处理的膜。其它三组小鼠通过舌下途径接受10μl的chi(770kda，2mg.ml-1
，于乙酸盐缓冲液ph 5.5中，sigma,usa)、10μl的hya(610kda，0.95cm3.kg-1
，2mg.ml-1
，于乙酸盐缓冲液ph 5.5中，htl,france)、或10μl的两种聚合物的组合。对照组的小鼠通过舌下途径接受10μl的pbs或乙酸盐缓冲液ph 5.5用于阴性对照，或12.5μl的0.5％(体积/体积)dnfb的氯仿溶液用于阳性对照。在施用膜或溶液后6小时将舌切除，在液氮中冷冻并储存于-80℃。简而言之，使舌在ripa缓冲液[tris hcl(50mmol.l-1
)、nacl(150mmol.l-1
)、triton x-100(1％)、脱氧胆酸钠(0.5％)、sds(0.1％)、edta(1mmol.l-1
)和蛋白酶抑制剂混合物(1％，thermo scientific)]中于冰上孵育2小时，然后用剪刀均化。然后，将制备剂使用球型搅拌器(2
×
5分钟，30hz，4℃)(tissuelyzer ii,qiagen,germany)和超声处理(2分钟，60hz)进行均化，然后在10 000rpm和4℃下离心10分钟。然后使用bca蛋白质测定试剂盒(thermofisher scientific,usa)测定上清液中的总蛋白浓度。使用mesoscale discovery系统(meso quickplex sq 120,msd,usa)通过电致发光，在每个样品中同时对白介素1β(il-1β)、il-6和肿瘤坏死因子α(tnf-α)进行量化(v-plex proinflammatory panel 1mouse kit,msd,usa)。数据作为每种条件下三只小鼠一式两份的平均值获得。
[0110]
1.12作为ph的函数通过溶胀掺入蛋白质
[0111]
出于评价膜在不同ph值下掺入蛋白质的能力的目的，将膜用1mm的hcl(ph 3-3.5)、磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs 1x，life technologies
tm
ph7.4)或用氯化钠缓冲液(nacl 0.15mol.l-1
，hepes 0.02mol.l-1
，ph 6.5)在室温下平衡1小时。在实验之前，将直径为12mm的膜通过暴露于uv下20分钟进行灭菌。在过量hcl的平衡后，移除pbs或nacl缓冲液，并使一滴蛋白质沉积在膜的顶部。使用的蛋白质是1mm的hcl或nacl缓冲液中5μg.ml-1
的alexa fluor 647标记的卵清蛋白(ova
af647
)(500ng负载)，或500ng.ml-1
的细胞因子ccl20(50ng负载)。使膜在4℃下孵育过夜。在用乙酸盐缓冲液ph 5.5冲洗并在空气流下干燥后，功能化膜被指定为“生物活性贴剂”。
[0112]
1.13卵清蛋白释放研究
[0113]
在实验之前，如上所述将ova
af647
引入膜中。在不同的ph下监测蛋白质的释放，将ph 5.5的乙酸盐缓冲液、ph 7.4的dulbecco的pbs(dpbs)或ph 6.5的人工唾液用作冲洗溶液。在添加冲洗溶液之后立即移除并储存蛋白质，以评价未结合蛋白质的量(“快速冲洗”，qr)。ova
af647
从膜上的释放进行2小时，时间点为10、20、30、40、60、90和120分钟。释放的ova
af647
通过荧光光谱法(infinite m1000,tecan)进行分析，其中alexa fluor 647的激发/发射波长固定在650/668nm。在前述波长下，记录dpbs、乙酸盐缓冲液、hcl和人工唾液中标记蛋白的校准曲线。
[0114]
1.14贴剂的粘膜粘附和蛋白质保留时间的断层扫描分析
[0115]
为了对小鼠颊部区域中的蛋白质保留时间进行断层扫描分析，将2只小鼠的组在接受4％异氟烷流的腔室中麻醉5分钟。对于溶液的给药，10μl的ova
af647
溶液沉积于小鼠舌腹面的基部处。关于贴剂的给药，后者置于舌的腹面。对于每个制剂，给药5μg的ova
af647
。将小鼠置入处于异氟烷下的断层扫描室(fmt 4000,perkin elmer)中，在给药后2、10或30分钟，头部先躺下定位以进行图像采集。
[0116]
1.15卵清蛋白在舌下粘膜中的渗透
[0117]
在给药液体制剂(10μl)或(chifitc-hya)100-chi贴剂后，评价ova
af647
在舌下粘膜中的渗透。如1.12中所述，通过在hcl中孵育引入ova
af647
。2只小鼠的组接受各种制剂，并在给药后2、10、30或60分钟处以安乐死。获取舌下粘膜(舌腹面和口底)，嵌入基质中并于-80℃下储存。制备40μm的切片，用dapi核探针标记，然后用共聚焦显微镜(lsm 710,zeiss,germany)观察。
[0118]
1.16趋化性测试
[0119]
小鼠树突状细胞系(dc 2.4,#scc142 millipore)用于体外测试由开发的膜所递送的趋化因子ccl20的趋化效应。在37℃和含5％co2的气氛下，将细胞在补充有glutamax、10％的fbs、10mm的hepes、50μm的β-巯基乙醇和非必需氨基酸混合物(1x)(下文称为gm)的rpmi培养基中培养。趋化性测试在置于12孔板中的细胞培养thincerttm插入物(greiner bio-one；参考：665 610)中进行20分钟。在进行测试之前，在37℃下将膜、趋化因子ccl20和载有趋化因子ccl20(500ng.ml-1
)的膜在唾液酶(0.1mg.ml-1
的α-淀粉酶、透明质酸酶和溶菌酶，溶于不含fbs的gm中)溶液中孵育24小时，缓慢搅拌。然后，以2.0
×
105个细胞/插入物的密度接种12孔板的插入物，并在37℃下孵育10分钟。然后在12孔板的下室中小心地填充1ml趋化溶液或对照溶液，以在37℃下孵育10分钟。阳性对照对应于仅在gm存在下孵育的树
突状细胞(dc)。最后，使用棉签擦拭每个插入物的内表面。在固定(用4％多聚甲醛)并用dapi染色后，用倒置显微镜(nikon ti-e)观察样品。所获得的结果表示3个独立实验一式三份的平均值。
[0120]
1.17统计分析
[0121]
所有数据都在graphpad prism软件7.0版中进行了分析和输入。所指示的量表示至少三个平行测定的平均值
±
标准偏差(sd)；除了表示平均值
±
标准误差(sem)的发布数据之外。对于细胞毒性测试，p《0.05被认为在使用单一控制因素的anova、tukey多重比较检验或dunnett多重比较检验后具有统计学显著性。
[0122]
2.结果
[0123]
2.1人工唾液中自支撑膜的降解
[0124]
(chi/hya)
100
原生膜是通过改变3个参数产生的：hya的分子量(mw)、聚合电解质和冲洗溶液的沉积时间，以及chi的特性。首先检查了这些参数对膜厚度的影响。显示出(chi/hya)
100
原生膜的生长与50个双层(4.5
±
1.39μm)、100个双层(10.30
±
7.67μm)以及200个双层(17.04
±
7.96μm)的膜呈线性关系(图9)。需要至少50个双层以易于操纵，而无需任何程序后处理。通过改变hya的mw(610kda或1000kda)，在膜厚度水平上没有发现显著差异(图1a)。关于沉积时间，即长周期(lc，聚合电解质6分钟，且冲洗缓冲液4分钟)和短周期(sc，聚合电解质3分钟，且冲洗缓冲液2分钟)，在膜厚度水平上观察到显著差异，其中发现在lc条件下产生膜时增加了约32％(图1a)。
[0125]
还检查了用于构建膜的条件对降解的影响。此外，由于目的是将膜用于舌下施用，因此产生了人工唾液。人工唾液由含有α淀粉酶、溶菌酶和透明质酸酶的生理溶液组成，这三种酶存在于人唾液中。在24小时的时段内监测产生的膜的降解并量化，以重量损失百分比表示。如归因于的快速生物降解性所预期，用所产生的膜比基于chi的膜降解得更快(图9b)。虽然基于chi的膜的一般降解曲线不受hya的分子量或沉积时间的显著影响(图1b)，但在降解过程的初始阶段(第一个小时)，在lc条件中构建的膜发现延迟(图1b中的插图)。在24小时后，所有膜都达到了75％至95％范围内的重量损失水平。
[0126]
为了获得关于它们降解的形态学信息，在sem和共聚焦显微镜下观察(chi/hya
lw
)
100
膜。在观察来自这两种技术的图像时，在30分钟观察到初始表面侵蚀，随后在1小时形成表面孔，最终在3小时形成更深的孔(图1c和1d)。在膜溶胀至约30μm的水合条件下，从浸入人工唾液中30分钟开始，也观察到膜表面的酶促降解(图1d)。在乙酸盐缓冲液中24小时后未观察到降解(图1d，对照)。
[0127]
因为这些膜被设计用于经由粘膜给药蛋白质，发明人选择了由chi而非制成的膜，以确保从与粘膜接触进行降解的第一阶段起货物蛋白的延长扩散。还选择了在sc条件下产生的膜以减少产生时间，并且随机选择了610kda的hya
lw
，因为相对于hya
hw
没有观察到厚度或降解的差异。为了确保最佳粘膜粘附，用于动物实验的所有膜均具有第一和最后一层chi。因此，对于接下来的研究，(chi/hya
lw
)100-chi膜被简单地指定为(chi/hya)
100
。
[0128]
2.2对人上皮细胞的细胞毒性
[0129]
在24小时的孵育时间内，对两种人上皮细胞系(hela和ho-1u-1)评价了膜降解产物的细胞毒性。由于活力保持在100％左右，两种细胞系均未观察到毒性(图2a-b)。该结果
可以通过用于产生膜的两种多糖的已知生物相容性来解释，这两种多糖未经过化学修饰。将聚合物组合并不影响它们的生物安全性。因此，该膜可以在体内施用于小鼠的舌下粘膜，而不导致对组织的上皮细胞的细胞毒性效应。
[0130]
2.3小鼠舌下粘膜的炎症
[0131]
通过评价炎症状态的各种主要特征，对小鼠评价贴剂在体内诱导的炎症反应。首先，在不同条件下观察小鼠的舌下粘膜的上皮和固有层的肿胀表面。作为炎症的阳性对照，使用0.5％的1-氟-2,4-二硝基苯(dnfb)，因为它已展示在通过舌下途径给药时诱导炎症[leborgne等人,2006]。在给药dnfb后30分钟观察到粘膜厚度增加，并在2小时后略有减小(图3a)。应当指出的是，固有层的肿胀维持了6小时，而上皮的厚度在2小时后已经减小。为了量化(chi/hya)
100
膜诱导的肿胀，将原生膜和经hcl处理的膜(在1mm的hcl，ph 3中孵育1小时)施用到舌下粘膜30或60分钟。由于用hcl处理构成了蛋白质引入方案的一部分，评价了其对炎症反应的影响。在施用原生膜后粘膜的肿胀与dnfb阳性对照在2小时诱导的肿胀相当，而与经hcl处理的膜接触的粘膜显著更薄。为了使组织肿胀与免疫细胞浸润联系起来，对ii类主要组织相容性复合体(mhcii)进行免疫组织化学染色。mhcii是抗原呈递细胞(apc)，特别是树突状细胞(dc)、b淋巴细胞以及巨噬细胞的主要标记。粘膜中mhcii+细胞的浸润程度在给药原生膜后30分钟显著增加(图3b-c)，并在60分钟后恢复到对照水平。令人感兴趣的是注意到，施用经hcl处理的膜30分钟没有引起mhcii+细胞浸润，浸润与对照保持相似，如对粘膜肿胀所观察(图3a)。
[0132]
为了鉴定由原生膜和经hcl处理的膜诱导的中期炎症特征，在给药贴剂6小时后量化炎性细胞因子的表达特征。在所有测试条件下(溶液中的聚合物，或经或未经hcl处理的膜)，il-1β、il-6和tnf-α的水平与对照的水平相似，这意味着没有炎症信号在施用贴剂后6小时被诱导。
[0133]
2.4模型蛋白即卵清蛋白的掺入/释放
[0134]
为了评价(chi/hya)
100
膜作为蛋白质扩散的系统，后者用模型蛋白即卵清蛋白功能化，该模型蛋白用荧光团alexa fluor 647(ova
af647
)标记。在hcl1mm，ph 3中平衡膜后，将ova
af647
引入膜中(根据图4中的方案)。用乙酸盐缓冲液ph 5.5(用于膜叠加的冲洗缓冲液)冲洗膜使得可以引入98％的ova
af647
，而用pbs(ph 7.4)冲洗导致引入略有下降(94％)(图5a)。2小时内的释放动力学确认了这些差异，因为在乙酸盐缓冲液中，少于7％的ova
af647
从贴剂中释放，而在pbs中为31％(图5a-b)。在浸入人工唾液中后，35％的ova
af647
在2小时内从贴剂中释放出来，并且浸入24小时后释放约90％(数据未呈现)。在ph为3时掺入ova
af647
继之以用乙酸盐缓冲液冲洗的曲线显示，约80％的蛋白质掺入到表面之下的前10微米，这相当于总水合厚度的三分之一(图5c-d)。功能化膜因此变成不对称贴剂，具有蛋白质的表面是与粘膜接触的表面。由于某些蛋白质可能对酸性ph敏感(变性、丧失活性等)，ova
af647
的引入也在生理ph 7.4下的pbs中，而非ph 3下的hcl中进行。然而，由于膜的显著溶胀，在引入蛋白质后不可以操纵或可视化贴剂。此外，结构的不稳定性导致掺入度低于60％(数据未呈现)。相反，nacl缓冲液(nacl0.15mol.l-1
，hepes 0.02mol.l-1
，ph 6.5)用于掺入蛋白质。为了冲洗膜，测试了相同的溶液(乙酸盐缓冲液、pbs和人工唾液)。如在酸性ph下负载所观察，用乙酸盐缓冲液冲洗导致94％的蛋白质掺入，而用pbs冲洗仅导致85％的ova
af647
掺入(图10a)。释放曲线确认，乙酸盐缓冲液确保了蛋白质保留在膜内，因为小于约10％的ova
af647
从
膜中释放，而pbs导致约36％的ova
af647
快速释放(图10b)。在人工唾液中冲洗2小时后蛋白质释放达到69％。当其与nacl缓冲液一起引入时，蛋白质在贴剂内的分布证明了比与hcl一起引入更均一，并且没有呈现沿z轴的深度渗透梯度(图10c、d)。
[0135]
2.5货物蛋白的粘膜粘附和保留时间
[0136]
通过在给药后20分钟可视化停留在舌下粘膜上的膜，在体内评价贴剂的粘膜粘附(图6a)。通过分子荧光断层扫描对ova
af647
的监测展示了该蛋白质在作为液体制剂给药后的分散率(图6b)。在图像采集的最初数分钟期间，ova
af647
已经沿着消化道分布，并且10分钟后在口腔中检测不到信号。当它与粘膜粘附膜共同给药时，在至少30分钟内，ova
af647
在口腔中以集中信号的形式被检测到。
[0137]
2.6货物蛋白在粘膜上的呈现和渗透
[0138]
通过共聚焦显微镜监测ova
af647
的组织渗透。给药后2分钟的信号强度在液体形式下比膜所展现的弱得多(图7)。在贴剂以及在chi
fitc
中给药后10分钟，ova
af647
已渗透到角质化层中(白色箭头，图7)。在施用后30分钟不可检测到贴剂，但ova
af647
存在于粘膜深处(白色虚线箭头，图7)。即使在上皮(表面层)中检测到积聚，但在固有层和粘膜下层也观察到ova
af647
。给药后60分钟几乎检测不到信号。相对于30分钟，给药后60分钟蛋白质的荧光信号的这种减少可能通过组织中蛋白质的清除及其被免疫细胞(如apc)的吸收进行解释。
[0139]
2.7掺入蛋白质的生物活性
[0140]
为了评价引入(chi/hya)
100
膜中的蛋白质的功能和生物活性，将趋化细胞因子(ccl20)负载到组件中，并在膜于人工唾液中降解后取样。细胞因子ccl20被用作用于具有相关联ccr6受体的鼠树突状细胞(dc 2.4)的化学引诱物(数据未呈现)。细胞因子的趋化性能力在贴剂内得以保留，因为观察到溶液中的ccl20和贴剂溶解后收集的ccl20的相似迁移(图8)。因此，贴剂保留了蛋白质的生物活性，并且细胞因子对靶细胞展现出显著的化学引诱效应。
[0141]
实施例2：(chi/hya)
100
贴剂中掺入率的评价
[0142]
1.牛血清白蛋白(bsa)的掺入
[0143]
材料和方法
[0144]
将(chi/hya)
100
膜切碎以便获得1cm2方形体，将其在ph 3的hcl缓冲溶液或ph 6.5的nacl缓冲溶液中孵育，两者缓冲溶液均含有10mg.ml-1
浓度的血清牛白蛋白(bsa)。(chi/hya)
100
膜的方形体被200μl左右的液体体积完全覆盖；在平衡状态下，它们各自含有约2mg吸附的bsa。将负载有bsa的(chi/hya)
100
膜的方形体在不含bsa的释放缓冲液(乙酸盐缓冲液，ph 5.5)中孵育，以便使用基于二辛可宁酸(bca)的蛋白质测定试剂盒来测量释放的蛋白质的量4小时的时间。通过在开始时(t0)和孵育5、10、20、30、60、120和240分钟后对释放缓冲液取样来执行光密度(562nm)测量，每次取样后更换释放缓冲液。系统地扣除用仅含有孵育溶液的孔所获得的空白测量值。从标准曲线中，可以确定各释放时间每ml的蛋白质浓度，然后参考200μl的bsa的量。最后，通过从初始吸收的理论2mg bsa中减去对200μl所测定的bsa量，发现膜中掺入的蛋白质的量。
[0145]
结果
[0146]
(chi/hya)
100
膜中每cm2引入的bsa量是通过从不同ph下的bsa浓溶液中预孵育的膜中释放的bsa的测定来确定的。在ph 3下引入的bsa和ph 6.5下引入的bsa之间观察到非
常相似的释放曲线，瞬时(t0)分别释放0.79mg和0.75mg，在5分钟后释放额外的0.18mg和0.16mg，并且在10分钟后再释放0.03mg和0.01mg。在释放20分钟后，在时间t10和t20之间释放的bsa不再能被检测到，这指示释放主要发生在10分钟内。所测量的释放的bsa总量对应于在ph 3下掺入的bsa的1.01mg，以及在ph 6.5下掺入的bsa的0.92mg。因此，初始吸附约2mg的bsa的(chi/hya)
100
膜的方形体在冲洗4小时后仍具有1mg的bsa，或对于ph 3下进行的掺入为约0.99mg的bsa，以及对于ph 6.5下进行的掺入为约1.08mg。因此，两种情况下的掺入率均为50％。
[0147]
2.(chi/hya)
100
膜中免疫球蛋白(igg)的掺入
[0148]
材料和方法
[0149]
将(chi/hya)
100
膜切碎以便获得1cm2的方形体，将其在200μl的ph 3的hcl平衡溶液(样品mba)或200μl的ph 6.5的nacl-hepes平衡溶液(样品mbb)中孵育1小时。然后将mba膜的方形体在150μl的基于ph 3的hcl的掺入溶液中孵育，该溶液含有2μg.ml-1
的g型免疫球蛋白(igg；针对山羊igg并与荧光染料alexa 633偶联的驴二抗；invitrogen,molecular probes a21082-批号73a2-1)，并将mbb膜的方形体在150μl的基于ph 6.5的nacl-hepes的掺入溶液中孵育，该溶液也含有2μg.ml-1
igg。与此同时，将未经历平衡步骤的干燥(chi/hya)
100
膜(mbc和mbd)方形体分别在与样品mba和mbb相同的掺入溶液中孵育。在4℃下，在掺入溶液中进行孵育过夜。次日，将膜在乙酸盐缓冲液(0.1m ch3cooh，0.1m ch3coona，ph 5.5)中冲洗3次，每次2分钟，然后在气体流(psm)下避光干燥。最后，使用x20物镜用共聚焦荧光显微镜(zeiss,lsm 710)观察膜。
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结果
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检查了在不同ph下采用或不采用初步平衡步骤的膜(alexa 633nm)(未提供图像)。在所有条件下，在孵育期间基本上与板壁相对的膜mba、mbb、mbc和mbd的表面处，可同等地检测到igg的存在。然而，mba样品的igg标记更为明显，这指示初步平衡步骤仅对ph 3下的掺入提供优势。此外，膜中掺入的igg量可估计为约400ng/cm2。
[0152]
参考文献
[0153]-caridade等人,biomacromolecules.2013,14(5):1653-60
[0154]-caridade等人,acta biomater.2015,15:139-49-leborgne等人,immunity.24(2006)191
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201

技术特征：
1.一种颊部或舌下粘膜粘附贴剂，其旨在用于颊部或舌下释放蛋白质或多肽，所述贴剂包含至少100个双层，所述双层各自由一个壳聚糖(chi)层以及一个分子量为500至1000kda的阴离子多糖或其盐的层构成，所述贴剂的与粘膜接触的层以及与颊部或舌下环境接触的层由壳聚糖(chi)组成，所述蛋白质或所述多肽被掺入所述贴剂中并且/或者吸附在所述贴剂的表面上。2.根据权利要求1所述的贴剂，其包含100至200个chi/阴离子多糖双层。3.根据权利要求1或2所述的贴剂，其具有10至20μm，优选地约15μm的厚度。4.根据权利要求1至3中任一项所述的贴剂，其中所述阴离子多糖或其盐选自糖胺聚糖(gag)、岩藻多糖、藻酸盐、角叉菜胶以及石莼聚糖。5.根据权利要求4所述的贴剂，其中所述糖胺聚糖(gag)或其盐选自透明质酸(ha)、肝素(hp)、硫酸乙酰肝素(hs)、硫酸软骨素(cs)、硫酸皮肤素(ds)以及硫酸角质素(ks)，优选地透明质酸，并甚至更优选地透明质酸钠。6.根据权利要求1至5中任一项所述的贴剂，其中所述蛋白质或多肽是过敏原，优选地卵清蛋白。7.一种过敏原，其用于使对所述过敏原过敏的受试者脱敏，所述过敏原以如根据权利要求6所定义的贴剂的形式给药。8.一种制造如权利要求1至6中任一项所定义的贴剂的方法，其包括由以下组成的步骤：i)通过在基底上逐层(lbl)沉积的方法来形成ch/阴离子多糖多层膜；ii)将所述多层膜从所述基底上分离；iii)使所述多层膜与蛋白质或多肽接触，由此所述多层膜负载所述蛋白质或多肽。9.根据权利要求8所述的方法，其中根据步骤iii)使所述多层膜与蛋白质或多肽在ph为2至4，优选地ph为约3的盐酸(hcl)溶液中接触。10.根据权利要求8所述的方法，其中根据步骤iii)使所述多层膜与蛋白质或多肽在ph为5至7，优选地ph为约6.5的氯化钠(nacl)溶液中接触。11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其还包括由以下组成的中间步骤：在进行步骤iii)之前，将根据步骤ii)分离的所述多层膜用ph为2至4，优选地ph为约3的盐酸(hcl)溶液或ph为5至7，优选地ph为约6.5的氯化钠(nacl)溶液进行平衡。12.根据权利要求1至6中任一项所述的贴剂，其可通过如权利要求8至11中任一项所定义的方法获得。

技术总结
本发明涉及用于蛋白质或多肽的颊部或舌下释放的粘膜粘附贴剂，所述贴剂包含至少100个双层，每个双层由壳聚糖(CHI)层和阴离子多糖层组成。本发明还涉及生产这种贴剂的方法。本发明还涉及生产这种贴剂的方法。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：克劳德伯纳德里昂第一大学
技术研发日：2021.11.12
技术公布日：2023/8/24