流体样品制备的改进或与流体样品制备相关的改进的制作方法

1.本发明涉及流体样品制备的改进或与流体样品制备相关的改进，并且更具体地，涉及经由搅动死端式过滤的流体样品制备。


背景技术：

2.全血含有多种组分，为了实现分析目的，必须在下游处理(例如分析物检测或基因组测序)之前制备或净化这些组分。白细胞、血小板和红细胞，统称为血细胞比容，通常占血浆的高达～46.7％v/v，血浆本身是占全血体积剩余部分的约92％的水和约8％的血浆分析物。由于高百分比体积的血细胞比容，去除生物处理上游干扰物使得随后可依靠的下游处理成为可能。例如，来自红细胞溶解的高血红蛋白水平已经示出了对基于抗原-抗体的测定的结果具有有害影响。因此，分析器的制造商通常对他们的设备执行干扰测试以确定由截止值(临床和实验室标准协会(clsi))定义的干扰的可接受标准。
3.在试图消除干扰物质被带入后续处理步骤中时，例如细胞、血红蛋白、来自溶解的血细胞的遗传物质、处理参数和设计变量必须被适当地考虑和选择以最大化该单元操作的效率。在靶向从整个过程中捕获的循环无细胞dna(cell-free dna，cfdna)的情况下，需要考虑一系列处理变量以能够进行朝向测序的进一步下游处理。
4.可以基于分子/颗粒大小、形状和电荷，进行使用死端式过滤系统(dead-end filtration system，def)从全血浓缩cfdna的设计考虑。大于膜孔的分子将不能在膜空隙体积内渗透(超滤膜)，而可变形的或小于过滤器输入侧孔的颗粒/分子可以在聚合物基质(微孔膜)内被捕获。重要的是，设计任何过滤系统都将总是需要经验测试。
5.人血浆是最重要的并且是最方便的循环生物标记来源之一。对血浆蛋白质组、转录组和代谢组的研究已经迅速增加了用于包括癌症、阿尔茨海默病和败血症等多种疾病的诊断靶向谱(spectrum of diagnostic targets)。同样，抗体以及血浆中存在的外源核酸和抗原允许诊断严重的传染性疾病(例如由埃博拉病毒或寨卡病毒引起的那些)。此外，从血液中分离血浆是能够进行进一步下游处理(如dna提取)的关键步骤。然而，生物标记的质量通常不仅取决于生物因素(例如患者的身体状况和年龄)，而且取决于技术因素(例如缺乏样品收集和制备的标准化)。此外，处理血液样品是时间敏感的，因为遗传物质可以降解并且代谢物可以分解。
6.目前实验室中使用的从血液分离血浆的方法包括许多处理步骤。该方法通常涉及几个冷冻/解冻步骤、将样品从一个管转移到另一个管以及离心分离样品。这是劳动密集型的、耗时的，并且通常与可能经常导致样品不能使用的人为误差和/或泄漏的风险相关联。
7.循环肿瘤dna(circulating tumour dna，ctdna)在患者血液中用于癌症诊断和疾病进展的实时监测的潜在效用是组织活检(tissue biopises)的高度公认的替代方法。然而，由于应用多步离心过程，从外周血中分离血浆以分离循环的无细胞dna(cfdna)缺乏自动化和有效的方法仍然是一个挑战。分离cfdna通常依赖于称为分级分离(fractioning)的样品制备方法，该方法包括使用实验室离心机将血浆与细胞组分分离。尽管离心法是分离
血浆广泛使用的方法，但由于需要几个手动步骤，最终体积总是不一致的，并且由于人为误差，细胞污染的风险显著。此外，离心法在体外诊断(ivd)系统中的实施可能是具有挑战性的，体外诊断系统需要是用户友好的、紧凑的和自动的，以产生可依靠且准确的结果。有许多ivd技术可以用于小体积(＜1ml血液)血浆分离，但这些技术被认为不适合有效和快速地处理提取足够cfdna所需的血量(即10-50ml血液)以用于进一步的下游处理。其它被确定能够处理这种范围的体积的解决方案依赖于体积大并且与患者直接接触的“床侧”设备(即，单采血液组分术)。
8.从诸如全血或血浆流体样品中分离诸如蛋白质分析物的一种方法是使用切向流过滤(tff)。在tff中，大部分流体流切向地穿过过滤器的表面，而不是垂直地进入过滤器，这被称为死端式过滤(def)。tff通常用于包括高比例的小颗粒尺寸固体(例如cfdna)的流体，因为固体材料(例如细胞)可以利用死端式过滤而迅速地使过滤器表面结垢。tff的主要优点是在过滤过程中基本上洗掉了滤饼。
9.(tff)过程的主要驱动力是跨膜压力。然而，在该过程中，跨膜压力可能由于渗透物粘度的增加而降低，因此过滤效率随时间的增加而降低，并且对于大规模处理来说可能是耗时的。可以通过稀释渗透物或增加系统的流速来防止跨膜压力的降低，在处理稀少的分析物(例如cfdna)时，这是不理想的。
10.正是在这个背景下提出了本发明。


技术实现要素：

11.根据本发明，提供了一种用于从流体样品分离至少一种分析物的过滤单元，所述过滤单元包括：入口，所述入口构造成容纳所述流体样品，以及出口，所述出口构造成容纳所述至少一种分析物；流体路径，所述流体路径提供所述入口与所述出口之间的流体连通，其中所述流体路径具有纵向轴线，在使用中所述流体样品沿着所述纵向轴线流动；过滤器，所述过滤器位于所述流体路径中，其中所述过滤器包括构造成允许所述至少一种分析物通过的至少一个表面，并且其中所述至少一个表面基本上与所述流体路径的所述纵向轴线垂直；以及叶轮，所述叶轮位于所述过滤器附近，其中所述叶轮构造成在所述过滤器附近产生切向流体流，并且其中所述叶轮包括联接到至少一个具有倒圆前缘的叶片的可旋转轴。
12.在过滤器附近添加叶轮并且所述叶轮构造成产生切向流体流，叶轮的添加施加了跨膜压力，所述跨膜压力连续地驱动分析物通过过滤器。所述叶轮可以位于入口和过滤器之间。将所述叶轮定位在所述入口和所述过滤器之间“推”分析物通过过滤器。可替代地，或另外，所述叶轮可以位于所述过滤器与所述出口之间。将所述叶轮定位在所述出口和所述过滤器之间“拉”分析物通过过滤器。
13.过滤单元可以包括至少两个叶轮。可替代地，过滤单元可以包括多个叶轮。例如，所述过滤单元可以包括至少1、2、3、4、5或多于5个叶轮。过滤单元可以包括位于入口和过滤器之间的至少一个叶轮和位于过滤器和出口之间的至少一个叶轮。
14.位于入口和过滤器之间的叶轮具有3个优点，即：通过旋转流体运动促进对于诊断装置理想的小过滤器覆盖区内的tff；施加连续驱动血浆通过过滤器的跨膜压力；以及通过“擦拭器”型工艺从过滤器表面物理去除颗粒，从而防止过滤器结垢。
15.位于过滤器和出口之间的叶轮具有各种优点，包括：通过旋转流体运动促进对于
诊断装置理想的小过滤器覆盖区内的tff，施加连续驱动血浆通过过滤器的跨膜压力；以及在过滤器两侧混合样品。
16.利用由叶轮传递的径向运动使流体连续再循环，并产生垂直流体力，驱动分析物通过过滤器，而不需要外部压力。然而，外部压力可以用于加速流体流通过滤器/膜。
17.更具体地说，叶轮可以构造成在过滤器附近产生切向流体流。例如，叶轮可以定位成使得可以产生穿过过滤器的第一表面的切向流体流。可替代地，或另外，叶轮可以定位成使得可以在距离过滤器高达20mm的流体内产生切向流体流。在一些实施例中，产生的切向流体流可以距离过滤器高达0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、5mm、10mm、15mm、20mm、30mm或50mm。切向流体流构造成增加过滤器两侧的压力差，从而驱动分析物通过过滤器。过滤单元可以用于，但不限于，用于早期癌症检测的cfdna的下游处理。其它应用包括提取人、细菌或滤过性毒菌的蛋白质、rna、dna和外来体。流体样品可以经由入口以离散批次供应。可替代地，流体样品可以经由入口连续地供应到过滤单元。
18.旋转叶轮可以在过滤器的至少一个表面上施加切向流体流和/或交叉流，从而产生跨过滤器的压力差，该压力差可以驱动流体流跨过滤器的至少一个表面。
19.叶轮可以是可更换的。叶轮可以根据待分离的分析物进行更换。更换叶轮可以包括不同的特性。叶轮特性可以包括以下中的至少一个：叶轮制造材料的生物相容性；叶片的数量和叶片的几何形状。
20.所述至少一个叶片可以是基本上平面的。所述至少一个叶片可以包括第一表面和相反的第二表面。所述至少一个叶片可以包括至少一个边缘，所述至少一个边缘构造成连接所述第一表面与所述第二表面。所述至少一个边缘可以是倒圆。倒圆边缘使细胞损伤和流体样品组分和/或分析物的溶解最小化。因此，在一些实施例中，所有的叶片边缘可以是倒圆。特别地，前缘可以是倒圆。因此，在使用中，由叶轮施加到样品的剪切应力被最小化。
21.至少一个边缘的至少一部分可以基本上与过滤器的至少一个表面平行。可替代地，或另外，至少一个边缘的至少一部分可以相对于过滤器的至少一个表面成一角度。
22.所述至少一个叶片的第一表面和/或第二表面可以相对于流体路径的纵向轴线成角度α。角度α可以高达10、20、30、40或45度。可替代地，或另外，角度α可以是至少45、50、60、70或80度。相反地，在一些实施例中，至少一个叶片的第一表面和/或第二表面可以基本上与流体路径的纵向轴线平行。因此，在这样的实施例中，角度α可以是大约0度。
23.在一些实施例中，至少一个叶片的第一表面和/或第二表面可以是弯曲的。叶片可以在与流体路径的纵向轴线平行和/或垂直的平面中弯曲。
24.在一些实施例中，叶轮可以包括多个叶片，每个叶片具有倒圆前缘。这增加了tff，从而增加了过滤速度，同时使样品中发生的细胞溶解量最小化。此外，可旋转轴的横截面可以是圆形的。这进一步减少了细胞损伤和流体样品组分和/或分析物的溶解。
25.叶轮和/或叶片可以是光滑的。例如，叶轮和/或叶片(一个或多个)可以被抛光。抛光剂可以构造成从叶轮的表面去除材料以便增加光滑度。
26.叶轮和/或叶片可以是3d打印的。所使用的材料可以是可以模制的。可替代地，或另外，叶轮可以由生物相容和/或生物惰性材料(例如全氟烷氧基(pfa)、聚丙烯(pp)或聚四氟乙烯(ptfe))制成。叶轮可以是非溶血性的。
27.过滤单元可以是一次性使用的装置。因此，在使用后，过滤单元可以被丢弃。可替代地，过滤单元的元件可以被处理掉，其中一次性元件包括过滤器和叶轮。
28.叶轮可以与过滤器间隔开。例如，至少一个叶片的至少一部分可以位于距离过滤器大约0.5mm。在一些实施例中，至少一个叶片的至少一部分可以位于距离过滤器高达0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm、1mm、2mm、5mm、10mm或20mm。增加叶片和过滤器之间的距离可以增加在过滤器上产生的压力差。
29.可替代地，在一些实施例中，至少一个叶片的至少一部分可以构造成接触过滤器。例如，至少一个叶片的至少一部分可以构造成清扫来自过滤器截留物。
30.所述至少一个叶片可以与所述流体路径的侧壁间隔开。例如，至少一个叶片的至少一部分可以位于距离流体路径的侧壁大约0.5mm。在一些实施例中，至少一个叶片的至少一部分可以位于距离流体路径的侧壁高达0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm、1mm、2mm、5mm、10mm或20mm。这可以进一步使样品内发生的细胞溶解量最小化。
31.过滤器可以是可更换的。过滤器可以根据待分离的分析物进行更换。可替代地，或另外，过滤器可以根据流体样品而更换。过滤器可以基于以下中的至少一个来选择：孔径；与流体样品和/或分析物的生物相容性；和表面电荷。
32.可以选择孔径以确保分析物可以通过过滤器。可替代地，或另外，可以选择孔径以确保至少一种预定的截留物不能通过过滤器。可以选择与分析物具有合适的生物相容性的过滤器，以防止在分离之前分析物被破坏或溶解。也可以基于过滤器的表面电荷与用于分离的分析物的表面电荷的比较来选择过滤器。具有非相反表面电荷的过滤器将防止分析物被吸引到过滤器，并将有助于防止过滤器被阻塞。
33.过滤器的至少一个表面可以是编织的。可替代地，或另外，过滤器的至少一个表面可以是径迹蚀刻的。这使得过滤器内的孔径更精确，从而实现预定的输送和保留性质。
34.过滤器的至少一个表面可以基本上与流体路径的纵向轴线垂直。
35.基本上与流体路径的纵向轴线垂直的过滤器使得能够在流体路径内使用比传统tff过滤单元更慢的流速。这防止了截留物需要被稀释，因此防止了渗透物由此被稀释。然而，在一些实施例中，根据待分离的分析物，流体样品可以被稀释。可替代地，或另外，流体样品可以在供应到过滤单元之前被稀释。例如，当连续地供应到过滤单元时，流体样品可以被稀释。
36.过滤器的至少一个表面可以包括孔径在100nm和10μm之间的多个孔。1nm至10μm之间的孔径大小使得选定的分析物(例如来自流体样品(例如血浆)的蛋白质)能够通过过滤器，同时防止流体样品例如全血内的其它较大组分(例如红细胞)通过。过滤器可以由聚偏二氟乙烯(pvdf)或聚四氟乙烯(ptfe)制成，尽管可以使用任何合适的材料。例如，包括至少一个由pvdf制成的表面的过滤器可以包括约0.65μm的孔径。可替代地，约1μm的孔径可以用于由ptfe制造的过滤器的至少一个表面。
37.过滤器的厚度可以高达5mm。可替代地，过滤器的厚度可以高达0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm，5nm、或10mm。过滤器的厚度可以变化。过滤器的厚度可以根据流体样品或用于分离的分析物而变化。
38.该过滤单元可以包括多个过滤器。多个过滤器可以通过在初始过滤步骤期间从流体样品分离较大组分并在随后的过滤步骤中从流体样品分离较小组分来提高过滤速度。这
可以防止过滤器被阻塞或堵塞。不同等级的过滤器可以作为单独的过滤器提供，或者它们可以组合成不对称的过滤器结构，过滤器的上游侧具有比下游侧更大的孔径。
39.流体路径可以是管道。管道可以包括沿其长度的不同横截面积。可以有一个大的横截面积部分来容纳叶轮，上游和下游的横截面积都减小。管道可以包括至少一个侧壁。由于路径被分成多个微流体路径，管道可以包括多个侧壁。管道更清楚地限定流体路径的边界。管道的横截面可以是基本圆形的，因为这可以防止例如任何死角或在拐角中的降低的流体流速。圆形横截面也使得叶轮能够与流体路径内的流体样品和/或分析物均匀地相互作用。此外，横截面为圆形的流体路径可以比横截面为其它更复杂的几何形状的流体路径更容易制造。然而，可以使用任何形状的流体路径，包括基本上“d形”的横截面、“u形”的横截面、“v形”和半圆形的横截面。过滤器附近且位于过滤器与出口之间的流体路径的至少一部分可以包括基本平坦的表面。
40.流体路径可以包括第一腔室。第一腔室可以位于入口和过滤器之间。第一腔室可以位于过滤器附近。第一腔室可以具有比入口更大的横截面积。第一腔室可以具有比出口更大的横截面积。第一腔室可以构造成容纳待过滤的流体样品。第一腔室可以构造成临时存储待过滤的流体样品。第一腔室可以构造成控制过滤器附近的流体样品的流速。流体室可以包括多个腔室。
41.第一腔室可以包括构造成取出至少部分样品的开口。开口可以构造成取出至少一部分截留物。开口可以是可调节的，其中可调节开口构造成调节穿过过滤器的流速。可调节开口可以是完全打开、部分打开或关闭的。
42.通过过滤器的流体流速可以高达每小时100ml。可替代地，通过过滤器的流体流速可以高达每小时5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、35ml、40ml、50ml或75ml。在一些实施例中，可以以大约每小时20-30ml过滤流体样品以分离足量的分析物(例如cfdna)。可以基于分析物来调节过滤器的性质和/或叶轮的性质，从而调节通过过滤器的流体流速。
43.在一些实施例中，可以在小于20分钟内从样品中分离出大约10-30ml滤液。因此，通过过滤器的流体流速可以高达每小时100ml。在这样的实施例中，样品可以具有低粘度和/或低细胞密度。例如，样品可以是尿液；脑脊液(csf)或环境用水。
44.可替代地，在一些实施例中，可以在小于20分钟内从全血样品中分离出大约5-10ml血浆。因此，通过过滤器的流体流速可以高达每小时30ml。
45.过滤速度以收集液体滤液的速度来衡量，过滤速度取决于：
46.·
过滤器滤膜的面积(a)
47.·
滤液体积(v)
48.·
滤液流速(μf)
49.·
具体的流动滤饼阻力(α)(取决于颗粒尺寸和形状)
50.·
固体滤饼的总质量(mc)
51.·
过滤器两侧的压力差(δp)
52.·
过滤器的过滤阻力和内部楔入的任何固体(rm)
53.54.有各种不同的途径来提高过滤速度，包括：
55.1)增加了过滤器的面积，而所有其它的处理参数保持不变。以下等式可以用于在指定时间内处理样品：
[0056][0057]
其中，
[0058]
a＝滤膜的面积(m2)
[0059]
v＝产生的滤液体积(升)
[0060]
j＝滤液流速(升/m2/小时)
[0061]
t＝处理时间(小时)
[0062]
2)增加过滤压降，即跨膜压力，由系统内的各种压力组成的量，以及在搅动期间出现的再循环流体的向下压力矢量的附加分量。
[0063]
3)减少滤饼质量；这是通过叶轮的连续角频率(ω)来实现的，叶轮在滤膜附近扫过流体以确保在过滤器表面上固定的滤饼残留物最少。
[0064]
4)降低样品粘度；样品材料可以任选地在处理开始时或通过渗滤型处理稀释。
[0065]
过滤单元可以包括泵，所述泵构造成增加过滤器上的压力差。例如，泵可以构造成增加入口和过滤器之间的压力。因此，泵可以构造成在入口和过滤器之间产生正压。可替代地，或另外，泵可以经配置以减小过滤器与出口之间的压力。因此，泵可以构造成在过滤器和出口之间产生负压。增加过滤器上的压力差可以实现过滤器上更大的流体流速。例如，泵可以用于产生高达每小时100ml的通过过滤器的流速。
[0066]
通常，通过过滤器的流速将随着时间增加而降低。然而，在一些实施例中，过滤单元可以构造成维持通过过滤器的流速为每小时20-30ml。这可以经由泵来实现，如上所述。例如，泵的功率可以随着时间增加而增加以确保通过过滤器的恒定流速。因此，泵的添加可以用于维持通过过滤器的基本上恒定的流速。此外，泵可以包括控制单元，所述控制单元构造成确保通过过滤器的流速维持在预定范围内。
[0067]
过滤单元还可以包括可操作地连接到叶轮轴的电机。电机可以构造成在使用中旋转叶轮。电机可以是可操作地连接到叶轮轴的步进电机。步进电机可以构造成在使用中以25-450转/分钟(rpm)旋转叶轮轴。
[0068]
通过联轴器连接到叶轮的步进电机提供在过滤单元中获得切向流和跨膜压力所需的旋转运动。此外，步进电机确保叶轮以足够的速度旋转，以防止不需要的组分在过滤器的表面上堆积。
[0069]
在一些实施例中，叶轮可以包括至少一种磁性材料。磁性材料可以由位于叶轮附近的反向磁性材料引起旋转，从而引起叶轮旋转。因此，叶轮可以通过磁力悬浮在流体路径中，从而消除了机械连接的需要。
[0070]
在一些实施例中，叶轮可以包括至少一个翅片，所述翅片构造成围绕基本上与管道的纵向轴线垂直的轴线旋转。所述至少一个翅片可操作地连接到叶轮轴，使得与管道的纵向轴线平行的流体流引起翅片围绕它们的轴线旋转，这又引起叶轮旋转。所述至少一个翅片可以通过锥齿轮可操作地连接到叶轮轴。所述至少一个翅片可以通过90度锥齿轮可操作地连接到叶轮轴。所述至少一个翅片可以具有比所述至少一个叶轮叶片的组合表面积大
的组合表面积。
[0071]
流体样品可以包括10
0-10
15
个颗粒/ml的颗粒浓度。流体样品可以包括10
0-108个颗粒/ml的分析物。
[0072]
引入到单元中的流体样品可以是血浆。在一些实施例中，用于分离的分析物可以是蛋白质、dna、rna、外来体、病毒颗粒、细菌、细胞代谢物和循环肿瘤细胞中的至少一种。可以基于待分离的分析物选择合适的过滤器。
[0073]
流体样品可以是生物物质。例如，液体样品可以是全血、病毒运输介质、脑脊液、鼻咽液体或粪便。可替代地，流体样品可以是环境物质(例如油、石油、柴油颗粒物质(dpm)或土壤样品)。
[0074]
流体路径的尺寸被设定成容纳多达30ml的所述流体样品。一些实施例中，流体路径的尺寸可以被设计成容纳高达1ml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、40ml、45ml、50ml、70ml、100ml、200ml、500ml或多于500ml的样品。
[0075]
过滤单元可以包括用于储存至少一部分流体样品的至少一个储存器。所述至少一个储存器可以位于所述入口与所述过滤器之间。在一些实施例中，所述至少一个储存器可以位于所述入口和所述叶轮之间。所述至少一个储存器可以构造成在过滤流体样品之前储存流体样品的至少一部分。这使得能够使用更大体积的流体样品，同时保持期望的流体流速。因此，通过连续地将流体样品供应到储存器中，可以实现连续过滤。流体样品可以在至少一个储存器中储存至多1秒、10秒、30秒、1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟或多于30分钟。
[0076]
过滤单元可以构造成由支架容纳。过滤单元可以放置在支架上，所述支架包括过滤单元保持件、支架顶部以及连接到底板的多个间隔件。此外，支架可以构造成由外部仪器容纳。外部仪器可以构造成保持电机。
[0077]
在使用中，过滤单元需要最少的人员处理，因此，所述过滤单元适于下游自动化过程以及在进一步小型化后集成在紧凑诊断装置内。所述方法允许立即从流体样品(如全血或血浆)中的组分(如血细胞)中分离分析物(如蛋白质)，以用于进一步分析。标准化的装置确保了结果的一致性，因此相对于目前的手动处理方法是非常有利的。
附图说明
[0078]
现在参照附图仅通过示例的方式进一步且更具体地描述本发明。
[0079]
图1示出了过滤单元；
[0080]
图2a示出了用于本发明的一些实施例的叶轮；
[0081]
图2b示出了图2a所示叶轮；
[0082]
图3a示出了包括一个叶片的叶轮；
[0083]
图3b示出了包括两个叶片的叶轮；
[0084]
图3c示出了包括三个叶片的叶轮；
[0085]
图3d示出了包括四个叶片的叶轮；
[0086]
图3e示出了包括六个叶片的叶轮；
[0087]
图4示出了流体路径的一部分；
[0088]
图5a示出了本发明的一些实施例中的流体路径和过滤器；
[0089]
图5b示出了图5a所示流体路径和过滤器；
[0090]
图6示出了构造成容纳过滤单元的支架；
[0091]
图7示出了构造成容纳图6所示支架的仪器；
[0092]
图8a示出了在450rpm下搅动的血液在过滤单元(例如，放置过滤器的地方)底部的流速分析，示出了在72-520mm/s范围内的速度；
[0093]
图8b示出了当血浆通过过滤器时，血细胞比容水平增加达到80％的水平，没有观察到流速随血细胞比容的变化；
[0094]
图9a示意性地示出了叶轮的运动；
[0095]
图9b示出了在叶片后面产生的涡流；
[0096]
图9c示出了叶轮前面的流体流；
[0097]
图10示出了由旋转叶片施加的流体运动和压力；
[0098]
图11示出了过滤单元内的压力测量；
[0099]
图12示出了随时间推移从血液样品中回收的血浆的量；
[0100]
图13示出了过滤单元的分析物分离能力；
[0101]
图14是示出了过滤材料选择背后的基本原理的示意图；
[0102]
图15示出了筒形的过滤单元的分解图；
[0103]
图16是示出了在30分钟内以0.5ml级分(fractions)回收血浆所花费的时间的图。
[0104]
图17示出了作为总全血的百分比回收的血浆的量；
[0105]
图18是示出了在60分钟内以1ml级分(fractions)回收血浆所花费的时间的图。
具体实施方式
[0106]
图1示出了用于从流体样品分离至少一种分析物的过滤单元10的实施例。过滤单元10包括在入口12和出口14之间提供流体连通的流体路径20。流体路径20包括位于入口12和出口14之间的过滤器30。流体路径20还包括过滤器30附近的叶轮40。更具体地说，流体路径20包括第一腔室24，过滤器30和叶轮40位于第一腔室24中。第一腔室24的横截面积大于入口12和/或出口14的横截面积。然而，在一些未示出的实施例中，第一腔室24的横截面积等于入口12和/或出口14的横截面积。因此，在一些实施例中，流体路径20的横截面是恒定的。该腔室24包括外壳25。在一些未示出的实施例中，腔室外壳25可以是流体路径20的侧壁21。在一些实施例中，如图1所示，入口12位于第一腔室25的顶面或盖23中。
[0107]
入口12构造成容纳流体样品，出口14构造成容纳至少一种分析物。流体路径20具有纵向轴线22，在使用中，流体样品22沿着该纵向轴线22流动。如图1所示，流体路径的横截面可以变化。流体路径可以包括第一腔室24。腔室24的横截面积大于入口和出口的横截面积，从而能够更有效地过滤样品。在一些实施例中，如图5a和图5b所示，流体路径20的纵向轴线22的方向可以变化。例如，入口12与过滤器30之间的流体路径20的纵向轴线22可以是基本上竖直的，而过滤器30与出口14之间的流体路径20的纵向轴线22可以是基本上水平的。可以使用任何定向。例如，流体路径20的纵向轴线22可以是弯曲的或曲折的。
[0108]
在一些实施例中，流体路径20构造成容纳流体样品的连续供应。可替代地，在一些实施例中，流体路径20的尺寸被设计成容纳高达100ml的流体样品。可替代地，流体路径20的尺寸可以被设计成容纳高达5ml、10ml、20ml、30ml、50ml、75ml、100ml或大于100ml的流体
样品。
[0109]
过滤器30包括至少一个表面32，该至少一个表面32构造成允许至少一种分析物通过。过滤器30的至少一个表面32基本上与流体路径20的纵向轴线22垂直，并包括多个孔径在100nm到10μm之间的孔。在一些未示出的实施例中，过滤器的至少一个表面可以相对于流体路径的纵向轴线成角度β。角度β可以是90度(即，垂直)。可替代地，角度β可以相对于流体路径的纵向轴线达到80、70、60、50、40或45度。
[0110]
在一些未示出的实施例中，过滤器的至少一个表面是凸形的。在一些未示出的实施例中，过滤器的至少一个表面是凹形或圆锥形的。可替代地，或另外，过滤器的至少一个表面包括至少一个与流体路径20的纵向轴线22平行的部分。在一些实施例中，过滤器包括至少两个表面，该两个表面构造成允许至少一种分析物通过。该至少两个表面中的每一个可以相对于流体路径的纵向轴线成不同的角度。对于给定的流体路径横截面，非平坦的过滤器表面轮廓增加了过滤器的表面积，从而增加了过滤单元的效率。
[0111]
过滤器30是可更换的。过滤器30可以根据用于分离的流体样品和/或分析物而被更换或替换。过滤器30可以是市售的过滤器或定制设计的过滤器。过滤器30可以由pvdf和ptfe中的至少一种制成。也可以使用其它合适的材料。过滤材料选择的进一步细节在图14中示出。以全血和各种目标分析物为例，可以选择用适当的过滤材料进行分析，图14示出了适用于不同分析物的不同过滤材料。核酸(例如dsdna、ssdna、rna)具有带负电荷的磷酸主链，这意味着限制或消除滤膜上的非特异性吸附，负的表面电荷应促进经由血浆通过亲水性多孔(＞70％)膜。根据待过滤的样品，过滤材料的润湿性是实现流体流过孔的重要考虑因素。由于血浆中92％是水，因此亲水膜是单元操作的最佳选择。
[0112]
选择材料相容性以便也确保流过滤膜的颗粒不发生不良反应，或者确保在过滤器的截留物侧接触的颗粒不发生不良反应。惰性聚合物特别适合于此，以确保与细胞的生物相容性，而不导致细胞溶解或坏死。这不仅适用于过滤器30，而且与样品接触的包括流体路径的所有部件都需要是生物惰性的或至少是生物相容的。
[0113]
过滤器可以包括高达5μm的孔径。在一些实施例中，过滤器可以包括至多0.1μm、0.25μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm或4μm的孔径。过滤器可以包括高达5μm的孔径。
[0114]
过滤器孔径的选择取决于组成样品的组分颗粒尺寸分布，以及将在过滤器下游的滤液路径中浓缩的目标分析物的片段(cfdna)的尺寸和/或分子量。以全血为例，组分的尺寸分布如下：
[0115]
组分尺寸红细胞半径8μm红细胞厚度2μm白细胞半径3至15μm血小板半径1.0至1.5μm细菌0.5至5.0μm病毒约100至800nm蛋白质1.0至5.5nm或者5至500kda无细胞dna1.0至10nm
[0116]
过滤器的孔径，以微米/μm表示，由过滤器保留的颗粒直径或者通过起泡点测试确
定。标称额定值是以90-98％范围内的效率保留限定尺寸颗粒的孔径。例如，0.8微米的过滤器孔径将有效地从血浆中除去红细胞。
[0117]
如果小得多的颗粒是目标分析物，那么孔径可以与通常定义为微过滤的孔径相容，其中分析物的尺寸在0.1至5.0μm的范围内，或者甚至与超过滤的孔径相容，其中分析物的尺寸在0.01至0.1μm的范围内。在这些条件下，孔径由分子量截止值限定，并且选择的值应比球状蛋白质要保留的分析物的值小3至6倍。在下表中显示了保留在滤膜中的核酸、双链dna和单链dna的分子量截止值。
[0118]
截留分子量mwco(da)dsdnassdna1k5-6b.p9
–
32碱基(bases)3k16
–
32b.p32
–
65碱基(bases)5k25-50b.p50
–
95碱基(bases)10k50
–
145b.p95-285碱基(bases)30k145
–
285b.p285
–
570碱基(bases)50k240
–
475b.p475
–
950碱基(bases)100k475
–
1,450b.p950
–
2900碱基(bases)
[0119]
图2a和图2b示出了用于本发明的一些实施例的叶轮；叶轮40位于过滤器30附近。该叶轮包括联接到至少一个叶片44上的可旋转轴。该至少一个叶片44通过枢纽49与轴42联接。然而，可以使用任何数量的叶片。例如，在一些实施例中，可旋转轴联接到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个叶片。
[0120]
图3a至图3e分别示出了适用于本发明的叶轮。流体搅动在处理操作中具有关键作用，通过保持颗粒在流体中的悬浮，使得重力或沉降力最小化。这又减少了滤饼残留物在过滤器顶部的快速累积。流体搅动的有效性取决于流体的流变性质(例如，粘度和密度)。
[0121]
由轴42驱动的旋转叶轮的作用是泵送液体并产生规则的流动模式。在叶轮30附近的流体路径20上添加挡板或添加叶轮30的偏心定位减少了中心表面涡流的产生，该中心表面涡流可以导致空气的夹带和径向或纵向流动的减少。挡板(附图中未示出)的厚度约为流体路径20直径的0.1倍，即挡板占据流体路径20直径的10％。正是在容器中产生并在图9中示出的速度矢量或循环电流的整体方向使颗粒分布在流体中并驱动颗粒运动，降低了滤饼在过滤器表面顶部堆积的速度。流体的附加向下的力驱动滤液流过过滤器。
[0122]
关注所示的示例，图3a示出了包括一个叶片的叶轮；图3b示出了包括两个叶片的叶轮；图3c示出了包括三个叶片的叶轮；图3d示出了包括四个叶片的叶轮；以及图3e示出了包括六个叶片的叶轮。可以使用多种叶轮设计，其中每种不同的设计根据流体样品和目标分析物的类型提供不同的优点。叶片的几何形状、尺寸和相对于轴43的纵向轴线的角度中的至少一者可以与至少一个其它叶片相同。可替代地，叶轮可以包括多个叶片，每个叶片具有不同的几何形状、尺寸和或相对于轴43的纵向轴线的角度。
[0123]
在一些实施例中，每个叶片均包括至少两个通过边缘45连接的相反的面47、48。边缘45是连续的并且围绕叶片的整个外周边/边界延伸。因此，边缘45可以限定各叶片40的各面47、48的边界。边缘45可以为倒圆边缘或倒角边缘。在一些实施例中，边缘45是倒圆边缘或倒角边缘，并且平滑地连接相反的面47和48。倒圆边缘或倒角边缘在使用中减小由旋转叶轮施加到流体的剪切力。
[0124]
如图3c所示，边缘的纵向轮廓的至少一部分是非直线的或弯曲的边缘46。边缘45的纵向轮廓的非直线的或弯曲的部分可以成大约20度(即，沿着边缘的长度)或大约90度(即，在“拐角”)的角度。可替代地，或另外，边缘45的纵向轮廓的非线性或弯曲部分可以处于高达10度、20度、30度、40度、50度、60度、70度、80度、90度或大于90度的角度。
[0125]
在一些实施例中，边缘45的至少一部分基本上与过滤器的至少一个表面平行。在一些实施例中，边缘45的至少一部分基本上与流体路径22的纵向轴线平行。边缘45的基本上与流体路径的纵向轴线平行的部分可以位于距流体路径20的侧壁21高达10mm处。可替代地，在一些实施例中，基本上与流体路径22的纵向轴线平行的边缘45的部分距侧壁21高达1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或大于10mm处。因此，叶片的长度(即，从枢纽49到基本上与流体路径的纵向轴线的叶片边缘的部分之间的距离)可以基于基本上与流体路径的纵向轴线平行的叶片边缘的部分与流体路径20的侧壁21之间的所需距离来确定。
[0126]
至少一个叶轮叶片40构造成在使用中总是被流体样品浸没。因此，叶片40距过滤器30的最大距离由样品尺寸和流体通道20或第一腔室24的几何形状决定。在一些实施例中，叶片40距过滤器30的最大距离为高达10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm或大于100mm。然而，当提供连续的流体样品供应时，叶片40距过滤器30的最大距离因此仅由几何形状决定。
[0127]
在一些实施例中，叶轮包括多个相同的叶片。每个叶片都连接到一个中心枢纽49上，该枢纽49构造成用于联接到旋转轴42上。在一些实施例中，如图3c所示，每个叶片都相对于旋转轴43的纵向轴线成角度α定位。角度α大约为45度。然而，在一些未示出的实施例中，叶片相对于可旋转轴43的纵向轴线以高达10度、20度、30度、40度、50度、60度、70度、80度或90度定位。
[0128]
叶轮40和过滤器30之间的最小距离是1mm。更具体地说，叶片44的任何部分和过滤器32的至少一个表面之间的最小距离为1mm。然而，在一些实施例中，叶轮40和过滤器30之间的最小距离是0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.8mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm或大于50mm。
[0129]
叶轮40构造成在过滤器30附近产生切向流体流。因此，流体样品位于过滤器30和叶轮40之间的流体路径20中，在使用中，该流体样品相对于过滤器30基本上切向地驱动分析物流动通过过滤器30。
[0130]
对于特定使用情况下的最佳叶轮设计的选择取决于样品输入的处理需求，包括剪切、流动状态、粘度、颗粒损坏的减少。通过极端情况来说明这一点，可以采取两种不同的方法：提供具有小叶片面积的高速旋转的叶轮；相反地，提供具有大叶片面积的低速旋转的叶轮。大叶片面积的叶轮对于高粘性液体或非牛顿流体(例如全血)是有效的。由于该叶轮是低剪切叶轮，因此是搅动剪切增稠液体的最佳选择。
[0131]
过滤单元10还包括步进电机50。该步进电机通过联轴器43可操作地连接到叶轮轴42。步进电机50构造成在使用中旋转叶轮40。在一些实施例中，叶轮40以250-450rpm之间的速度旋转。在一些实施例中，叶轮40以高达25rpm、50rpm、100rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm或450rpm的速度旋转。
[0132]
分配处理应该保持在层流状态。一般的考虑取决于如上所述的以rpm表示的叶轮速度、叶轮直径和几何形状以及流体的性质(例如密度和粘度)。对于牛顿流体，这可以用无
量纲数(例如叶轮的雷诺数(rei)和功率数(n
p
))表示。对于非牛顿流体，功率数总是取决于叶轮的雷诺数，因为对于包括高粘性或假塑性流体，例如全血，难以达到湍流状态。通常，非牛顿流体比牛顿(胀流型)流体消耗更少的能量，尽管叶轮的尺寸应该足够大以扫过容器的大体积而与容器壁之间具有很小的间隙。
[0133]
在一些实施例中，如图1所示，叶轮40位于入口12和过滤器30之间。在一些未示出的实施例中，叶轮40位于过滤器30和出口14之间。可替代地，或另外，在一些实施例中，有多个叶轮40。例如，至少一个叶轮40可以位于过滤器30和入口12之间，和/或至少一个叶轮40可以位于过滤器30和出口14之间。
[0134]
在一些实施例中，流体样品是诸如全血等生物物质。然而，可以使用任何流体样品。在一些实施例中，分析物是血浆。然而，任何分析物都可以从流体样品中分离。
[0135]
例如，在一些实施例中，流体样品是5-30ml全血，分析物是血浆。过滤器由pvdf或ptfe制成，并且包括100nm-5μm之间的孔径尺寸。叶轮40以250-450rpm之间的速度旋转。因此，在10-30分钟期间收集2.5-15ml血浆。
[0136]
如图2a和图2b所示，叶轮轴42是管状的。然而，任何横截面形状都可以用于轴42。例如，轴的横截面可以是圆形、三角形或矩形。在一些实施例中，轴的横截面是恒定的。在其它实施例中，轴的横截面是变化的。轴的第一端插入中心枢纽49，轴的第二端与步进电机50联接。轴42通过联轴器43与步进电机50联接。叶轮轴42可以是柔性的或刚性的。叶轮轴42可以由组织相容的、可以串行化的或自动可以裂开的材料或涂层形成。
[0137]
叶轮轴42的长度大约为23mm。可替代地，或另外，叶轮轴的长度高达5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、50mm、70mm、100mm或大于100mm。轴42的直径在1和10mm之间。在一些未示出的实施例中，轴的直径可以高达1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、30mm或大于30mm。在一些实施例中，轴的第一端的直径基本上等于枢纽49的中心部分的直径。
[0138]
图4示出了流体路径20的一部分。流体路径20的横截面是圆形的，并且是中空的。因此，流体路径是一个管道，该管道被设计成能够使流体沿管道的纵向轴线22流动。然而，可以使用任何合适的例如矩形、正方形、三角形或任何其它多边形等横截面。叶轮40和过滤器30位于流体路径20内。入口12位于流体路径20的第一端，出口14位于流体路径的第二端。流体路径的长度高达5mm、高达100mm或甚至高达500mm，其中流体路径的长度是当沿流体管道的纵向轴线测量时入口与出口之间的距离。更具体地说，图4示出了位于流体路径20内的第一腔室24。叶轮40和过滤器30位于流体路径20的第一腔室24内。
[0139]
图5a和图5b示出了位于过滤器30和出口14之间的流体通道20的一部分。在一些实施例中，如图5a和图5b所示，位于过滤器30和出口14之间的流体路径20中的流体流方向基本上与位于入口12和过滤器30之间的流体路径的流动方向垂直。可替代地，在一些实施例中，如图1所示，位于过滤器30和出口14之间的流体路径20中的流体流方向基本上与位于入口12和过滤器30之间的流体路径的流动方向平行。在一些未示出的实施例中，位于过滤器30和出口14之间的流体路径20中的流体流方向与位于入口12和过滤器30之间的流体路径的流动方向垂直。该垂直角度可以相对于位于过滤器30和入口12之间的流体路径20中的流体流方向高达10度、20度、30度、40度、50度、60度、70度、80度或90度。位于过滤器30和出口14之间的流体路径的基本垂直或横向的部分减小了过滤单元10的总体尺寸。此外，位于过
滤器30和出口14之间的流体路径的基本垂直或横向的部分改善了过滤单元的可制造性。
[0140]
过滤器30附近且位于过滤器与出口14之间的流体路径20包括至少一个基本平坦的表面26。该至少一个基本平坦的表面26包括构造成容纳穿过过滤器30的分析物的开口。在一些实施例中，流体路径20的横截面可以是“u形”，其中过滤器30沿着流体路径的基本平坦的顶部定位。然而，流体路径可以包括任何截面形状。
[0141]
图6示出了构造成容纳过滤单元10的支架60。过滤单元10可以放置在支架上，该支架包括过滤单元保持件62、支架顶部64和连接到底板66的四个间隔件65。
[0142]
图7示出了构造成容纳过滤单元10和支架60的仪器70。该仪器70构造成支撑步进电机50。步进电机50通过可旋转联轴器43连接到叶轮40。步进电机50为叶轮40提供在流体路径内获得切向流动所需的旋转运动，从而产生穿过过滤单元中的过滤器的跨膜压力。电机50安装在90度支架72上，该支架72连接到线性轨道74上。轨道高度可以自动或手动控制。
[0143]
计算流体动力学(computational fluid dynamic，cfd)建模用于研究过滤单元的机械原理，并且用于评估带搅动死端式过滤单元(dead end filtration unit with stirring，defs)系统的流速和压力。过滤器和叶轮在cfd软件中重复设计，并且为了优化计算成本，使用了跨越过滤单元特征的对称性。
[0144]
在模拟中，过滤单元用血细胞比容水平为40％或80％的10ml血液建模，其中第一个是当没有血浆被滤出时血细胞比容的代表性水平，而第二个表示当血浆被过滤时增加的细胞浓度。叶轮速度设定为450或250转/分钟(rpm)。模拟血液为非牛顿流体，遵循剪切稀化流体的卡罗纳斯模型(carreau’s model)，而由于雷诺数大于10，使用k-ε湍流模型求解物理特性。如图8a所示，在450rpm下搅动的血液的过滤单元底部(例如，放置过滤器的地方)的流速分析显示，速度范围在72-520mm/s之间。
[0145]
高速区域位于朝向过滤单元的外边缘，而观察到低速区域朝向def的中心。在过滤过程开始时，假定血液具有40％的血细胞比容。当血浆通过过滤器时，血细胞比容水平增加，达到80％的水平。如图8b所示，没有观察到流速随血细胞比容的变化。
[0146]
血液速度分析示出了，叶轮如图9a中示意性地示出的那样旋转。如图9b所示，在叶片的上游产生涡流。这些涡流对细胞产生再循环效应，将细胞从其未受干扰的状态搅动。如图9c所示，在叶片的下游形成擦拭机构。
[0147]
细胞的搅动和擦拭的组合可能减少过滤器结垢，同时促进连续的含水血浆过滤。如图10所示，由旋转叶片施加的流体运动导致在过滤器单元底部的压力增加。
[0148]
如图11所示，在450rpm和40％的血细胞比容水平下，压力达到4kpa。当血细胞比容接近80％时，在过滤过程结束时压力几乎加倍。这与由于高血细胞浓度而引起的粘度增加有关。
[0149]
通过cfd推测的机械原理进行了实验测试。将人全血(10ml)引入defs中，其中过滤单元包括由pvdf制成的具有0.65μm孔径的过滤器或由ptfe制成的1μm孔径的过滤器。如图12所示，叶轮速度设定在450rpm，并且随时间测量过滤的血浆体积。
[0150]
30分钟后，使用置于defs中的1μm或0.65μm过滤器分别回收90％和75％的血浆。为了显示defs可以用于分离血浆和回收cfdna，将9ml人全血掺入50ng/ml的5％突变等位基因级分(mutant allele fraction，maf)cfdna，并加载到具有0.65μm孔径pvdf膜过滤器的过滤单元中，同时将叶轮速度设定为450rpm，如图13所示。将过滤的血浆收集在1ml级分中，并
使用市售试剂盒进行提取。使用基于等位基因特异性探针的qpcr来测定cfdna提取效率。在defs系统上证明从人全血回收cfdna，原则上，证明过滤单元可以用于血浆分离和从高质量血浆中潜在下游提取分析物。
[0151]
因此，过滤单元具有潜在的更广泛的应用，包括：各种样品类型/液体活检；几种疾病和生物标记(cfdna测试的rna、外来体、蛋白质)；分批(测试)和连续过程；产量大，体积小；独立实验室使用或集成到诊断装置中；并且可能集成到可用的格式中。
[0152]
该过滤单元可以包括多个叶轮。过滤单元依赖于血浆过滤的新机制。利用由叶轮传递的径向运动导致细胞的连续再循环和驱动血浆通过过滤器的垂直流体力，而不需要外部压力。本发明的另一新颖性是模块化的概念，模块化需要最少的人员处理，因此其适于下游的自动化过程以及在进一步小型化时集成在紧凑的诊断设备内。该方法允许立即分离血浆和血细胞以用于进一步分析。标准化的装置确保了结果的一致性，并因此与当前的手动处理方法相比具有很大的优势。
[0153]
图15示出了筒形的过滤单元的分解图。如前所述，参照图1至图5b，过滤单元包括在入口12和出口14之间提供流体连通的流体路径20。流体路径20包括位于入口12和出口14之间的过滤器30。流体路径20还包括叶轮40，叶轮40具有可旋转轴42和过滤器30附近的至少一个叶片44。
[0154]
然而，在一些实施例中，如图15所示，过滤单元还构造成容纳至少一个真空容器80、81，真空容器80、81包括将被过滤的样品。更具体地，过滤单元包括两个真空容器导向套筒82、83，两个真空容器导向套筒82、83分别位于支撑件84、85内。此外，每个真空容器导向套筒82、83包括鲁尔针(luer needle)86、87，路厄针构造成穿透真空容器80、81并使样品经由入口12进入流体路径20。
[0155]
以下实施例详述了过滤单元的一种可能的设置以及在血浆回收、溶血、来自wbc溶解的gdna污染和cfdna回收方面的所得性能。例如，根据本发明，具有腔室外壳、第一腔室、丙烯酸盖、过滤膜和叶轮的过滤单元位于支架内并与步进电机联接。使用trinamic步进电机驱动器和软件。叶轮是3d打印的，并且如图3a所示形成。过滤单元与0.65μm膜滤器装配在适当位置。过滤器的直径为47mm，由具有0.65μm径迹蚀刻孔的亲水性聚偏二氟乙烯(pvdf)制成。叶轮和过滤器之间的距离为0.37mm。
[0156]
然后从装置中取出步进电机和叶轮并放在一边。将50ml锥形管盖置于出口附近，并设计成在使用时捕获血浆，将1500μl stemcell easysep缓冲液移液到腔室外壳的内表面(该单元的死体积部分)上。所有与等离子体接触的表面都被完全涂覆。然后将白色扩散盘插入到涂覆的腔室外壳上。
[0157]
用500μl stemcell easysep
tm
缓冲液(dulbecco’s pbs，2％ fbs，1mm edta)预湿润过滤单元(包括膜过滤器)的所有内表面。限制预润湿缓冲液的气泡产生以防止膜堵塞。
[0158]
然后将过滤单元重新定位在支架中。在不使过滤单元变干的情况下，在预润湿后小于10秒，将来自真空采血管的全血体积倒入过滤单元中。将步进电机/叶轮放回到支架上，确保叶轮在膜过滤器上方自由移动。然后使用trinamic步进电机驱动器和软件使叶轮以400,000ppt(～450rpm)的速度和200ppt的加速度旋转。
[0159]
使用移液管将通过过滤器的血浆流以1ml级分收集在50ml锥形管盖中以确定体积。在整个30分钟的运行时间内记录收集每1ml级分的时间。对各级分拍照以定性检查血浆
质量(溶血作用)。
[0160]
过滤单元操作30分钟，使用单个10ml真空容器输送样品。除非另有说明，否则始终使用大气压。
[0161]
图16是示出了以0.5ml级分回收血浆所花费的时间的图。对于回收的第一个2ml血浆(约0.3ml/min)观察到接近线性的趋势，剩余的收集组具有逐渐减小的斜率。回收的血浆记录为从总全血体积中回收的血浆的百分比。图17示出了作为总全血的百分比回收的血浆的量。平均而言，过滤单元回收全血体积的43％的血浆(34.15-55％)。然而，已经观察到，在腔室外壳内在过滤膜下方的死体积空间中始终保持有大约0.75ml的血浆。不拆开过滤单元就不能回收该血浆。
[0162]
过滤单元具有直径为47mm，深度为30mm，总体积为50ml，并且容纳直径为47mm的亲水性pvdf膜过滤器。滤膜包括0.65μm径迹蚀刻孔，该蚀刻孔从全血过滤血浆。当10ml全血加入defs中时，需要大约30分钟来重新获得总血浆体积，而没有观察到过滤器的堵塞。
[0163]
此外，将总全血体积增加至20ml，并且使过滤单元运行60分钟，记录了达到每1ml血浆级分的时间，并在图18中示出。观察到类似的渐近趋势和类似的初始最大流速(～0.3ml/min)，没有看到堵塞。
[0164]
如前所述，确定和减少在过滤单元内发生的细胞溶解量也是重要的。来自带搅动死端式过滤(defs)的全血样品中的红细胞(rbc)溶解将导致细胞内血红素的释放，血红素是公知的聚合酶链式反应(pcr)抑制剂。一些技术，例如稀释和/或使用血红素抗性酶，可以帮助降低抑制作用，但是其它对测定灵敏度要求和对样品体积限制阻止了血红素抗性酶作为全部溶液。因此，应当进行限制rbc在def中溶解的所有尝试。当在defs分离的血浆中存在高水平的可见溶解时，pcr抑制可以通过测试纯的和50％稀释的样品来测试。如果血红素存在的水平足以抑制pcr，那么50％稀释的样品将在纯样品之前扩增。通常，defs分离的血浆没有或具有最小的溶血作用，并且颜色是“麦秆”色。然而，当使用如上所述的本发明的过滤装置时，在最明显的溶血的def分离的血浆样品中没有检测到pcr抑制。
[0165]
此外，来自defs的全血样品中的白细胞(wbc)溶解将导致过多的非靶向hgdna，并且当测序时，导致靶向cfdna中的信号损失。可以使用两种pcr测定来确定defs分离的血浆中hgdna污染和总dna的水平，即：
[0166]
1.一种hgdna分析，其靶向于815bp的单拷贝基因，所述单拷贝基因不包括任何靶向cfdna片段。
[0167]
2.一种具有常见肿瘤热点突变的单拷贝基因的靶向165bp总dna测定。该分析也可以与等位基因特异性探针一起使用，以检测回收的cfdna的突变等位基因频率(maf)。
[0168]
从第二种测定减去第一种测定中检测到的基因拷贝量，得到靶向cfdna的拷贝总数。使用本发明的过滤装置的上述方法的defs血浆分离性能示出了，与1ml血浆中290个拷贝的靶向cfdna浓度lod相比，1ml血浆中存在＜50个拷贝的hgdna。
[0169]
另外，可以使用靶向合成的(非人的)165bp gblock片段的直向同源分析，当该片段被掺入时，可以不依赖于样品中存在的背景dna而评价其回收率。
[0170]
测试五种不同类型的血液收集管与defs血浆回收-k2 edta、acd-a、roche cfdna、streck bct和streck cyto-chex的相容性。所有收集管类型允许血浆回收(＞70％)，然而具有不同的产率、cfdna回收率和细胞溶解。k2-edta和acd-a表现最好，具有可以再现的血
浆回收率(＞90％)和cfdna回收率(＞60％)，具有最小的细胞溶解。
[0171]
此外，在一些实施例中，可以使用不含dna的设计全血样品来掺入已知量的cfdna参考物质(或任何其它目标参考物质)。该物质的回收率可以使用defs血浆分离来确定。制备方法包括以下步骤：获得单个10ml真空采血管的新鲜人全血；在1000g@4℃离心10分钟；用移液管手动吸出血浆上清液，留下0.5ml血浆以保存血沉棕黄层(注意除去的血浆体积)；加入1ml sensid人工技术血浆(含有正常健康收集的血浆蛋白、edta等的所有主要组分的合成血浆)并混合；在1000g@4℃离心10分钟；用移液管手动吸出血浆上清液，留下0.5ml血浆以保存血沉棕黄层；加入与前一步骤中取出的血浆上清液相同体积的sensid人工技术血浆并混合。
[0172]
因此，总之，本发明的目的是开发一种自动化的无离心分离血浆分离方法，其关键要求是在30分钟的处理时间内输入10-20ml人全血样品。另外，该装置必须具有最小的白色和红色血液溶解，并且与下游qpcr和测序相容。
[0173]
defs装置的一个关键要求是回收3.5-5.0ml血浆体积。平均而言，defs回收全血体积的43％的血浆，因此满足这个要求。血浆回收体积的主要变量是通过放血术抽取的血液的体积和血细胞比容水平。可以将至多20ml全血加入过滤装置中，而没有任何膜过滤器堵塞或结块。
[0174]
从defs回收的大部分血浆是期望的“麦秆”颜色，通过定性评估没有观察到溶血。偶尔在血浆级分中观察到溶血梯度，血浆颜色更红。这种梯度可以归因于血液抽取、患者与患者之间的差异或血液收集管。另外，由于预润湿defs单元的问题，可能发生溶血。easysep缓冲液目前用于预湿润/阻塞defs表面，然而已经观察到过滤器的任何干燥或气泡的存在导致回收的血浆的量减少或堵塞。defs单元的下杯的硅氧烷涂层也已经示出了与在减少死体积中的血浆损失时用easysep缓冲液预湿润是等效的，但不是更好的。尽管存在溶血作用，但任何血红素携带都不会引起任何下游qpcr问题，这表明本发明的过滤单元和cfdna分离方法将与下一代测序(next generation sequencing，ngs)相容。尽管一些样品示出了红细胞溶解和血红素携带，但是来自白细胞溶解的hgdna污染始终保持在或低于hgdna特异性qpcr测定的检测限。
[0175]
鉴于本公开，本发明的各种进一步的方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。“和/或”在本文使用时，被认为是两个指定的特征或部件中的每一个的具体公开，具有或不具有另一个。例如，“a和/或b”应被认为是(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，就像每个在此单独地陈述一样。
[0176]
除非上下文另有规定，否则以上陈述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例，并且等同地应用于所描述的所有方面和实施例。本领域技术人员还将理解，尽管已经参考若干实施例通过示例描述了本发明，但是本发明不限于所公开的实施例，并且可以在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下构造替代实施例。

技术特征：
1.一种用于从流体样品分离至少一种分析物的过滤单元，所述过滤单元包括：入口，所述入口构造成容纳所述流体样品，以及出口，所述出口构造成容纳所述至少一种分析物；流体路径，所述流体路径提供所述入口与所述出口之间的流体连通，其中所述流体路径具有纵向轴线，在使用中，所述流体样品沿着所述纵向轴线流动；过滤器，所述过滤器位于所述流体路径中，其中所述过滤器包括构造成允许所述至少一种分析物通过的至少一个表面，并且其中所述至少一个表面基本上与所述流体路径的所述纵向轴线垂直；以及叶轮，所述叶轮位于所述过滤器附近，其中所述叶轮构造成在所述过滤器附近产生切向流体流，并且其中所述叶轮包括可旋转轴，所述可旋转轴联接到至少一个具有倒圆前缘的叶片。2.根据权利要求1所述的过滤单元，其中所述叶轮包括多个叶片，每个所述叶片具有倒圆前缘。3.根据权利要求1或2所述的过滤单元，其中所述可旋转轴的横截面是圆形的。4.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述叶轮位于所述入口和所述过滤器之间。5.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述叶轮与所述过滤器间隔开。6.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述过滤器是可更换的。7.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述过滤器的所述至少一个表面基本上与所述流体路径的所述纵向轴线垂直。8.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述过滤器的所述至少一个表面包括孔径在1nm和10μm之间的多个孔。9.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述过滤单元包括多个过滤器。10.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述流体路径是管道。11.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述过滤单元构造成使通过所述过滤器的流体流速维持在每小时20-30ml。12.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元还包括泵，所述泵构造成增加所述过滤器两侧的压力差。13.根据权利要求4所述的过滤单元，其中所述泵构造成在所述过滤器和所述出口之间产生负压。14.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述叶轮是可更换的。15.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述过滤单元还包括可操作地连接到所述叶轮轴的步进电机，并且其中，所述步进电机构造成在使用中，以250-450rpm旋转所述叶轮轴。16.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述流体样品包括10
0-108个颗粒/ml的所述分析物。17.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述分析物是蛋白质。18.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述流体样品是生物物质。19.根据前述权利要求中任一项所述的过滤单元，其中所述流体路径的尺寸设定成容
纳多达30ml的所述流体样品。

技术总结
提供了一种用于从流体样品分离至少一种分析物的过滤单元。过滤单元包括：入口，所述入口构造成容纳流体样品，以及出口，所述出口构造成容纳至少一种分析物；流体路径，所述流体路径提供入口与出口之间的流体连通，其中所述流体路径具有纵向轴线，在使用中流体样品沿着纵向轴线流动；过滤器，所述过滤器位于流体路径中，其中所述过滤器包括构造成允许至少一种分析物通过的至少一个表面，并且其中至少一个表面基本上与所述流体路径的所述纵向轴线垂直；以及叶轮，所述叶轮位于过滤器附近，其中所述叶轮构造成在过滤器附近产生切向流体流，并且其中所述叶轮包括联接到至少一个具有倒圆前缘的叶片上的可旋转轴。前缘的叶片上的可旋转轴。前缘的叶片上的可旋转轴。


技术研发人员：亚历山德罗
受保护的技术使用者：DNAE诊断有限公司
技术研发日：2021.10.15
技术公布日：2023/8/24