取代三嗪化合物及其制备环肽和订书肽的方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种取代三嗪化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.多肽药物作为国内外生物医药创新研发的重点领域，一直保持良好的发展前景。当前，在多肽药物研究方向受到了国内外学者的广泛关注和研究。由于线性多肽的血浆稳定性、细胞通透性和靶向性等方面表现差，导致多肽在转化成药物过程仍然存在多种挑战。为了改善多肽的生物物理特性，往往需要进行化学修饰，其中多肽的环化或者钉合是一种非常有效的策略。钉合的多肽能够约束多肽的构象，增加野生型多肽的稳定性，并且通过减少结合的熵垒，增加对目标蛋白的亲和力。在天然多肽中，酪氨酸占20种氨基酸的3.3％。酪氨酸在生理条件下的p ka为10，其修饰通常不改变蛋白质的离子状态和稳定性，这与赖氨酸和半胱氨酸修饰不同。因此，对含有酪氨酸的多肽进行标记、修饰，对药物的研究与开发具有重要的价值与意义。因此，针对含有酪氨酸的多肽进行环化或者钉合的方法，在药物的研究与开发具有重要的价值与意义。
3.三嗪衍生物的母体结构是带有3个活泼氯原子的稳定的六元环，氯原子能够被-oh、-nh2、-or、-nhr等官能团取代，从而生成不同的衍生物，广泛应用于各个领域。三嗪环衍生物是一种高效的缩合试剂，能够与羧基形成活性酯，从而实现酰胺键的缩合。
4.目前，通过科研人员的努力，已经开发出来多种关于多肽的环化或者钉合的策略。这些方法大多都是针对半胱氨酸、赖氨酸和天冬氨酸，但是针对酪氨酸的环化或者钉合策略的研究很少被研究。因此，我们发现1,3,5-三嗪双功能连接剂可以同时与有两个酪氨酸残基的多肽反应，从而实现对多肽的环化或者钉合。这是多肽环化或者钉合策略的方法库是一种有效的补充，并且为多肽偶联药物的研究提供了新的思路。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供了一种通过取代三嗪化合物环化或者订合多肽的方法和应用，所得到取代三嗪化合物可以很好与多肽中的酪氨酸进行结合，从而实现对多肽的环化或者订合。该方法具有很好地生物开发前景，可用于对含酪氨酸对的活性多肽进行环化或订合，以提高活性多肽的部分生物活性。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种取代三嗪衍生物，具有如式(i)所示结构式：
7.8.其中，r3选自cl、br、i、吡啶、n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷、4-甲基吡啶及其取代衍生物中的任意一种及其盐；
9.x1和x2选自o、n或nh，x1和x2相同或不同；
10.y选自碳原子数为1-10的烷基或聚乙二醇链；
11.r1、r2选自碳原子数为1-10的烷基炔、乙二醇数为1-10的聚乙二醇炔、甲基、甲氧基、苯基、卤素取代苯基、甲基取代苯基、硝基取代的苯基、原子数为1-10的烷基叠氮或乙二醇数为1-10的聚乙二醇叠氮中的任意一种，r1和r2相同或不同。
12.进一步的，所述的取代三嗪衍生物结构具体如表1所示：
13.表1.化合物的编号和结构
14.[0015][0016]
以2,4,6-三卤素-1,3,5-三嗪化合物为起始原料，与含不同氨基、羟基取代基的化合物在有机碱条件下经取代反应得中间体a，然后进一步与中间体b在无机碱条件下通过第二步取代反应得到中间体c，再通过与相应中间体a在无机碱条件下通过第三步取代反应得
到化合物d，最后与相应的含氮叔胺化合物在有机溶剂中反应得到化合物e。
[0017]
上述制备方法的路线如下：
[0018][0019]
其中，x1和x2为o或nh，x1和x2相同或不同；y选自碳原子数为1-10的烷基和聚乙二醇链；r1、r2选自碳原子数为1-10的烷基炔、乙二醇数为1-10的聚乙二醇炔、甲基、甲氧基、苯基、卤素取代苯基、甲基取代苯基、硝基取代的苯基、原子数为1-10的烷基叠氮或乙二醇数为1-10的聚乙二醇叠氮中的任意一种，r1和r2相同或不同；r3为cl、br、i；r4选自n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷、吡啶及其取代衍生物中的任意一种及其盐。
[0020]
其中，在最后得到取代三嗪衍生物的步骤中，反应时间可以为25-40min，本领域技术人员可根据实际反应情况进行选择，例如30、35min等。
[0021]
本发明还提供了一种根据上述任一技术方案所述的取代三嗪化合物对含多肽进行环化或者钉合的应用。
[0022]
作为环化或者钉合的肽的对象，所述的肽为包含酪氨酸或者引入酪氨酸对的多肽。
[0023]
进一步的，提供了化合物a-13环化α-芋螺毒素im1后在血浆稳定性方面的提高，此外还提供了化合物a-15环化或者钉合靶向肽rgd序列后，在血浆稳定性和靶向整合素能力的提升。
[0024]
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
[0025]
1.本发明提供了一种新的取代三嗪化合物，该化合物由2,4,6-三卤素-1,3,5-三嗪化合物与含羟基或者氨基的取代化合物反应，然后通过烷基链或者聚乙二醇连将两个部分连接，改变三嗪环的电子效应和紫外及荧光吸收，同时与n-甲基吡咯烷反应成盐，增加其水溶性，实现对含有羧基、酚羟基的氨基酸的选择性标记；
[0026]
2、本发明提供了一种取代三嗪化合物针对含酪氨酸对的多肽进行环化或者钉合的应用，质谱和hplc检测结果表明，部分取代三嗪化合物可以很好的与多肽进行环化或者钉合，具有很好地生物开发前景，可用于对含酪氨酸的多肽进行环化或者钉合。
附图说明
[0027]
图1为本发明实施例28提供化合物a-13与α-芋螺毒素y-im1反应后所得产物的hplc和hrms的检测谱图；
[0028]
图2为本发明实施例28提供化合物a-15与靶向肽y-rgd反应后所得产物的hplc和hrms的检测谱图；
[0029]
图3为本发明实施例29和实施例30提供化合物im1，y-im1，b-2，y-rgd，b-3在血浆
中的稳定性研究；
[0030]
图4为本发明实施例31提供多肽与荧光基团fitc结合后的结构；
[0031]
图5为本发明实施例31提供具有荧光基团的多肽对u-87mg细胞中整合素的靶向性能力研究。
具体实施方式
[0032]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。
[0034]
实施例1
[0035]
n,n'-双(4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)甲基二胺(化合物a-1)的制备
[0036][0037]
于100ml反应瓶中加入2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪(200mg,1.1mmol)，苯硼酸(134mg,1.1mmol)，pd(pph3)2cl2(8mg,0.011mmol),k2co3(607mg,4.4mmol)，抽真空，氮气置换气体三次，加入5ml甲苯和1ml水，于60℃油浴中搅拌反应5h。经tlc检测，反应完全。用乙酸乙酯和水萃取两遍，有机相用饱和食盐水洗涤一遍，用无水硫酸钠干燥。经硅胶柱层析分离得到产物2,4-二氯-6-苯基-1,3,5-三嗪198mg，收率为80％。ms(esi):m/z,225.0[m+h]
+
.1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.52
–
8.46(m,2h),7.61
–
7.48(m,3h),4.17(s,3h).
[0038]
于50m l圆底烧瓶中加入2,4-二氯-6-苯基-1,3,5-三嗪(198mg,0.88mmol)、亚甲基二胺(24μl,0.53mmol)和20ml四氢呋喃，搅拌状态下加入n,n-二异丙基乙胺(175μl,1.06mmol)，室温搅拌反应1h。经tlc检测，反应完全。用乙酸乙酯和水萃取两遍，有机相用饱和食盐水洗涤一遍，用无水硫酸钠干燥。经硅胶柱层析分离得到化合物a-1(162mg,87％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.29
–
8.21(m,2h),7.50(dp,j＝4.7,2.0hz,3h),5.35(s,1h),2.45(s,1h).hrms(esi-tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
19h15
n8cl2424.0718,found427.0727.
[0039]
实施例2
[0040]
n1,n
2-双(4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)乙烷-1,2-二胺(化合物a-2)的制备
[0041]
按照实施例1的方法，将亚甲基二胺替换为乙二胺，制得化合物a-2(140mg,72％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.81
–
8.71(m,2h),8.29
–
8.14(m,4h),7.66
–
7.43(m,6h),3.72
–
3.57(m,4h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ172.1,171.4,170.7,169.9,166.2,166.2,135.1,135.0,133.3,133.2,129.2,129.2,128.9,128.7,26.3,26.2,26.1.hrms(esi-tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
20h17
n8cl2439.0948,found439.0938.
[0042]
实施例3
[0043]
n1,n
3-双(4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)丙烷-1,3-二胺(化合物a-3)的制备按照实施例1的方法，将亚甲基二胺替换为1,3-丙二胺，制得化合物a-3(123mg,63％)。1hnmr
(400mhz,dmso-d6)δ8.67(dq,j＝11.6,5.8hz,1h),8.35
–
8.10(m,2h),7.68
–
7.32(m,3h),3.57(p,j＝6.4hz,1h),3.44(p,j＝6.4hz,1h),1.90(dh,j＝13.0,6.8hz,1h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ172.0,171.9,171.4,169.9,169.9,166.3,166.2,134.9,133.3,133.1,129.2,129.1,129.1,129.0,128.7,128.7,128.7,38.3,38.2,28.5,28.2.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
21h18n835
cl2453.1104,found 453.1092；calcd for c
21h18n835
cl
37
cl 455.1075,found 455.1061.
[0044]
实施例4
[0045]
n1,n
4-双(4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺(化合物a-4)的制备按照实施例1的方法，将亚甲基二胺替换为1,4-丁二胺，制得化合物a-4(117mg,57％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.67(dq,j＝11.6,5.8hz,1h),8.35
–
8.10(m,2h),7.68
–
7.32(m,3h),3.57(p,j＝6.4hz,1h),3.44(p,j＝6.4hz,1h),1.90(dh,j＝13.0,6.8hz,1h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ172.0,171.9,171.4,169.9,169.9,166.3,166.2,134.9,133.3,133.1,129.2,129.1,129.1,129.0,128.7,128.7,128.7,38.3,38.2,28.5,28.2.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
21h18n835
cl2453.1104,found 453.1092；calcd for c
21h18n835
cl
37
cl 455.1075,found 455.1061.
[0046]
实施例5
[0047]
n1,n
7-双(4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)庚烷-1,7-二胺(化合物a-5)的制备按照实施例1的方法，将亚甲基二胺替换为1,7-庚二胺，制得化合物a-5(103mg,46％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.27
–
8.19(m,2h),7.50(dp,j＝4.7,2.0hz,3h),3.79(s,1h),3.65(t,j＝7.6hz,2h),1.67(p,j＝7.7hz,2h),1.38
–
1.22(m,3h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ167.29,164.27,164.04,136.29,131.68,128.62,128.45,41.99,31.19,28.26,26.91.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
25h27
n8cl2508.1657,found 508.1673.
[0048]
实施例6
[0049]
n1,n
10-双(4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)癸-1,10-二胺(化合物a-6)的制备按照实施例1的方法，将亚甲基二胺替换为1,10-癸二胺，制得化合物a-6(94mg,39％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.32
–
8.22(m,1h),7.53
–
7.47(m,1h),3.68
–
3.61(m,1h),1.72
–
1.62(m,1h),1.38
–
1.28(m,1h),1.32
–
1.19(m,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ167.29,164.27,164.04,136.29,131.68,128.62,128.45,41.99,31.19,28.89,28.57,26.91.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
28h33
n8cl2550.2127,found 550.2151.
[0050]
实施例7
[0051]
1,4-双((4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)氧基)丁烷(化合物a-7)的制备按照实施例1的方法，将亚甲基二胺替换为1,4-丁二醇，制得化合物a-7(91mg,44％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.67(dq,j＝11.6,5.8hz,1h),8.35
–
8.10(m,2h),7.68
–
7.32(m,3h),3.57(p,j＝6.4hz,1h),3.44(p,j＝6.4hz,1h),1.90(dh,j＝13.0,6.8hz,1h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ174.3,171.8,171.4,134.4,134.0,129.5,129.3,129.2,128.9,69.0,25.0.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
22h18
o2n6cl2469.0941,found 469.0932.
[0052]
实施例8
[0053]
4-氯-n-(4-((4-氯-6-苯基-1,3,5-三嗪-2-基)氧基)丁基)-6-苯基-1,3,4-三嗪-2-胺(化合物a-8)的制备
640.9891.
[0067]
实施例13
[0068]
n1,n
4-双(4-氯-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺(化合物a-13)的制备
[0069]
按照实施例1的方法，将2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪替换为2,4-二氯-6-甲氧基-1,3,5-三嗪、亚甲基二胺替换1,4-丁二胺，制得化合物a-13(136mg,82％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.54(dt,j＝17.3,5.7hz,2h),3.94
–
3.75(m,6h),3.35
–
3.22(m,4h),1.54(h,j＝5.2,4.1hz,4h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ171.2,170.6,170.5,169.6,166.9,166.8,55.3,26.3,26.2,26.1.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
12h17
o2n8cl2375.0846,found 375.0842.
[0070]
实施例14
[0071]
n1,n
2-双(4-氯-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺(化合物a-14)的制备
[0072]
按照实施例1的方法，将2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪替换为2,4-二氯-6-甲基-1,3,5-三嗪、亚甲基二胺替换1,4-丁二胺，制得化合物a-14(113mg,75％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.52(dt,j＝17.0,5.7hz,2h),3.34
–
3.24(m,4h),2.31(s,3h),2.27(s,3h),1.53(tt,j＝5.5,2.5hz,4h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ177.92,177.88,176.82,171.36,169.91,169.12,167.52,165.85,165.76,26.20,26.15,26.11,26.07,25.58,25.55,25.02,22.23,21.14,17.03,16.82.hrms(esi)m/z:[m+h]-calcd for c
12h16
n8cl2343.0948,found 343.0943.
[0073]
实施例15
[0074]
n1,n
4-双(4-(丁-3-炔-1-氧基)-6-氯-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺(化合物a-15)的制备
[0075]
按照实施例1的方法，将2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪替换为2-(丁-3-烯-1-氧基)-4,6-二氯-1,3,5-三嗪、亚甲基二胺替换1,4-丁二胺，制得化合物a-15(117mg,59％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.59(t,j＝5.7hz,1h),8.51(t,j＝5.7hz,1h),4.39
–
4.27(m,4h),3.29(tt,j＝6.9,4.5,4.0hz,4h),2.90(q,j＝2.8hz,2h),2.62(dp,j＝6.6,3.2hz,4h),1.54(h,j＝3.9,3.4hz,4h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ170.5,170.5,169.9,169.7,166.8,166.7,81.3,81.2,73.2,73.1,65.9,65.7,40.5,39.7,26.2,26.1,18.8.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
18h20
o2n8cl2451.1159,found 451.1149.
[0076]
实施例16
[0077]
n2,n2'-(丁烷-1,4-基)双(n
4-(3-溴苯基)-6-氯-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)(化合物a-16)的制备
[0078]
按照实施例1的方法，将2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪替换为n-(3-溴苯基)-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-胺、亚甲基二胺替换1,4-丁二胺，制得化合物a-16(155mg,54％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.53(dt,j＝7.5,2.0hz,1h),7.26(dt,j＝7.5,2.0hz,1h),7.08(t,j＝7.4hz,1h),6.85(t,j＝2.1hz,1h),5.25(s,1h),3.98(s,1h),3.68
–
3.62(m,2h),1.73
–
1.63(m,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ168.00,164.56,163.11,142.00,130.44,126.67,123.13,122.31,120.38,41.99,26.88.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
22h22n10
br2cl2653.9596,found 653.9576.
[0079]
实施例17
[0080]
4,4'-((丁烷-1,4-双(氮杂基))双(6-苯基-1,3,5-三嗪-4,2-基))双(4-甲基吗啉-4-鎓)氯化物(化合物a-17)的制备
[0081]
于50ml的反应瓶中加入化合物a-4(94mg,0.2mmol)和10ml四氢呋喃搅拌溶解，在搅拌状态下缓慢滴加入n-甲基吗啉(37mg,0.4mmol)，于室温搅拌反应30min，有白色固体析出。过滤，固体用thf冲洗两遍，干燥，得到化合物a-17(73mg,61％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.53(dt,j＝7.5,2.0hz,1h),7.26(dt,j＝7.5,2.0hz,1h),7.08(t,j＝7.4hz,1h),6.85(t,j＝2.1hz,1h),5.25(s,1h),3.98(s,1h),3.68
–
3.62(m,2h),1.73
–
1.63(m,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ168.00,164.56,163.11,142.00,130.44,126.67,123.13,122.31,120.38,41.99,26.88.hrms(esi)m/z:[m+h]
+
calcd for c
22h22n10
br2cl2653.9596,found 653.9576.
[0082]
实施例18
[0083]
1,1'-((丁烷-1,4-双(氮杂基))双(6-苯基-1,3,5-三嗪-4,2-基))双(1-甲基吡咯烷-1-鎓)氯化物(化合物a-18)的制备
[0084]
按照实施例17的方法，将n-甲基吗啉替换为n-甲基吡咯烷，制得化合物a-18(90mg,71％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.22(qd,j＝4.9,4.4,2.2hz,4h),7.50(dp,j＝4.7,2.0hz,6h),4.59(ddd,j＝12.4,6.1,1.5hz,2h),4.21(ddd,j＝12.5,10.8,6.3hz,1h),3.91(s,1h),3.87
–
3.79(m,1h),3.74(s,1h),3.65(dt,j＝10.5,2.6hz,2h),3.65(s,2h),3.36(d,j＝12.1hz,6h),3.30
–
3.14(m,2h),2.13
–
2.00(m,2h),2.03
–
1.93(m,2h),1.88(dddd,j＝15.6,10.5,5.7,2.1hz,2h),1.86
–
1.71(m,2h),1.68(s,2h),1.71
–
1.64(m,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ167.58,163.49,162.83,137.20,131.68,128.45,127.70,58.90,46.35,41.99,26.88,21.84.hrms(esi)m/z:[m+2h]
2+
calcd for c
32h44n10
o2318.1486,found318.1472.
[0085]
实施例19
[0086]
1,1'-((丁烷-1,4-双(氮杂基))双(6-苯基-1,3,5-三嗪-4,2-基))双(吡啶-1-鎓)氯化物(化合物a-19)的制备
[0087]
按照实施例17的方法，将n-甲基吗啉替换为吡啶，制得化合物a-19(95mg,86％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.13
–
9.07(m,1h),9.08
–
9.02(m,1h),8.45
–
8.37(m,2h),8.33(dq,j＝5.4,1.5hz,2h),8.10(tq,j＝7.4,1.6hz,1h),7.53
–
7.47(m,3h),3.65(dt,j＝10.5,2.6hz,1h),3.65(s,1h),1.73
–
1.63(m,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ165.12,162.66,156.82,146.41,143.37,136.29,131.68,129.77,128.62,128.45,41.99,26.88.hrms(esi)m/z:[m+2h]
2+
calcd for c
32h32n10
o2318.1486,found 318.1472.
[0088]
实施例20
[0089]
1-(4-甲氧基-6-((4-(吡啶-1-鎓-1-基)-6-(间甲苯氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)丁基)氨基)-1,3,4,5-三嗪2-基)吡啶-1-氯化鎓(化合物a-20)的制备
[0090]
按照实施例17的方法，将n-甲基吗啉替换为吡啶、化合物a-1替换为6-氯-n
2-(4-(4-氯-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)丁基-n
4-(间甲苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺，制得化合物a-20(91mg,75％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.17
–
9.11(m,1h),9.06
–
8.98(m,3h),8.45
–
8.37(m,4h),8.06(qt,j＝7.5,1.6hz,2h),7.49(dt,j＝7.5,2.0hz,1h),7.26
–
7.15(m,2h),6.82(dt,j＝7.5,1.8hz,1h),5.12(s,1h),3.97(d,j＝11.0hz,4h),3.87(s,
1h),3.65(dt,j＝10.5,2.8hz,2h),3.65(s,2h),2.33(d,j＝1.2hz,3h),1.72
–
1.64(m,2h),1.68(s,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ170.52,165.85,164.83,163.14,157.09,156.22,146.41,143.37,141.47,137.69,129.77,128.86,124.88,120.90,120.28,54.78,41.99,26.88,21.45.hrms(esi)m/z:[m+2h]
2+
calcd for c
28h33n11
o 303.6045,found303.6023.
[0091]
实施例21
[0092]
1-(4-甲氧基-6-((4-((3-硝基苯基)氨基)-6-(吡啶-1-鎓-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)丁基)氨基)-1,3,5,5-三嗪2-基)吡啶-1-氯化鎓(化合物a-21)的制备
[0093]
按照实施例17的方法，将n-甲基吗啉替换为吡啶、化合物a-4替换6-氯-n
2-(4-(4-氯-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)丁基-n
4-(3-硝基苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺，制得化合物a-21(91mg,80％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.12(ddd,j＝21.0,8.3,1.5hz,2h),8.99(ddd,j＝8.3,2.6,1.5hz,2h),8.45
–
8.37(m,4h),8.14(tt,j＝7.5,1.5hz,1h),8.06(tt,j＝7.4,1.7hz,1h),7.98(dd,j＝7.2,1.9hz,2h),7.80(dt,j＝7.5,2.0hz,1h),7.41(t,j＝7.4hz,1h),5.29(s,1h),4.01(s,3h),3.96(s,1h),3.89(s,1h),3.65(dt,j＝10.5,2.8hz,2h),3.65(s,2h),1.72
–
1.64(m,2h),1.68(s,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ170.52,165.85,164.83,163.14,157.09,156.22,149.18,146.41,143.37,142.10,130.34,129.77,122.35,117.82,113.66,54.78,41.99,26.88.hrms(esi)m/z:[m+2h]
2+
calcd for c
27h30n12o32+
284.1198,found 284.1172.
[0094]
实施例22
[0095]
1-(4-((3-叠氮丙基)氨基)-6-((4-(4-甲氧基-6-(吡啶-1-鎓-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)丁基)氨基)-1,3,5三嗪2-基)吡啶-1-氯化鎓(化合物a-22)的制备
[0096]
按照实施例17的方法，将n-甲基吗啉替换为吡啶、化合物a-4替换为n
2-(3-叠氮丙基)-6-氯-n
4-(4-((4-氯-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)丁基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺，制得化合物a-22(72mg,68％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.04(dt,j＝7.1,1.4hz,2h),9.02
–
8.96(m,2h),8.45
–
8.37(m,4h),8.06(tq,j＝7.4,1.6hz,2h),4.01(s,3h),3.96(s,1h),3.91(s,1h),3.84(s,1h),3.69
–
3.62(m,3h),3.65(s,3h),2.21(tt,j＝7.5,4.9hz,2h),1.72
–
1.64(m,4h),1.30(t,j＝4.9hz,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ170.52,165.85,165.77,157.09,156.63,146.41,143.37,129.77,54.78,49.11,41.99,39.00,27.94,26.88.hrms(esi)m/z:[m+2h]
2+
calcd for c
24h34n14o22+
265.1358,found 265.1311.
[0097]
实施例23
[0098]
1,1'-((丁烷-1,4-双(氮杂基))双(6-(己基-5-炔-1-氧基)-1,3,5-三嗪-4,2-基)双(吡啶-1-鎓)(化合物a-23)的制备
[0099]
按照实施例17的方法，将化合物a-4替换为n1,n4双(4-氯-6-(己基-5-炔-1-基氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺、n-甲基吗啉替换为吡啶，制得化合物a-23(117mg,34％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.13
–
9.07(m,1h),9.01(ddt,j＝9.8,6.9,1.6hz,3h),8.45
–
8.37(m,4h),8.06(dddt,j＝7.5,5.9,3.5,1.7hz,2h),4.22(t,j＝7.3hz,4h),3.69
–
3.61(m,4h),2.18(td,j＝5.1,3.0hz,4h),1.96
–
1.86(m,6h),1.72
–
1.64(m,4h),1.49
–
1.39(m,4h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ173.11,166.07,157.31,146.41,143.37,129.77,84.39,71.51,68.53,41.99,28.17,26.88,25.23,18.31.
[0100]
实施例24
[0101]
1,1'-((丁烷-1,4-双(氮杂基))双(6-(2-(丙-2-炔-1-氧基)乙氧基)-1,3,5-三嗪-4,2-基)双(吡啶-1-鎓)氯化物(化合物a-24)的制备
[0102]
按照实施例17的方法，将化合物a-4替换为n1,n4双(4-氯-6-(2-(丙-2-炔-1-氧基)乙氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺、n-甲基吗啉替换为吡啶，制得化合物a-24(117mg,42％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.13
–
9.05(m,2h),9.05
–
8.99(m,2h),8.45
–
8.37(m,4h),8.06(tt,j＝7.5,1.5hz,2h),4.43(t,j＝3.4hz,4h),4.11(d,j＝3.1hz,4h),4.01(s,1h),3.89
–
3.80(m,5h),3.69
–
3.60(m,4h),2.54(t,j＝3.0hz,1h),2.49(t,j＝2.9hz,1h),1.73
–
1.63(m,4h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ173.11,166.07,157.31,146.41,143.37,129.77,79.45,74.62,69.94,66.21,58.27,41.99,26.88.
[0103]
实施例25
[0104]
1,1'-((丁烷-1,4-双(氮杂基))双(6-(2-(丙-2-炔-1-氧基)乙氧基)-1,3,5-三嗪-4,2-基)双(吡啶-1-鎓)(化合物a-25)的制备
[0105]
按照实施例17的方法，将化合物a-4替换为n1,n
4-双(4-((5-叠氮基)氧基)-6-氯-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺、n-甲基吗啉替换为吡啶，制得化合物a-25(117mg,26％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.04
–
8.94(m,4h),8.45
–
8.37(m,4h),8.06(tt,j＝7.5,1.5hz,2h),4.22(t,j＝4.8hz,4h),3.91(s,1h),3.69
–
3.61(m,4h),1.85
–
1.76(m,4h),1.72
–
1.64(m,4h),1.64
–
1.56(m,4h),1.36
–
1.26(m,8h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ173.11,166.07,157.31,146.41,143.37,129.77,71.51,51.59,41.99,29.32,28.94,26.88,26.51.
[0106]
实施例26
[0107]
1,1'-((丁烷-1,4-双(氮杂基))双(6-(2-(2-叠氮氧基)乙氧基)-1,3,5-三嗪-4,2-基)双(吡啶-1-鎓)氯化物(化合物a-26)的制备
[0108]
按照实施例17的方法，将化合物a-4替换为n1,n
4-双(4-(2-(2-叠氮氧基)乙氧基)-6-氯-1,3,5-三嗪-2-基)丁烷-1,4-二胺、n-甲基吗啉替换为吡啶，制得化合物a-26(117mg,32％)。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.99(dddd,j＝8.6,7.1,5.2,1.5hz,2h),8.45
–
8.37(m,2h),8.06(tdt,j＝7.5,4.6,1.5hz,1h),4.43(t,j＝3.6hz,2h),3.81(t,j＝3.6hz,2h),3.69
–
3.61(m,1h),3.65(s,1h),3.40(t,j＝4.1hz,2h),1.73
–
1.63(m,2h),1.50(t,j＝4.1hz,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ173.11,166.07,157.31,146.41,143.37,129.77,69.90,69.52,66.21,48.51,41.99,26.88.
[0109]
实施例27：三嗪类化合物和多肽的环化或者订合反应
[0110]
于反应瓶中加入肽1(nh
2-yaaay-conh2，1eq)，加入化合物a-1～a-22(1eq)，加入5mldmf，搅拌5min。加入n-甲基吡咯烷(10eq)，室温搅拌反应8h，通过制备型高效液相色谱进行纯化得到对应的化合物，产率如表2。
[0111]
表2.肽1的订合产率(％)
[0112]
[0113][0114]
注：“a”表示每个单元格中的数字代表由相应的肽和连接物形成的订书肽产物的hplc/ms产率，并根据相对峰面积确定产率。
[0115]
实施例28：
[0116]
化合物a-13与α-芋螺毒素、化合物a-15与靶向肽rgd的订合产物的制备。
[0117]
于反应瓶中加入α-芋螺毒素y-im1(nh
2-ygccsdprcawrcy-conh2,1eq)，加入化合物a-13(1eq)，加入5mldmf，搅拌5min。加入n-甲基吡咯烷(10eq)，室温搅拌反应8h，通过lc-ms对反应进行检测监测反应结束。使用制备型高效液相色谱进行纯化,得到化合物b-2(图1a)，并通过hplc和hrms对化合物进行表征(图1b)。
[0118]
用同样的方法，将α-芋螺毒素im1替换为y-rgd(nh
2-yrgdy-conh2,1eq)、化合物a-13替换为化合物a-15(1eq)，得到化合物b-3(图2a)，并通过hplc和hrms对化合物进行表征(图2b)。
[0119]
实施例29：α-芋螺毒素环化或订合后的血浆稳定性评价
[0120]
实验目的：为了评估这种装订方法是否可以提高血浆中肽的稳定性，我们将芋螺毒素im1(nh
2-gccsdprcawrc-conh2)、y-im1(nh
2-ygccsdprcawrcy-conh2)和订合产物b-2(图3a)分别在人源血浆中孵育，并通过hplc和ms分析多肽的降解情况。
[0121]
实验条件摸索：分别配置1mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml和0.01mg/ml的不同浓度的多肽水溶液，用hpic检测其基线，能否被完全检测到。结果：hplc检测发现，当浓度为0.1mg/ml和0.01mg/ml时，检测线太低，用于血浆稳定性中，提取加分离可能无法检测，当0.2mg/ml时，检测线可以明显检测到，于是決定血浆的检测浓度大于0.2mg/ml。
[0122]
实验步骤：分别取1.6mg多肽溶解于0.8ml水中，配置成2mg/ml的多肽溶液。血浆：血浆解冻后，取适量于反应管中，于37℃孵育15-20min。然后，分别取200μl相应的多肽溶液加入到800μl血浆中，配置成0.4mg/ml的血浆多肽反应溶液。每个多肽分别做三组平行实验。分别于0h，0.5h,1h，2h，3h，4h，6h，使蛋白变性，4℃ 14000rcf离心机离心10min。取上清液，进行hplc检测。
[0123]
实验结果：im1与人源血浆孵育24h后，im1降解了89％左右，引入酪氨酸的y-im1的
降解情况类似于im1，因此在多肽中酪氨酸对多肽的稳定性影响几乎可以忽略不计。然而，从图3b中，我们可以得出对于订合后的多肽b-2，在人源血浆中孵育24h后仅降解了47％，这表明了订书肽的血浆稳定性明显提高。
[0124]
实施例30：靶向肽rgd环化或订合后的血浆稳定性评价
[0125]
实验目的：为了评估这种装订方法是否可以提高血浆中肽的稳定性，我们将靶向肽y-rgd和b-3(图3a)分别在人源血浆中孵育，并通过hplc和ms分析多肽的降解情况。
[0126]
实验步骤：按照实施例13的实验步骤的方法进行。
[0127]
实验结果：降解情况如图3，其中线性肽y-rgd的半衰期仅为22min，并且在1h内迅速降解完全；但其对应的订合产物b-3的半衰期为7h左右，并在24h内缓慢降解完全。
[0128]
实例25和实例26的结果表明，采用该方式订合的多肽的血浆稳定性较订合前得到了明显提高(图3b)。
[0129]
实施例31：靶向肽rgd环化或订合后的靶向性活性评价
[0130]
实验原理：据文献报道整合素在u-87mg细胞中过表达，而rgd序列因其对肿瘤细胞中过表达的整合素具有较高的亲和力而备受关注。为了更好的观察研究了订书肽b-3结合整合素的能力，我们将靶向肽rgd(nh
2-yrgdy-conh2)和订书肽b-3引入荧光基团fitc，得到带有荧光的多肽c-1和c-2以便于对环肽进行靶向整合素的生物学评价。同时，我们从市场购入rgd序列的环肽cyclo-rgdfk，通过lys的侧链的氨基与荧光基团fitc结合，得到具有荧光的环肽c-3作为阳性对照(图4)。然后使用化合物c-1、c-2和c-3分别与u-87mg细胞进行培养。
[0131]
实验步骤：u-87mg细胞在含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中生长并维持在37℃，5％的co2。在用带有荧光的多肽进行染色实验之前，用1ml的培养基将细胞播种在mattek玻璃底微孔盘的表面。1天后，用温热的dmem培养基清洗细胞两次，在37℃下用合适的5μm的肽培养90分钟并固定。在cilengitide-阻断组中，将细胞与5μm的cilengitide在冰上孵化30分钟，然后分别用c-1～c-3染色。使用leica tcs sp8共聚焦荧光显微镜拍摄图像(图5a)。使用imagej测量fitc信号的荧光强度，并对c-1组进行归一化(图5b)。图片是用leica tcs sp8共聚焦荧光显微镜拍摄。
[0132]
实验结果：从荧光染色的结果，我们可以看出荧光缀合物c-1对细胞的荧光染色较弱，我们以线性肽7的荧光强度作为对照，从图5b中可以得出与缀合物c-3共同孵育的细胞产生的荧光强度是线性肽7的2.81倍，缀合物c-2引起的荧光染色强度是线性肽的3.56倍，其引起的荧光染色强于缀合物c-3产生的荧光，这表明订书肽c-2可以显著增强rgd序列与整合素的结合能力。在平行实验中，使用cilengitide进行预阻断，这是一种环化的含rgd的五肽，以其对整合素αvβ3和αvβ5的高结合亲和力和选择性而闻名。c-2的荧光急剧下降，表明化合物b-3选择性地与整合素结合(图5c)。这些结果表明，这种钉装多肽的方式可以改善多肽的某些生物学特性。
[0133]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.取代三嗪衍生物，其特征在于，具有如式(i)所示结构式：其中，r3选自cl、br、i、n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷、吡啶及其取代衍生物中的任意一种及其盐；x1和x2选自o或nh，x1和x2相同或不同；y选自碳原子数为1-10的烷基或聚乙二醇链；r1、r2选自碳原子数为1-10的烷基炔、乙二醇数为1-10的聚乙二醇炔、甲基、甲氧基、苯基、卤素取代苯基、甲基取代苯基、硝基取代的苯基、原子数为1-10的烷基叠氮或乙二醇数为1-10的聚乙二醇叠氮中的任意一种，r1和r2相同或不同。2.根据权利要求1所述的取代三嗪衍生物，其特征在于，选自下述编号的化合物，具体为：
3.根据权利要求1或2所述的取代三嗪衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以2,4,6-三卤素-1,3,5-三嗪化合物为起始原料，与含不同氨基、羟基取代基的化合物在有机碱条件下经取代反应得中间体1，然后进一步与含碳原子数为1-10的烷基或聚乙二醇的化合物在无机碱条件下通过第二步取代反应得到中间体2，再通过与相应中间体1在无机碱条件下通过第三步取代反应得到中间体3，最后与相应的含氮叔胺化合物在有机溶剂中反应得到取代三嗪衍生物及其盐。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含不同氨基、羟基取代基的化合
物中的化合物选自碳原子数为1-10的烷基炔、乙二醇数为1-10的聚乙二醇炔、甲基、甲氧基、苯基、卤素取代苯基、甲基取代苯基、硝基取代的苯基、原子数为1-10的烷基叠氮或乙二醇数为1-10的聚乙二醇叠氮中的任意一种。在中间体1的反应步骤中，所加入的含不同氨基、羟基取代基的化合物与有机碱的摩尔比为1：(1-2)。在中间体2的反应步骤中，所加入的含碳原子数为1-10的烷基或二乙基二硫醚基的化合物与无机碱的摩尔比为(2-3)：1。5.根据权利要求1或2所述的取代三嗪化合物在对多肽环合或者钉合中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多肽为包含所述酪氨酸对的多肽。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多肽为α-芋螺毒素im1。8.根据权利要求1或2所述的取代三嗪化合物在制备能够提高多肽的血浆稳定性的环化或者订合产物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多肽靶向肽rgd。10.根据权利要求1或2所述的取代三嗪化合物在通过制备环化或者订合产物以提高靶向整合素能力中的应用。

技术总结
本发明提出一种类三嗪衍生物及其制备订书肽的方法和用途，属于生物医药技术领域。本发明提供的取代三嗪衍生物，具有如式(I)所示结构式：取代三嗪化合物在对多肽环合或者钉合中得到有效的应用，质谱和HPLC检测结果表明，部分取代三嗪化合物可以很好的与多肽进行环化或者钉合，并且对于环化或者订合后的多肽，在血浆稳定性和细胞靶向性方面的表现有明显提高。这些化合物具有很好地生物开发前景，可用于对多肽进行订合的订合剂。合的订合剂。合的订合剂。


技术研发人员：江涛 于日磊 张越 王朝明
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/8/23