一种亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素B1的方法

一种亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的方法
技术领域
1.本发明涉及一种亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的降解方法。
技术背景
2.酸枣仁是鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，具有补肝、宁心、敛汗、生津的功效，具有良好的药用价值和保健功能。近年来，酸枣仁市场流通混乱、质量参差不齐，优质资源缺乏的问题，黄曲霉毒素污染现象层出不穷，从酸枣仁种植、采收到加工、储藏、运输等环节。酸枣仁中脂肪、蛋白质等成分会加剧黄曲霉毒素产生，污染后的黄曲霉毒素难以彻底消除。
3.黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等真菌产生的一类毒性极强、致癌性极高的次级代谢产物。目前已发现和报道的20多种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素b1是毒性最强的一种，其毒性是氰化钾毒性的10倍，砒霜毒性的68倍，对人类和动物体具有致畸、致癌和致突变作用，被国际癌症研究家机构(iarc)认定为第i类致癌物质。黄曲霉毒素b1性质稳定，不溶于水和非极性有机溶剂，易溶于氯仿、甲醇等极性有机溶剂；对光和热极稳定，温度达到268℃以上，方可破坏其毒性结构；酸性及中性条件下稳定，ph在8.5以上时，容易将其分解。
4.目前，主要采用物理、化学和生物脱毒技术降低黄曲霉毒素b1的含量。物理方法包括高温破坏、吸附、辐照、等离子体等，但由于用到的设备一般为大型设备，存在潜在危险多。化学脱毒主要是通过化学物质与黄曲霉毒素b1结合，通过破坏其化学结构，起到降低黄曲霉毒素b1毒性的作用。常见的化学脱毒措施包括氧化脱毒、强碱脱毒和有机酸脱毒。然而化学脱毒会破坏原料中的营养成分，添加的化学物质残留；对于一些强碱性物质对实验设备的技术要求均较高。生物法脱毒主要是利用微生物发酵所产生的代谢产物破坏黄曲霉毒素b1结构，改变其原有的生物活性，使其转化为其他无毒性或者毒性较小的代谢产物。然而利用微生物降解黄曲霉毒素b1，可能存在微生物自身对原料产生风险的问题。
5.精细化学品亚硫酸氢钠被广泛应用于棉织物和有机物的漂白剂，在工业和医药中均有应用；食品级亚硫酸氢钠可用作食品漂白剂，防腐剂，具有抗氧化性。
6.传统的化学试剂熏蒸防止中药材霉变的技术为使用硫磺、二甲基甲酰胺、磷化铝、环氧乙烷等。其中，硫磺熏蒸中药材是一种高效的传统防霉技术，具有明显的抗菌作用、操作简单、成本低，但是会造成二氧化硫在药材中残留，影响药材的质量和疗效；二甲基甲酰胺、磷化铝、环氧乙烷本身或者在服用过程中对人体造成危害。本发明选择弱碱亚硫酸氢钠，因具有强氧化性、属于食品添加剂范畴，在一定用量下对人体危害小。本技术专利通过响应面设计方法确定最佳亚硫酸氢钠质量浓度、处理时间、处理温度、黄曲霉毒素b1初始浓度四个因素对黄曲霉毒素b1降解进行考察，并经过lc-ms的方法测定酸枣仁中黄曲霉毒素b1含量，从而降低酸枣仁食用风险。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的降解方法。
8.为了解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：
9.利用甲醇将黄曲霉毒素b1标准品配制成10mg/l的储存液，而后利用甲醇∶水＝60∶40的甲醇水配制成不同浓度的工作液：0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、250、500ng/ml。其中取0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50ng/ml用于制备标准曲线；
10.在酸枣仁与亚硫酸氢钠溶液固液比为100g∶20ml条件下，将亚硫酸氢钠溶液在边喷洒边混匀条件下均匀分布在酸枣仁表面，在一定温度避光条件下反应一定时间；
11.以单因素试验法，分别考察亚硫酸氢钠质量浓度、处理时间、处理温度和初始黄曲霉毒素b1浓度对黄曲霉毒素b1降解率的影响；
12.以单因素试验为基础，进行关键因子筛选，以黄曲霉毒素b1降解率为响应值，以亚硫酸氢钠质量浓度、处理时间、处理温度和初始黄曲霉毒素b1浓度为自变量，进行四因素三水平的响应面分析试验；
13.通过软件对单因素试验的试验结果进行分析及作图，以及对响应面试验进行设计、数据处理、作图及方差分析，确定最优工艺参数。
14.可选地，亚硫酸氢钠质量浓度为0.01％～2％，处理时间为3h～48h，处理温度为35℃～75℃，初始黄曲霉毒素b1浓度为10μg/kg～500μg/kg。
15.可选地，亚硫酸氢钠质量浓度为0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％，处理时间为3、6、9、12、24、36、48h，处理温度为35、45、55、60、65、70、75℃，初始黄曲霉毒素b1浓度为10、50、100、200、500μg/kg。
16.通过液相质谱联用仪测定超标酸枣仁中的黄曲霉毒素b1含量，选择最佳亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1方法。
17.通过液相高分辨质谱联用仪测定酸枣仁中黄曲霉毒素b1降解产物。
18.可选地，通过origin 2020软件对单因素试验的试验结果进行分析及作图。
19.可选地，使用designexpert 12软件对响应面试验进行设计、数据处理及方差分析，利用origin 2020对响应面试验进行作图，
20.可选地，使用thermo scientific xcalibur v4.2收集黄曲霉毒素b1二级质谱信息，compound discoverer v3.3收集降解产物数据信息，mass frontier v8.0预测降解产物碎片，
21.本发明技术方案效益是：
22.通过单因素试验，考察了亚硫酸氢钠质量浓度、处理时间、处理温度、初始黄曲霉毒素b1四个因素对黄曲霉毒素b1降解率为评价指标，通过用软件进行box-behnken试验(响应面试验)设计并对试验结果进行响应面分析优化。
23.本发明通过单因素试验、响应面试验，优化得到最佳酸枣仁中黄曲霉毒素b1降解方法，并利用最佳降解条件降解黄曲霉毒素b1分析降解产物信息。该方法亚硫酸氢钠质量浓度、处理温度在单因素基础上一定程度下降低，可降低酸枣仁品质的变化风险。
24.本发明是将亚硫酸氢钠溶液均匀的喷洒于酸枣仁表面，配合加热处理实现黄曲霉毒素b1脱毒。将酸枣仁置于带盖容器中，最佳温度下，每隔一段时间混匀翻动酸枣仁并将亚硫酸氢钠溶液均匀地喷洒于酸枣仁表面后盖上盖子，处理一定时间后，将酸枣仁再次烘干直接进入下一步处理。该方法即可降低化学试剂的使用量，又可高效降解黄曲霉毒素b1毒性。经试验测定，脱毒后酸枣仁中的黄曲霉毒素b1含量符合《中国药典2020版》的要求，提高
了酸枣仁的品质，保障了酸枣仁的食用安全性。
附图说明
25.图1为黄曲霉毒素b1标准曲线图；
26.图2为黄曲霉毒素b1离子色谱图；
27.图3a是不同质量浓度亚硫酸氢钠对黄曲霉毒素b1降解率影响的单因素图；
28.图3b是不同处理时间对黄曲霉毒素b1降解率影响的单因素图；
29.图3c是不同处理温度对黄曲霉毒素b1降解率影响的单因素图；
30.图3d是初始黄曲霉毒素b1浓度对黄曲霉毒素b1降解率影响的单因素图；
31.图4为摘要附图；
32.图4a是亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的亚硫酸氢钠质量浓度与处理时间交互作用响应面图；
33.图4b是亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的亚硫酸氢钠质量浓度与处理温度交互作用响应面图；
34.图4c是亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的亚硫酸氢钠质量浓度与黄曲霉毒素b1初始含量交互作用响应面图；
35.图4d是亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的处理时间与处理温度交互作用响应面图；
36.图4e是亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的处理时间与黄曲霉毒素b1初始含量交互作用响应面图；
37.图4f是亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的处理温度与黄曲霉毒素b1初始含量交互作用响应面图；
38.图5是产物[m+h]
+c17h15
o9s降解途径解析图；
[0039]
图6是产物[m+h]
+c17h15
o8降解途径解析图。
具体实施方式
[0040]
以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。
[0041]
实施例一酸枣仁样品染毒
[0042]
准确称取100g酸枣仁放入具塞锥形瓶中，分别加入20ml黄曲霉毒素b1甲醇溶液(1.25、7.5、12.5、25、62.5μg/l)，涡旋摇匀，使黄曲霉毒素b1甲醇溶液均匀喷洒在酸枣仁表面；将具塞锥形瓶敞口放入通风橱中，使甲醇完全挥发，制得含毒量分别为10、50、100、200、500μg/kg的酸枣仁样品。
[0043]
实施例一黄曲霉毒素b1降解率的测定
[0044]
黄曲霉毒素b1测定方法建立：
[0045]
流动相a为5mmol/l乙酸铵+0.1％甲酸水，流动相b为甲醇∶乙腈(v∶v)＝50∶50，流速为0.3ml/min，进样体积为5μl，柱温30℃，运行时间6min，雾化气压力45psi，325℃，11l/min，干燥气流速9l/min，300℃；毛细管电压为3500v，扫描方式为mrm多反应监测；
[0046]
黄曲霉毒素b1标准曲线的绘制
[0047]
将规格为1.0mg的黄曲霉毒素b1标准品，用甲醇溶解定容至100ml，摇匀，配制成
10mg/l的黄曲霉毒素b1储备液，用甲醇∶水＝60∶40稀释成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50ng/ml系列浓度梯度的黄曲霉毒素b1标准溶液。利用液相质谱联用仪(lc-ms)测定黄曲霉毒素b1峰响应值。以黄曲霉毒素b1浓度(ng/ml)为横坐标，黄曲霉毒素b1峰响应值为纵坐标绘制标准曲线。进行线性回归，得回归方程：y＝1111.2x+935.01，r2＝0.9963，如图1。结果表明黄曲霉毒素b1在0.1～50ng/ml内其浓度与响应值呈现良好的线性关系。
[0048]
黄曲霉毒素b1含量的测定
[0049]
酸枣仁烘干后粉碎，过40目筛，精密称定5g，加入氯化钠3g，加入40ml，75％甲醇水，300r/min震荡提取20min后，8000r/min，离心10min后取上清液10ml加入30ml1％吐温20(pbs溶液配制)，再8000r/min离心10min后取20ml上清液过0.45μm后过黄曲霉毒素b1免疫亲和柱，再用20ml去离子水洗脱，而后取1.5ml甲醇洗脱黄曲霉毒素b1后，定容至2ml，置于色谱瓶中，最后利用液相质谱仪测定。
[0050]
利用lc-ms测定黄曲霉毒素b1峰响应值，将响应值带入黄曲霉毒素b1标准曲线中，测定黄曲霉毒素b1含量。根据公式计算出黄曲霉毒素b1浓度，按以下公式计算黄曲霉毒素b1的降解率：
[0051][0052]
c0：初始黄曲霉毒素b1浓度；c1：处理后样品中黄曲霉毒素b1浓度
[0053]
实施例二单因素试验
[0054]
(1)亚硫酸氢钠质量浓度对黄曲霉毒素b1降解率的影响
[0055]
固定处理时间24h，处理温度65℃，酸枣仁中黄曲霉毒素b1浓度为100μg/kg不变，酸枣仁与亚硫酸氢钠溶液的固液比为100g∶20ml，配制质量浓度为0.02％、0.04％、0.1％、0.2％、0.4％、1％、2％、4％的nahso3溶液，65℃避光条件下处理24h后，干燥粉碎，而后测定黄曲霉毒素b1含量，步骤同上。
[0056]
由图3可知，随着亚硫酸氢钠质量浓度的上升，黄曲霉毒素b1降解率增大，当亚硫酸氢钠质量浓度达到1％时，黄曲霉毒素b1降解率达到稳定，并随着亚硫酸氢钠质量浓度的增加，黄曲霉毒素b1降解率未发生显著性变化。
[0057]
处理时间对黄曲霉毒素b1降解率的影响
[0058]
固定处理温度为65℃，体系中亚硫酸氢钠质量浓度为1％、酸枣仁中黄曲霉毒素b1浓度为100μg/kg不变。酸枣仁与亚硫酸氢钠溶液的固液比为100g∶20ml，分别避光反应3、6、9、12、24、36、48h，其他步骤同上。
[0059]
由图4可知随着处理时间的增长，黄曲霉毒素b1降解率逐渐增大，当处理时间增长至36h时，黄曲霉毒素b1降解率达到稳定，并随着处理时间增长至48h，黄曲霉毒素b1降解率未发生显著性变化。
[0060]
处理温度对黄曲霉毒素b1降解率的影响
[0061]
固定处理时间为36h，体系中亚硫酸氢钠质量浓度为1％、酸枣仁中黄曲霉毒素b1浓度为100μg/kg不变。酸枣仁与亚硫酸氢钠溶液的固液比为100g∶30ml，在35、45、55、60、65、70、75℃下避光反应36h，其他步骤同上。
[0062]
由图5可知随着处理温度的增大，黄曲霉毒素b1降解率逐渐增大，当处理温度增大至70℃时，黄曲霉毒素b1降解率达到稳定，并随着处理温度增大至75℃，黄曲霉毒素b1降解
率未发生显著性变化。
[0063]
初始黄曲霉毒素b1浓度对黄曲霉毒素b1降解率的影响
[0064]
固定处理时间为36h，处理温度为70℃，体系中亚硫酸氢钠质量浓度为1％不变。酸枣仁与亚硫酸氢钠溶液的固液比为100g∶20ml，含毒量分别为10、50、100、200、500μg/kg的酸枣仁样品在70℃下避光反应36h，其他步骤同上。
[0065]
由图6可知随着初始黄曲霉毒素b1含量的增大，黄曲霉毒素b1降解率逐渐降低，当初始黄曲霉毒素b1含量增大至100μg/kg时，黄曲霉毒素b1降解率发生显著性降低。
[0066]
实施例三响应面优化实验设计
[0067]
在上述单因素试验的基础上，根据box-behnken中心组合试验设计原理和单因素试验结果，采用响应面统计分析软件以亚硫酸氢钠质量浓度(a)、处理时间(b)、处理温度(c)、初始黄曲霉毒素b1浓度(d)为影响变量进行响应面试验设计，以黄曲霉毒素b1降解率为响应值，建立四因素三水平共27组试验，见表1及表2。
[0068]
表1响应面试验因素水平设计
[0069][0069][0070]
表2响应面分析试验方案及结果
[0071][0072]
利用统计学分析软件design-expert 12.0，对表2中亚硫酸氢钠降解黄曲霉毒素b1的四个因素对黄曲霉毒素b1降解率(y)进行数据拟合。以亚硫酸氢钠质量浓度(a)、处理时间(b)、处理温度(c)、初始黄曲霉毒素b1浓度(d)为自变量，黄曲霉毒素b1降解率为响应值，得出亚硫酸氢钠降解黄曲霉毒素b1的预测值对a、b、c、d编码值的二次回归模型方程：y＝-153.34000+134.72500 a+4.92667 b+2.63392 c-0.09930 d-0.97667 ab-1.12550 ac+0.0940 0ad-0.00915 bc-0.00266 bd-0.000485 cd-17.33833 a
2-0.042784 b
2-0.005046 c2+0.000481 d2。
[0073]
由表3可知模型的显著性水平小于0.0001，这说明模型和方法是可靠的。模型f值为13.83，这意味着模型是显著的。在这种情况下，因子a、b、c、ab、ac和b2对黄曲霉毒素b1降解率有显著影响，而d、ac、ad、bc、bd、cd、a2、c2和d2没有显著影响。根据表3中a、b、c和d的p
值，这四个因素对黄曲霉毒素b1降解率影响的显著性可以确定为b＞a＞c＞d。在实验中，“失拟项”f值为18.00意味着，这一“失拟项”f值由于噪声引起的可能性为18.00％。此外，模型的r2为0.9416，这进一步证实了模型可以很好地拟合实验结果。说明应用响应面法优化亚硫酸氢钠降解黄曲霉毒素b1的工艺是可行的，具有参考性。
[0074]
表3回归模型方差分析结果
[0075][0076]
变异系数表示模型的置信度，与置信度成反比，该模型变异系数为7.30％，表明该模型可更好地代表测试值。亚硫酸氢钠质量浓度和处理时间、亚硫酸氢钠质量浓度和处理温度对黄曲霉毒素b1降解率影响显著，但亚硫酸氢钠质量浓度对黄曲霉毒素b1初始浓度、处理时间和处理温度、处理时间和黄曲霉毒素b1初始浓度、处理温度和黄曲霉毒素b1初始浓度影响不显著。
[0077]
通过design-expert 12.0软件分析得出，在现有的条件下，最佳黄曲霉毒素b1降解条件为1.154％亚硫酸氢钠、处理时间为27.52h、处理温度为69.40℃、黄曲霉毒素b1初始浓度为53.26μg/kg。在此条件下，重复平行3次试验，酸枣仁中黄曲霉毒素b1降解率为95.72
±
1.42％，预测值为100.56％，相差4.74％，说明该方程与实际情况拟合性良好。
[0078]
实施例四黄曲霉毒素b1降解产物解析试验设计
[0079]
在上述响应面优化试验中，在60℃下利用1.154％亚硫酸氢钠处理含有染毒酸枣
仁样品27.5h后，烘干粉碎过40目筛，利用甲醇与水体积比为75∶25的提取液，300r/min振荡提取20min后，分离过滤，取上清液通过霉菌专用净化柱，将净化液置于棕色色谱进样小瓶中，上机检测。
[0080]
通过液相高分辨质谱联用仪收集nahso3处理前后黄曲霉毒素b1的色谱、质谱数据。同时收集ms/ms锁片离子数据。将原始数据导入thermo scientific xcalibur v4.2中进行差异表达分析。该软件鉴定了黄曲霉毒素b1经nahso3处理后生成的3种新产物。在空白实验中，并未检测到该产物；在nahso3处理24h、48h后，均发现了该化合物，且随着降解时间的增加，降解产物含量增加，黄曲霉毒素b1含量减少。采用lc-ms和esi分析了黄曲霉毒素b1降解产物分子式。在esi的负离子模式下未检测到黄曲霉毒素b1降解产物。黄曲霉毒素b1的质谱在正离子模式下，以c
17h13
o6计算的m/z为313.07092[m+h]
+
；黄曲霉毒素b1降解产物以c
17h15
o9s、c
17h15
o8计算的m/z为395.88900、347.07614[m+h]
+
。
[0081]
利用亚硫酸氢钠结合加热的方法降解黄曲霉毒素b1，通过单因素分析、响应面法优化其降解方法建立亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1降解模型，为今后他人利用亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1时提供较佳的处理方法，进一步节约能耗、减少亚硫酸氢钠使用量，开发应用提供一定的技术支持。对本发明的优选实施例进行说明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明范围内，均可自主改动和修饰。此处所述的优选实例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

技术特征：
1.亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的降解方法，其特征在于包括如下步骤：(1)用浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50ng/ml的黄曲霉毒素b1标准品溶液制备标准曲线；(2)在酸枣仁与亚硫酸氢钠溶液固液比为100g∶30ml条件下，将亚硫酸氢钠溶液在边喷洒边混匀条件下均匀分布在酸枣仁表面，在一定温度避光条件下反应一定的时长后，测定酸枣仁中的黄曲霉毒素b1残留量，计算黄曲霉毒素b1降解率；(3)选择亚硫酸氢钠质量浓度、处理时间、处理温度和黄曲霉毒素b1初始含量四个因素对步骤(2)进行单因素实验，确定亚硫酸氢钠质量浓度、处理时间、处理温度和黄曲霉毒素b1初始含量的最优水平；以单因素条件为自变量，以黄曲霉毒素b1降解率为响应值，得出最优的降解条件；(4)对步骤(3)建立的多元二次方程进行响应面分析，取黄曲霉毒素b1降解率为最大值，得出最优的降解条件；其中，在步骤(3)中，以亚硫酸氢钠质量浓度a、处理时间b、处理温度c、黄曲霉毒素b1初始含量d为影响自变量，以黄曲霉毒素b1降解率为响应值，建立的多元二次方程为：y＝-153.34000+134.72500 a+4.92667 b+2.63392 c-0.09930 d-0.97667 ab-1.12550 ac+0.0940 0ad-0.00915 bc-0.00266 bd-0.000485 cd-17.33833 a
2-0.042784 b
2-0.005046 c2+0.000481 d2。2.如权利1要求所述的亚硫酸氢钠结合加热降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的方法，其特征在于，采用液相质谱联用仪(lc-ms)测定发霉酸枣仁中黄曲霉毒素b1含量。根据酸枣仁中黄曲霉毒素b1初始含量，选择最佳处理条件。在现有的条件下，最佳黄曲霉毒素b1降解条件为1.154％亚硫酸氢钠、处理时间为27.52h、处理温度为69.40℃、黄曲霉毒素b1初始浓度为53.26μg/kg。在此条件下，重复平行3次试验，酸枣仁中黄曲霉毒素b1降解率为95.72
±
1.42％，预测值为100.56％，相差4.74％，说明该方程与实际情况拟合性良好。3.如权利2所述的亚硫酸氢钠结合加热降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1的方法得到的酸枣仁，其特征在于，黄曲霉毒素b1超标在0～50μg/kg内的酸枣仁，经处理后黄曲霉毒素b1的含量不高于5.0μg/kg。4.如权利2所述亚硫酸氢钠经过喷洒可有效降解酸枣仁中黄曲霉毒素b1，通过液相高分辨质谱联用仪测定黄曲霉毒素b1产物信息，其特征在于，该仪器分辨率高、灵敏度强。

技术总结
本发明公开了一种酸枣仁中黄曲霉毒素B1脱毒方法，包括：步骤一：采用单因素试验和响应面试验，选取亚硫酸氢钠质量浓度、时间、温度和初始黄曲霉毒素B1含量四个因素，以黄曲霉毒素B1降解率为响应值，建立亚硫酸氢钠降解酸枣仁中黄曲霉毒素B1的模型；步骤二：根据模型确定：酸枣仁中黄曲霉毒素Bl含量超标范围在0～53.26μg/kg范围内，将1.15％亚硫酸氢钠喷洒于酸枣仁表面在69.40℃条件下处理27.52h；步骤三：将酸枣仁烘干或风干后储藏；步骤四：推测黄曲霉毒素B1降解产物有C


技术研发人员：王丽霞 李华林 崔龙
受保护的技术使用者：河南省科学院同位素研究所有限责任公司 中国农业科学院农产品加工研究所
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/8/23