一种用GhRVW2蛋白增强植株真菌抗性的方法及应用

一种用ghrvw2蛋白增强植株真菌抗性的方法及应用
技术领域
1.本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用ghrvw2蛋白增强植株真菌抗性的方法及应用。


背景技术：

2.棉花黄萎病(verticillium wilt)是一种土传的真菌维管束病害，具有传播面积广、发病率高、危害严重、对棉花生产造成巨大损失等特点。虽然已经有很多抗病相关基因被鉴定出来，但是由于大丽轮枝菌致病机理的复杂性，棉花黄萎病仍然是棉花生产上的难题，种植抗病品种是目前最有效的方法。
3.中植棉2号是我国第一个国审棉花抗黄萎病品种，多年来作为抗性对照品种广泛种植。目前关于中植棉2号的抗病基因的研究较少，主要集中在类受体蛋白和一些蛋白酶类的研究，如茉莉酸氧化酶基因ghjox2受茉莉酸和乙烯的诱导增强棉花对黄萎病的抗性；核糖体蛋白ghrps6通过调节sa，ja和活性氧的水平参与植物对大丽轮枝菌的抗性；nbs-lrr类受体蛋白ghtnl1通过调控茉莉酸途径提高拟南芥对大丽轮枝菌的抗性；琥珀酸脱氢酶ghsdh1-1通过调节sdh酶活性，参与ros从而调节棉花对大丽轮枝菌的抗性。
4.目前，基于现阶段棉花黄萎病的难题，挖掘能够对黄萎病菌的具有抗性的蛋白具有重要意义。


技术实现要素：

5.本公开的目的是提高植株的真菌抗性，特别是抗大丽轮枝菌的抗性。
6.为了实现上述目的，本公开第一方面提供了一种增强植株真菌抗性的方法，该方法包括如下步骤：
7.将ghrvw2蛋白施用于目的植株，和/或，将编码ghrvw2蛋白的基因导入目的植株，并上调植株中所述编码ghrvw2蛋白的基因的表达；
8.所述ghrvw2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
9.可选地，所述编码ghrvw2蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。
10.可选地，所述编码ghrvw2蛋白的基因通过植株表达载体导入目的植株；所述植株表达载体的核苷酸序列如seq id no.6所示。
11.可选地，所述增强植株真菌抗性包括：增强植株抗大丽轮枝菌vd991中的抗性。
12.可选地，所述植株包括棉花或拟南芥。
13.本公开第二方面提供ghrvw2蛋白和/或编码ghrvw2蛋白的基因在增强植株真菌抗性中的应用，所述ghrvw2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
14.可选地，所述编码ghrvw2蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。
15.可选地，所述编码ghrvw2蛋白的基因通过植株表达载体导入目的植株，所述植株
表达载体的核苷酸序列如seq id no.6所示。
16.可选地，所述增强植株真菌抗性包括：增强植株抗大丽轮枝菌vd991的抗性。
17.可选地，所述植株包括棉花或拟南芥。
18.通过上述技术方案，本公开提供了一种用ghrvw2蛋白增强植株真菌抗性的方法及应用。本公开通过将编码ghrvw2蛋白的基因导入目的植株，并上调该编码ghrvw2蛋白的基因的表达来提高植株对真菌的抗性，特别是大丽轮枝菌的抗性；提高植株对黄萎病的抗性。
19.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
20.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
21.图1是ghrvw2结构域拆解图。
22.图2是ghrvw2的亚细胞定位图。
23.图3是ghrvw2的cds序列凝胶电泳图。
24.图4是ghrvw2的cds序列的基因载体骨架示意图。
25.图5是ghrvw2棉花的不同部位在中植棉2号(zzm2)和军棉1号(jm1)中的表达模式分析。
26.图6是ghrvw2大丽轮枝菌vd991侵染的表达模式分析。
27.图7是ghrvw2在sa处理条件下的表达模式分析。
28.图8是ghrvw2在eth处理条件下的表达模式分析。
29.图9是ghrvw2在meja处理条件下的表达模式分析。
30.图10是ghrvw2沉默棉花株系黄萎病抗性鉴定的植株生长图。
31.图11是ghrvw2沉默棉花株系黄萎病抗性鉴定的叶片图。
32.图12是ghrvw2沉默棉花株系黄萎病抗性鉴定的剖茎图。
33.图13是ghrvw2沉默棉花株系黄萎病抗性鉴定的基因表达量。
34.图14是ghrvw2沉默棉花株系黄萎病抗性鉴定的相对真菌生物量。
35.图15是ghrvw2过表达拟南芥株系黄萎病抗性鉴定的植株生长图。
36.图16是过表达拟南芥株系ghrvw2的凝胶电泳图。
37.图17是ghrvw2过表达拟南芥株系黄萎病抗性鉴定的相对真菌生物量。
38.序列表说明
39.seq id no.1和seq id no.2：ghrvw2蛋白的氨基酸序列。
40.seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5：ghrvw2蛋白的基因的核苷酸序列。
41.seq id no.6：ghrvw2蛋白植株表达载体的核苷酸序列。
具体实施方式
42.以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
43.本公开一方面提供了一种增强植株真菌抗性的方法，该方法包括如下步骤：将ghrvw2蛋白施用于目的植株，和/或，将编码ghrvw2蛋白的基因导入目的植株，并上调植株
中所述编码ghrvw2蛋白的基因的表达；所述ghrvw2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
44.本公开的发明人经过大量研究发现，通过克隆中植棉2号黄萎病抗性相关ghrvw2的cds序列，证明ghrvw2定位于叶绿体，并检测了ghrvw2在黄萎病菌侵染及激素诱导过程中的表达模式，利用vigs沉默ghrvw2能够降低中植棉2号对黄萎病菌的抗性，在拟南芥中过表达ghrvw2能够增强拟南芥对黄萎病菌的抗性，证明了ghrvw2是参与中植棉2号黄萎病抗性功能的正调控因子。因此，可将ghrvw2蛋白和/或编码ghrvw2蛋白的基因用于增强植真菌抗性，提高植株的黄萎病抗性。
45.根据本公开，所述编码ghrvw2蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。
46.根据本公开，所述编码ghrvw2蛋白的基因通过植株表达载体导入目的植株；所述植株表达载体的核苷酸序列如seq id no.6所示。
47.根据本公开，所述增强植株真菌抗性包括：增强株抗大丽轮枝菌vd991抗性。
48.根据本公开，所述植株包括棉花或拟南芥。在本公开的一种优选实施方式中，所述植株为拟南芥。
49.另一方面，本公开提供了ghrvw2蛋白和/或编码ghrvw2蛋白的基因在增强植株真菌抗性中的应用，所述ghrvw2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
50.根据本公开，所述编码ghrvw2蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。
51.根据本公开，所述编码ghrvw2蛋白的基因通过植株表达载体导入目的植株，所述植株表达载体的核苷酸序列如seq id no.6所示。
52.根据本公开，所述增强植株真菌抗性包括：增强植株抗大丽轮枝菌vd991的抗性。
53.根据本公开，所述植株包括棉花或拟南芥。
54.下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
55.实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。
56.以下实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
57.实施例1
58.本实施例用于说明编码ghrvw2蛋白的基因位于叶绿体的鉴定。
59.农杆菌介导的烟草的瞬时表达。
60.1、表达载体的构建及转化：
61.根据目的基因的cds序列设计带有pbin-gfp4载体酶切位点(kpn i和bamh i)的特异性接头引物，以cdna为模板，pcr扩增去掉终止密码子的目的基因，pcr检测并回收。通过ce design v1.04软件(vazyme)设计目的基因(去除终止密码子)及mcherry基因片段扩增引物(骨架载体为pcambial300-35s)。
62.载体pbingfp4质粒(kpn i和bamh i)、pcambia1300-35s质粒(bamh i和sac i)分别进行双酶切，37℃酶切3小时，1％琼脂糖胶电泳检测酶切产物。利用axyprep dna纯化试剂盒对线性质粒进行回收纯化。
63.pbin-gfp4线性质粒与相应的目的基因片段和pcambia1300-35s线性质粒与相应
的两个片段使用clonexpress ll one step cloning kit(vazymec112-02)进行重组连接，37℃孵育30min，冰浴1min。
64.连接完成的重组质粒转化至农杆菌gv3101感受态细胞中，具体操作方法如下：
65.(1)gv3101于-80℃拿出，迅速置于冰上解冻；
66.(2)100μl的感受态细胞中加入5μl的重组质粒，轻拨混匀，冰上静置30min；
67.(3)液氮5min，37℃保温5min，冰上冷却5min；
68.(4)加入500μl无抗生素的lb培养基，28℃，200rpm摇菌3h；
69.(5)6000rpm离心1min，弃去400μl上清，利用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒均匀涂布在含(kan、rif)的lb平板上；
70.(6)28℃培养箱倒置培养，筛选转化子。
71.2、烟草瞬时表达及定位观察：
72.将含有重组质粒的农杆菌gv3101接种于lb液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养至od600在0.6～0.8之间；用mgcl2重悬液(10mm mgcl2，10mm mes，200mm as)洗涤两次，最后重悬至od600至0.6，28℃暗孵育3h；通过瞬转3周龄烟草叶片，2d后使用激光共聚焦显微镜观察，gfp荧光信号激发峰为488nm，发射峰为507nm。mcherry荧光信号激发峰587nm，发射峰610nm。
73.如图1和图2所示，上述实验表明ghrvw2蛋白位于叶绿体。
74.实施例2
75.本实施例用于说明ghrvw2基因cds序列的克隆方法。
76.1、rna提取、反转录：
77.取zzm2的植物组织(真叶、茎、根)剪碎，分别用锡箔纸包好放入液氮中速冻，于-80℃冰箱保存。按照easyspin植物快速rna提取试剂盒(原平皓)说明书步骤提取rna。rna提取后利用分光光度计测量纯度(a260/a280在2.0以上)，1％-1.5％的琼脂糖凝胶电泳检查提取质量(28s、18s和5s rrna有对应的条带)。检验合格的rna按照cdna第一链合成试剂盒说明书步骤，反转录为cdna。
78.2、设计引物扩增目的基因的cds序列：
79.根据目的基因预测序列，利用primer premier 5等引物设计软件设计引物，以cdna为模板，目的基因特异引物用高保真酶进行pcr扩增，用1％的琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果，如图3所示，扩增出的目的条带大小若符合要求，则将目的片段进行胶回收(参考胶回收试剂盒说明书)。胶回收后利用分光光度计测量cdna浓度。
80.3、目的基因的克隆：
81.将胶回收后的目的片段连接t载体(5min ta/blunt-zero cloning kit)，转化至dh5α大肠杆菌感受态细胞，具体步骤如下：
82.(1)dh5α于-80℃拿出，迅速置于冰上解冻；
83.(2)100μl的感受态细胞中加入10μl的重组产物，轻弹管壁混匀(避免用枪吸打)，冰上静置30min；
84.(3)42℃水浴热激45s，迅速置于冰上冷却2-3min(切勿摇动离心管)；
85.(4)加入600μl无抗生素的lb培养基，37℃、200rpm摇菌1h；
86.(5)5000rpm离心5min，弃去400-500μl上清，利用剩余培养基将菌体重悬，用无菌
涂布棒均匀涂布在含相应抗性(kan)的lb平板上；
87.(6)37℃培养箱倒置培养12-16h。
88.1.5ml离心管中加入600μl的含相应抗性(kan)的lb培养基，用牙签或枪头挑取转化板上的阳性单菌落加入离心管中吹打混匀，37℃，200rpm摇菌6h。摇至浑浊后，取2μl做菌液pcr、1％的琼脂糖凝胶电泳验证阳性克隆，200μl测序(引物为通用引物m13f/r，20个样品)、4℃冰箱保存。测序正确后提取质粒，-40℃保存。
89.ghrvw2基因的cds序列的基因载体骨架示意图如图4所示。
90.实施例3
91.本实施例用于说明编码ghrvw2蛋白的基因在棉花不同部位、大丽轮枝菌侵染、sa、eth、meja处理条件下的表达。
92.1、vd991接菌。
93.1.1、vd991菌株活化：
[0094]-80℃保存的甘油菌于冰上解冻、摇匀，吸取10μl菌液点到含卡那霉素抗性的pda平板上，25℃下培养5d。摇瓶中加入50ml含卡那霉素的cm液体培养基(工作浓度50mg/ml)，将pda平板上的vd991用灭菌的牙签或枪头挑取1
×
1cm2左右的菌丝加入摇瓶，25℃，200rpm摇床下培养3d。
[0095]
1.2、制备孢子液：
[0096]
用4层纱布过滤vd991孢子悬浮液去除菌丝。4000rpm，7min离心收集孢子，弃上清。菌体用蒸馏水重悬后稀释20倍(20μl菌液+380μl蒸馏水)，用血球计数板计数孢子，调节孢子浓度至1
×
107个孢子/ml。
[0097]
1.3、孢子液侵染棉花：
[0098]
选择1片真叶至两片真叶的棉花幼苗，小心拔出幼苗将根部冲洗干净，放入vd991孢子悬浮液中浸泡30min。浸泡后将棉花5棵一组(茎基部对齐)，小心栽回至纸钵中，套袋避光保湿2天之后常规培养，2-3周后观察植物发病状况。分别选取抗病材料zzm2和感病材料jm1，常规栽培管理，待棉花生长至“两叶一心”时期接种大丽轮枝菌vd991(浓度为5
×
106个孢子/ml)，分别在接菌6、12、24、48和72h 5个时间点对棉花根部进行取样。
[0099]
2、激素处理：
[0100]
对4片真叶期的棉花植株分别喷施10mm sa，5mm eth，100μmmeja和100μm aba，以未喷施激素的植株作为对照；喷施过后套上白色塑料袋，减少蒸发。分别在0、2、6、12、24、48和72h收集不同激素处理过的植物组织样品(根、茎、叶)，用锡箔纸包好样品并标注好材料名称，激素处理，取样时间，液氮速冻后，放入-80℃保存。
[0101]
3、基因表达量检测：
[0102]
提取样品rna并反转录为cdna，根据目的基因序列设计引物，以棉花基因18s为内参基因，使用2-δδct
法通过qrt-pcr对位点内所有候选基因受到病菌诱导后表达模式进行分析。
[0103]
结果如图5-9所示，其中，ghrvw2基因在茎、叶柄和叶片中的表达量逐渐升高，在叶片中表达量最高(图5)；大丽轮枝菌vd991接菌后ghrvw2基因在zzm2中表达量上调表达，24h达到峰值随后逐渐降低，而在jm1中下调表达(图6)；sa处理后ghrvw2基因在zzm2中表达量先下调后上调，在48h达到最高值，约为对照组的2倍(图7)；ghrvw2基因在eth和meja处理后
下调表达(图8和图9)；表明ghrvw2基因具有抗大丽轮枝菌vd991抗性。
[0104]
实施例4
[0105]
本实施例用于说明利用vigs沉默编码ghrvw2蛋白的基因，降低中植棉2号中编码ghrvw2蛋白的基因对大丽轮枝菌的抗性。
[0106]
1、引物设计：
[0107]
使用snap gene、vazyme、primer等工具，根据使用的限制性酶、载体与靶标基因设计引物，通过pcr扩增靶标基因片段及阳性对照ghcla1基因。
[0108]
2、构建载体：
[0109]
选择限制性内切酶ecor i和bamh i酶切消化pcr产物，通过连接插入到经同样酶切的pyl156(ptrv-rna2)载体中，获得重组质粒。pyl192(ptrv-rna1)、pyl156(ptrv-rna2)及含目的基因片段和ghcla1的pyl156质粒通过液氮冻融分别转化到农杆菌gv3101中，在含有kan(50mg/l)及rif(50mg/l)的lb平板上选择阳性单菌落，pcr扩增产物大小与预计一致，证明菌落含有目的基因片段，并进行甘油保菌于-80℃储存。
[0110]
3、农杆菌介导的瞬时转化。
[0111]
3.1、菌株活化、制备接菌液：
[0112]
接种前3天，在含有kan(50mg/l)及rif(50mg/l)的lb平板将-80℃甘油保存的分别含trv1、trv2和重组产物的农杆菌菌株分别划线。28℃培养48小时后，挑选单菌落，并将其接种到含有kan(50mg/l)及rif(50mg/l)3-5ml lb培养基中，于28℃下以200rpm振荡培养过夜。然后取500μl菌液加到50ml lb培养液中，28℃，200rpm扩大培养12h。菌液用mgcl2重悬液(10mm mgcl2，10mm mes，200mm as)洗涤两次，最后重悬至od600为4.0，28℃静置3h。
[0113]
3.2、农杆菌注射：
[0114]
将含trv1和trv2的培养液等比例混合。试验组含pyl156:rna2-靶标基因，阳性对照为pyl156:rna2-ghcla1，阴性对照为空载体pyl156:rna2。用注射器针头在2周龄棉花子叶上轻打小孔，用1ml无针注射器从子叶背面将菌液通过打孔部位缓慢推入棉花嫩叶。注射后的棉花套袋避光保湿，于温室中继续培养，期间注意袋内水汽，并于48h后逐渐揭袋。
[0115]
3.3、大丽轮枝菌接种：
[0116]
农杆菌接种约一周后，阳性对照开始显现白化表型时，采集阴性对照及试验组的真叶提取rna，qrt-pcr检测叶片部位靶标基因的表达水平来验证基因沉默效率。两周后，真叶能清楚观察到由ghcla1沉默引起的白化表型，新发育的叶子上表现均匀分布和非常强的白化表型，老叶上呈现马赛克。
[0117]
3.4、抗性鉴定：
[0118]
当棉花植株长到两片真叶时，此时对棉花植株接种大丽轮枝菌以观察靶标基因沉默后抗性。10-14天后观察是否出现黄萎病表型，记录沉默植株与阴性对照植株的表型差异，如绿色、萎蔫和脱落，并用叶片分级法统计病情指数，以及切取幼苗茎部，剖茎检测等，并测定靶标基因功能预测相关的生理生化指标变化及相关抗性基因的表达水平。采集接菌2周后植物的根基茎部组织，清洗干净剪碎后液氮速冻，并于-80℃保存备用，用于提取基因组及生物量的测定。
[0119]
结果如图10-14所示，其中，利用vigs技术沉默ghrvw2基因后，检测其沉默效率约为90％(图13)，zzm2对大丽轮枝菌vd991的抗性明显降低(图10)，叶片黄化萎蔫(图11)，茎
部明显褐化(图12)，相对真菌生物量显著上升，约为对照的3倍(图14)。
[0120]
实施例5
[0121]
本实施例用于说明编码ghrvw2蛋白的基因提高拟南芥对大丽轮枝菌的抗性。
[0122]
将大丽轮枝菌vd991接种于cm液体培养基中，于25℃，150rpm条件下振荡培养5-7天。四层纱布过滤菌丝，5000
×
g离心5min收集孢子后无菌水重悬孢子，通过血球计数板调节孢子浓度至5
×
106个孢子/ml。
[0123]
采用蘸根法接种一片真叶时期的棉花幼苗，将棉花根部的营养土用清水轻轻冲洗干净，尽量避免伤根。将待接菌的棉花幼苗根部浸入到浓度为5
×
106个孢子/ml大丽轮枝菌孢子悬浮液中，浸泡15min后将棉花幼苗重新栽回纸钵中，2周后观察棉花发病状况。
[0124]
接菌2周后，对每个处理棉花植株根茎部分取样，液氮速冻后，提取dna后利用定量pcr的方法进行接菌后的生物量的检测：以棉花看家基因18s作为内参标准，利用2-δδct
法检测大丽轮枝菌管家基因vdef1-α的相对含量。
[0125]
结果如图15-17所示，其中，设计特异性引物检测ghrvw2基因在野生型拟南芥中的表达(图16)，ghrvw2基因过表达拟南芥株系抗性增强(图15)，ghrvw2基因过表达拟南芥株系相对真菌生物量显著降低(图17)；表明编码ghrvw2蛋白的基因具有真菌抗性。
[0126]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0127]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0128]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

技术特征：
1.一种增强植株真菌抗性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：将ghrvw2蛋白施用于目的植株，和/或，将编码ghrvw2蛋白的基因导入目的植株，并上调植株中所述编码ghrvw2蛋白的基因的表达；所述ghrvw2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码ghrvw2蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码ghrvw2蛋白的基因通过植株表达载体导入目的植株；所述植株表达载体的核苷酸序列如seq idno.6所示。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述增强植株真菌抗性包括：增强植株抗大丽轮枝菌vd991的抗性。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植株包括棉花或拟南芥。6.ghrvw2蛋白和/或编码ghrvw2蛋白的基因在增强植株真菌抗性中的应用，其特征在于，所述ghrvw2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述编码ghrvw2蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。8.根据权利要求6所述的应用，其中，所述编码ghrvw2蛋白的基因通过植株表达载体导入目的植株，所述植株表达载体的核苷酸序列如seq idno.6所示。9.根据权利要求6所述的应用，其中，所述增强植株真菌抗性包括：增强植株抗大丽轮枝菌vd991的抗性。10.根据权利要求6所述的应用，其中，所述植株包括棉花或拟南芥。

技术总结
本公开涉及一种用GhRVW2蛋白增强植株真菌抗性的方法及应用。该方法包括如下步骤：将GhRVW2蛋白施用于目的植株，和/或，将编码GhRVW2蛋白的基因导入目的植株，并上调植株中所述编码GhRVW2蛋白的基因的表达；所述GhRVW2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。通过上述技术方案，该GhRVW2蛋白和/或编码GhRVW2蛋白的基因提高了植株的真菌抗性。码GhRVW2蛋白的基因提高了植株的真菌抗性。码GhRVW2蛋白的基因提高了植株的真菌抗性。


技术研发人员：李冉 戴小枫 马茜月 陈捷胤 张丹丹 孔志强 刘晓炜
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/8/23