血浆代谢物组合在制备肌少症疾病亚型分型检测产品中的应用

1.本发明涉及肌少症防治技术领域，具体而言，涉及血浆代谢物组合在制备肌少症疾病亚型分型检测产品中的应用。


背景技术：

2.老年性骨骼肌减少症(简称肌少症，sarcopenia)是一种与增龄相关的进行性全身骨骼肌质量减少、肌力下降并伴随躯体功能减退的老年综合征。肌少症与老年人身体功能受限密切相关，可导致老年人躯体活动障碍，并增加跌倒、骨折、住院甚至早期死亡风险。在亚洲，肌少症总体患病率约为9.9％，其中男性为9.8％，女性为10.1％。肌少症的病因复杂，目前尚无有效治疗药物。营养支持疗法和抗阻力训练是目前治疗肌少症的主要方案。随着我国进入老龄化社会，肌少症人群的数量势必会增加，无疑将给社会医疗和国家经济带来沉重的负担。因此，肌少症的预防、早期诊断、干预和发生发展机制研究已成为老年科学的核心内容之一。
3.代谢物是细胞新陈代谢的结果，生物体内循环代谢产物的变化可反映机体的生理与病理特征。代谢物不仅是较好的预测和诊断疾病的生物标志物，而且还广泛参与基因的表达调控和蛋白的功能调控。代谢组学(包括亲水代谢物和疏水代谢物)是一门快速发展的高通量组学技术，可以实现对特定生物过程留下的独特化学指纹进行系统分析。代谢失衡是肌少症的一个重要标志，通过运动和营养干预等方式促进蛋白质的合成和恢复代谢平衡，是肌少症防治的有效手段。营养干预主要包括补充蛋白质及氨基酸、维生素、ω-3脂肪酸等。多种内源性代谢物包括支链氨基酸及亮氨酸相关代谢产物beta-羟基-beta-甲基丁酸(hmb)，已被证实对肌肉质量、力量和功能的维持具有重要作用。
4.随着高通量组学技术的飞速发展，多组学整合分析成为从分子水平认识疾病的重要手段之一，是精准医学的重要组成部分。目前针对中国肌少症人群的血浆代谢亚型的研究仍然为一片空白，并且肌少症代谢分型是否有助于肌少症的营养干预尚未可知。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供血浆代谢物组合在制备肌少症疾病亚型分型检测产品中的应用以解决上述技术问题。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供了血浆代谢物组合在制备肌少症疾病亚型分型检测产品中的应用，血浆代谢物组合选自如下代谢物组合：
9.tg(52:6)；pantothenic acid(泛酸)；ketoleucine(酮亮氨酸)；eicosapentaenoic acid(二十碳五烯酸)；3-methyl-2-oxobutyrate；pc(34:1)；tg(56:8)；l-norvaline(l-正缬氨酸)；hypotaurine(亚牛磺酸)；3-amino-4-methylpentanoic acid
(3-氨基-4-甲基戊酸)；palmitoleic acid(棕榈油酸)；hex1cer(d42:3)；tg(52:5)和hex3cer(d42:2)。
10.肌少症分为2个亚型：s-i和s-ii；分型后s-ii型人smi显著高于s-i型人，提示s-ii型肌少症患者症状更轻。
11.截止目前为止，尚无针对肌少症患者进行的大规模的血浆代谢组学研究，因此深入研究肌少症患者的血浆代谢特征具有重要的意义。本发明通过对503例血浆进行代谢组学研究，利用smi与代谢物进行多元线性回归分析筛选出上述14个与smi最显著相关的代谢物。
12.肌少症目前尚无较为精确的亚型划分，更新后的欧洲和亚洲肌少症共识仅依据是否伴随躯体功能下降将肌少症分为肌少症前期、肌少症和严重肌少症，虽然在一定程度上可以对预后起到警示作用，但不能作为治疗的依据。除此之外，目前对肌少症干预疗效的不一致性，例如n-3多不饱和脂肪酸在临床对照实验中结果存在性别差异，是否也是未对疾病亚型进行精确划分造成的还尚未可知，因此对肌少症进行分子分型十分必要。
13.发明人基于上述14个与smi显著相关的代谢物将351位肌少症患者分为2个亚型，包括s-i和s-ii。发明人发现，通过不同患者的血浆代谢物组合的水平差异可以将肌少症患者进行分型。基于这些差异代谢物分析，或许可以为营养干预肌少症提供一定的思路。
14.发明人发现，当代谢物组合选自上述14种时，具有良好的分型效果，可以将s-i和s-ii分型。
15.分型检测产品包括用于检测血浆代谢物组合含量的试剂、试剂盒或芯片。
16.在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒包括：血浆代谢物的标准品，血浆代谢物的标准品包括tg(52:6)、pantothenic acid、ketoleucine、eicosapentaenoic acid、3-methyl-2-oxobutyrate、pc(34:1)、tg(56:8)、l-norvaline、hypotaurine、3-amino-4-methylpentanoic acid、palmitoleic acid、hex1cer(d42:3)、tg(52:5)和hex3cer(d42:2)；且各标准品分别封装。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，上述分型检测产品针对的检测样品为受试体的血浆样品。
18.本发明还提供了一种用于肌少症疾病亚型分型检测的试剂盒，试剂盒包括检测血浆代谢物组合含量的试剂；血浆代谢物选自如下代谢物组合：
19.tg(52:6)；pantothenic acid；ketoleucine；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；pc(34:1)；tg(56:8)；l-norvaline；hypotaurine；3-amino-4-methylpentanoic acid；palmitoleic acid；hex1cer(d42:3)；tg(52:5)和hex3cer(d42:2)。
20.一种肌少症疾病亚型分型的检测工具，其包括：
21.测量模块，用于测量待测血浆样品中血浆代谢物的含量；
22.分析模块，比较待测血浆样品中血浆代谢物标志物的含量，根据比较结果判断待测血浆样本的来源受试者肌少症疾病亚型，若血浆样本中，tg(52:6)；pantothenic acid；ketoleucine；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；pc(34:1)；tg(56:8)；l-norvaline；hypotaurine；3-amino-4-methylpentanoic acid；palmitoleic acid；hex1cer(d42:3)；tg(52:5)；hex3cer(d42:2)与正常人接近，则待测血浆样本的来源受试者为s-ii
型；
23.若血浆样本中tg(52:6)；pantothenic acid；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；ketoleucine；tg(56:8)；l-norvaline；tg(52:5)和3-amino-4-methylpentanoic acid的含量低于正常人，pc(34:1)；palmitoleic acid；hypotaurine；hex1cer(d42:3)和hex3cer(d42:2)的含量高于正常人，待测血浆样本的来源受试者为s-i。
24.在一种可选的实施方式中，测量模块和分析模块位于仪器平台上。
25.测量模块基于超高效液相串联三重四级杆二级质谱技术实现。
26.本发明具有以下有益效果：
27.基于肌少症目前尚无较为精确的亚型划分。发明人根据肌少症患者的代谢特征将其分为3个亚型，包括s-i和s-ii。通过不同患者的血浆代谢物组合的水平差异可以将肌少症患者进行分型。基于这些差异代谢物分析，可以为营养干预肌少症提供一定的思路。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
29.图1为基于14个代谢物对肌少症患者进行分型的结果(a，不同亚型对应cdf曲线；b，351例肌少症患者基于14个血浆代谢物的分子分型矩阵图；c-d，女性(c)和男性(d)不同分型人群smi的统计)。
具体实施方式
30.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
31.除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
33.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
34.实施例1
35.截止目前为止，尚无针对肌少症患者进行的大规模的血浆代谢组学研究，因此深入研究肌少症患者的血浆代谢特征具有重要的意义。本实施例进行肌少症患者血浆代谢图谱的绘制。
36.本实施例中血浆样本来源于中国西部地区50岁以上老人，多中心的两个血浆研究队列测试骨骼肌质量指数smi，步速和握力。
37.本实施例所涉及的骨骼肌质量指数测试、步速测试、握力测试、血浆样本收集及处理方法、血浆代谢物提取、血浆脂质提取、亲水代谢物正离子模式非靶向检测、亲水代谢物负离子模式非靶向检测、脂质正离子模式非靶向检测、代谢组和脂质组原始数据搜库及处理方法具体如下所示。
38.1.骨骼肌质量指数测试
39.本实施例采用生物电阻抗分析仪(inbody s10,biospace,seoul,korea)采集受试者的骨骼肌质量指数。注意事项：1)受试者应空腹进行测量，并提前排空大小便，并且穿着轻巧，从而减少误差；2)为了减少因突然站立而导致水分向下肢流动造成误差，测定前需静立10分钟；3)测量时不可携带金属饰品和重物，佩戴心脏起搏器等电子医疗仪者不可进行该项检查；5)测试全程需保持安静。根据awgs 2019标准，男性smi低于7.0kg/m2，女性smi低于5.7kg/m2，被判定为低骨骼肌质量。
40.2.步速测试
41.受试者站在起点处，经工作人员提示后开始测试，按照平时正常速度直行至前方4米线，终点处的红外传感器(tf-nz1033，清华同方)记录步行时间。注意：测试过程中，受试者可以使用拐杖以及其他助行器。男性女性的4米步速低于1m/s被判定为步速下降。
42.3.握力测试
43.测试前工作人员询问受试者的优势手。在本论文中，wchat研究队列和华西医院骨科收取的样本分别采用电子握力计(清华同方)和jamar握力计测量受试者优势手的握力。电子握力计测量时取站立位，受试者双脚自然分开与肩部同宽，并伸肘用最大的力量紧紧握住握柄，总共测试两次，取最大值。jamar握力计测量取坐位，测试前调整握力器把手至适宜大小，测试时上臂自然下垂，下臂垂直于上臂，受试者用最大力量握住把手，测试两次，取最大值。男性和女性握力分别低于26kg以及18kg被判定为握力下降。
44.4.血浆样本收集及处理的具体方案如下：
45.采用真空负压edta抗凝采血管收集受试者空腹血液。采集完毕后立刻置于4℃冰箱，并在30min以内，于4℃离心机中，2000rpm，离心15min。转移上清至新的冻存管，液氮速冻后转移至-80℃冰箱长期保存。
46.5.血浆代谢物提取
47.1)内标制备
48.称取
13
c赖氨酸和
13
c 15
n精氨酸，分别溶于质谱级水配置成1μg/μl的母液，两者等比例混合后稀释至终浓度为0.05μg/μl的工作液。
49.2)样品制备
50.a.预先在新的1.5ml ep中加入10μl配置好的内标样品工作液。
51.b.将提前分装的血浆(100μl)置于冰上溶解，随后4℃，14000g，离心20min，取上清90μl转移至已经添加了内标样品的1.5ml ep管中
52.c.每个样品中加入400μl-20℃预冷的甲醇(质谱级)，涡旋混匀样品(不超过1min)，10s/次。
53.d.将充分混匀的样品放在-80℃冰箱继续孵育1-2h。
54.e.将孵育好的样品放在冰上静置5min，随后4℃，14000g，离心10min，取等体积上清并转移至新的1.5ml ep管中，真空离心浓缩干。
55.f.将浓缩干的样品用干冰寄送到清华大学代谢平台进行检测。
56.3)qc样品制备
57.取本次所有样品各10μl混匀后，分装成40个样品，每个样品90μl。其余处理方法同上述样品处理。
58.6.血浆脂质提取
59.1)内标样品制备
60.称取pe(16:0-d31-18:1)，用ch2cl2：meoh(2：1)配置成终浓度为1μg/μl的工作液。
61.2)样品制备
62.a.取100μl分装好的血浆冰上溶解，随后4℃，14000g，离心20min，取上清90μl转移至新的1.5ml ep管中。随后加入360μl-20℃预冷的ch2cl2：meoh(2：1混合，含有内标pe(16:0-d31-18:1)，终浓度为1.25μg/ml)，涡旋，冰上静置，如此反复三次，充分抽提后，4℃，3000rpm，离心15min。
63.b.溶液分层，等体积取出下层有机相于新的1.5ml ep管中。
64.c.按水相与有机相1：4的比例，加入4℃预冷的质谱级水，对有机层进行二次萃取，涡旋，冰上静置，重复三次。充分抽提后，4℃，3000rpm，离心15min，取等体积下层有机相于新的1.5ml ep管中，真空离心浓缩干。
65.d.将浓缩干的样品用干冰寄送到清华大学代谢平台进行检测。
66.3)qc样品制备
67.取本次所有样品各10μl混匀后，分装成50个样品，每个样品90μl。其余处理方法同上述样品处理。
68.7.亲水代谢物正离子模式非靶向检测
69.1)配置流动相：buffer a：95％ acn(含有10mm甲酸铵，0.1％甲酸)；buffer b：5％ acn(含有10mm甲酸铵，0.1％甲酸)，使用前水浴超声30min排气泡。
70.2)液相采用atlantis hilic silica柱子进行分离，柱温设定为35℃，流速为300μl/min，单个样品运行时长为22min。流动相梯度设置如下：
[0071][0072]
3)用于代谢物检测的质谱型号为q exactive orbitrap，参数设置如下：
[0073][0074]
8.亲水代谢物负离子模式非靶向检测
[0075]
1)配置流动相：buffer a：95％ acn(含有10mm甲酸铵，氢氧化铵调ph＝9.0)；buffer b：50％ acn(含有10mm甲酸铵，氢氧化铵调ph＝9.0)，使用前水浴超声30min排气泡。
[0076]
2)液相采用beh amide柱子(2.1mm*100mm，waters)进行分离，柱温设定为35℃，流速为250μl/min，单个样品运行时长为25min。流动相梯度设置如下：
[0077]
[0078][0079]
3)用于代谢物检测的质谱型号为q exactive orbitrap，参数设置如下：
[0080][0081]
9.脂质正离子模式非靶向检测
[0082]
1)配置流动相：buffer a：60％ acn(含有10mm醋酸铵)；buffer b：10％/90％乙腈/异丙醇(v/v)，使用前水浴超声30min排气泡。
[0083]
2)液相采用xselect csh c18柱子(2.1mm*100mm，waters)进行分离，柱温设定为45℃，流速为250μl/min，单个样品运行时长为20min。流动相梯度设置如下：
[0084][0085]
3)用于脂质检测的质谱型号为q exactive orbitrap，参数设置如下：
[0086][0087]
10.代谢组和脂质组原始数据搜库及处理
[0088]
对于亲水代谢物，使用tracefinder同时进行两个一级和二级的鉴定。首先，根据本地ms数据库对代谢物进行精确质量分配，同时碎片离子数据库匹配ms/ms水平得到的谱图。因此，ms/ms确认的和可能存在的代谢物都显示在结果中。在定量的过程中，母离子和子离子匹配分别允许10ppm和15ppm的质量误差，并允许0.25min以内的保留时间偏移。
[0089]
脂质组数据使用tracefinder(thermo,ca)软件进行数据分析。脂质由本地自建的脂质数据库进行“screening”以及“quan”模式定量。基于匹配的母离子和子离子特征片段鉴定脂质。在定量的过程中，母离子和子离子匹配分别允许10ppm和15ppm的质量误差，允许0.25min以内的保留时间偏移，并且只有色谱峰面积大于5*106的脂质被认为是可靠的鉴定。
[0090]
本实施例前期通过对503例血浆进行代谢组学研究，利用smi与代谢物进行多元线性回归分析筛选到14个与smi最显著相关的代谢物(表1)。
[0091]
表1 14个与smi最相关代谢物
[0092][0093]
实施例2
[0094]
本实施例提供了基于血浆代谢物的肌少症分子分型及与分型相关的代谢物。
[0095]
本实施例所涉及的步速测定方法如下：
[0096]
使用线性回归中与smi显著相关的代谢物，通过一致性聚类对肌少症人群分别进行聚类分型，得到肌少症的不同分子分型。一致性聚类是monti等人在2003提出的一种基于样本重复抽样的无监督聚类方式。通过对数据进行重复抽样得到一系列数据子集，对这些子集分别进行聚类得到一系列聚类结果，通过考量任意一个数据在不同子集中聚类的一致性来确定聚类的参数，可以用于划分疾病亚型并实现聚类结果的可视化。本研究中肌少症的亚型划分使用r语言中具有一致性聚类功能的consensusclusterplus包实现，设置参数maxk＝8即最大聚类分组数为8组，重复抽样的次数reps＝100，样品重复抽样的比例pitem＝0.8，代谢物重复抽样的比例pfeature＝1，聚类算法clusteralg选择k-means算法。
[0097]
在本实施例中，发明人利用14个与smi最相关代谢物将肌少症患者分为2个亚型(图1中a-b所示)，包括s-i和s-ii，其中s-ii亚型人群的smi明显高于s-i亚型人群(图1c-d)，表明s-ii型人群的肌少症症状较s-i亚型的轻。进一步分析这14个代谢物在两个亚型中与正常对照组之间的差别，发明人发现在s-i亚型人群中，tg(52:6)；pantothenic acid；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；ketoleucine；tg(56:8)；l-norvaline；3-amino-4-methylpentanoic acid和tg(52:5)的含量低于正常人，pc(34:1)；palmitoleic acid；hypotaurine；hex1cer(d42:3)和hex3cer(d42:2)的含量高于正常人(表2)。而在s-ii亚型人群中上述代谢物与正常对照组之间相当(表2)。基于以上代谢物分析，或许可以为营养干预肌少症提供一定的思路。
[0098]
表2为14个用于分型代谢物相对正常对照组的变化。
[0099]
[0100][0101]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.血浆代谢物组合在制备肌少症疾病亚型分型检测产品中的应用，其特征在于，所述血浆代谢物选自如下代谢物组合：tg(52:6)；pantothenic acid；ketoleucine；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；pc(34:1)；tg(56:8)；l-norvaline；hypotaurine；3-amino-4-methylpentanoic acid；palmitoleic acid；hex1cer(d42:3)；tg(52:5)和hex3cer(d42:2)；所述肌少症分为2个亚型：s-i和s-ii。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分型检测产品包括用于检测血浆代谢物组合含量的试剂、试剂盒或芯片。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：血浆代谢物的标准品，所述血浆代谢物的标准品包括tg(52:6)、pantothenic acid、ketoleucine、eicosapentaenoic acid、3-methyl-2-oxobutyrate、pc(34:1)、tg(56:8)、l-norvaline、hypotaurine、3-amino-4-methylpentanoic acid、palmitoleic acid、hex1cer(d42:3)、tg(52:5)和hex3cer(d42:2)；且各标准品分别封装。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分型检测产品针对的检测样品为受试体的血浆样品。5.一种用于肌少症疾病亚型分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测血浆代谢物组合含量的试剂；所述血浆代谢物选自如下代谢物组合：tg(52:6)；pantothenic acid；ketoleucine；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；pc(34:1)；tg(56:8)；l-norvaline；hypotaurine；3-amino-4-methylpentanoic acid；palmitoleic acid；hex1cer(d42:3)；tg(52:5)和hex3cer(d42:2)。6.一种肌少症疾病亚型分型的检测工具，其特征在于，其包括：测量模块，用于测量待测血浆样品中血浆代谢物的含量；分析模块，比较待测血浆样品中血浆代谢物的含量，根据比较结果判断待测血浆样本的来源受试者肌少症疾病亚型，若血浆样本中，tg(52:6)；pantothenic acid；ketoleucine；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；pc(34:1)；tg(56:8)；l-norvaline；hypotaurine；3-amino-4-methylpentanoic acid；palmitoleic acid；hex1cer(d42:3)；tg(52:5)；hex3cer(d42:2)与正常人接近，则待测血浆样本的来源受试者为s-ii型；若血浆样本中tg(52:6)；pantothenic acid；eicosapentaenoic acid；3-methyl-2-oxobutyrate；ketoleucine；tg(56:8)；l-norvaline；tg(52:5)和3-amino-4-methylpentanoic acid的含量低于正常人，pc(34:1)；palmitoleic acid；hypotaurine；hex1cer(d42:3)和hex3cer(d42:2)的含量高于正常人，待测血浆样本的来源受试者为s-i。7.如权利要求6所述的肌少症疾病亚型分型的检测工具，其特征在于，所述测量模块基于超高效液相串联三重四级杆二级质谱技术实现。

技术总结
本发明公开了血浆代谢物组合在制备肌少症疾病亚型分型检测产品中的应用，涉及肌少症防治技术领域。基于肌少症目前尚无较为精确的亚型划分。发明人根据肌少症患者的代谢特征将其分为2个亚型，包括S-I和S-II。通过不同患者的血浆代谢物组合的水平差异可以将肌少症患者进行分型。基于这些差异代谢物分析，可以为营养干预肌少症提供一定的思路。营养干预肌少症提供一定的思路。营养干预肌少症提供一定的思路。


技术研发人员：权利要求书1页说明书10页附图1页
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/23