连翘脂素在制备治疗帕金森病的药物中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及连翘脂素在制备治疗帕金森病的药物中的应用。


背景技术：

2.迄今为止，全球帕金森患病人数已超过600万例。临床上，当患者出现明显的运动症状时，已有50％的多巴胺能神经元(别名da神经元)发生了丢失，而现有药物不能挽救丢失的多巴胺能神经元。除此之外，目前治疗帕金森病的药物最主要是左旋多巴，而帕金森病患者服用左旋多巴约2年后，会对原剂量的左旋多巴没有反应或反应降低。因此，目前十分需要找到一种可以防止多巴胺能神经元丢失，且能长期有效地治疗帕金森病的药物。
3.连翘脂素(phillygenin)属于木脂素类单体化合物，在自然界中大部分呈现游离状态并且主要来自于连翘叶与桂花。连翘脂素又被称为是连翘苷元，作为木脂素中的主要活性成分以及连翘中的指纹成分，近年来被研究发现具有多种药理活性作用。连翘脂素的药理活性作用，包括其较好的抗氧化活性、抗炎活性、抗高血脂以及抗肿瘤活性，但是目前在抗神经退行性疾病帕金森病中的研究尚无报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供连翘脂素在制备治疗帕金森病的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现连翘脂素具有治疗帕金森病的作用。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供连翘脂素在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
7.本发明还提供一种治疗帕金森病的药物，所述药物的活性成分包括连翘脂素。
8.进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
9.进一步地，所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或注射剂。
10.本发明公开了以下技术效果：
11.本发明以模式生物秀丽隐杆线虫作为载体，研究了连翘脂素对神经退行性疾病帕金森病的治疗效果。一方面研究了连翘脂素对帕金森病秀丽隐杆线虫模型nl5901线虫寿命、运动能力以及α-syn蛋白积累的作用，另一方面研究了连翘脂素对bz555线虫da神经元表达情况以及食物感知行为的影响。结果发现连翘脂素可以增强线虫体内抗氧化酶的活性，从而抑制和清除线虫体内多余的活性氧自由基，并且降低α-syn蛋白的异常聚集，达到保护神经细胞免受活性氧自由基损伤，治疗帕金森病的作用。
12.本发明首次发现连翘脂素治疗帕金森病的药理作用，与其他治疗帕金森病的药物相比，连翘脂素属于天然产物易提取分离，且较低浓度就具有显著的治疗效果。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所
需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为连翘脂素对nl5901线虫寿命的影响；
15.图2为连翘脂素对nl5901线虫运动能力的影响；
16.图3为连翘脂素对nl5901线虫突触核蛋白α-syn的影响；其中，a图表示荧光显微镜观察结果，b图表示gfp荧光强度统计结果；a中标尺为50μm；
17.图4为连翘脂素对bz555线虫da神经元表达的影响；其中，a图表示荧光显微镜观察结果，b图表示gfp荧光强度统计结果；a中标尺为50μm；
18.图5为连翘脂素对bz555线虫食物感知行为的影响；
19.图6为连翘脂素对线虫氧化应激条件下寿命的影响；
20.图7为连翘脂素对线虫内源性ros含量的影响；
21.图8为连翘脂素对线虫体内抗氧化酶sod(a)和gsh(b)含量的影响。
具体实施方式
22.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
23.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
24.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
25.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
26.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
27.定义
28.本发明所使用的术语“连翘脂素”，属于木脂素类单体化合物，简写phi，分子式为c
21h24
o6，分子量为372.41，结构式如下：
[0029][0030]
以下实施例中，nl5901线虫是指秀丽隐杆线虫nl5901，购自caenorhabditis genetics center(cgc)；bz555线虫是指转基因秀丽隐杆线虫株bz555，购自caenorhabditis genetics center(cgc)；e.coli op50由山西大学应用生物研究所马恩波教授惠赠。
[0031]
实施例1连翘脂素可以延长帕金森病模型nl5901线虫寿命
[0032]
s1.将连翘脂素溶于dmso溶液后，将不同浓度的连翘脂素溶液(0、10、20、40μg/ml)与e.coli op50菌悬液(od
600
为0.2～0.3)按照体积比1:1混合均匀后，分别取100μl混合液涂布于加有线虫ngm培养基的平板表面。再将同步化到l4期的nl5901线虫分别挑取30只加入到上述涂布好的平板中，之后置于20℃的恒温培养箱中培养，记为寿命实验的第0天。
[0033]
s2.每隔1天将nl5901线虫转移到含有连翘脂素的含有e.coli op50的新ngm培养基中(培养基中的连翘脂素浓度和涂布方式与步骤s1相同)，并且统计一次线虫存活、死亡以及逃逸的线虫数目(逃逸线虫需要从统计数据中剔除)，直至所有线虫死亡。线虫死亡的判断依据是当线虫不能移动且没有吞咽动作后，用金属铂丝触碰没有任何反应，则被判定为死亡。逃逸线虫则是指钻入到ngm培养基琼脂中或者是爬到培养皿壁上干死的线虫。实验独立重复3次。
[0034]
线虫寿命实验数据使用spss22.0(demo version,armonk,ny)软件中kaplan-meier生存函数进行分析，对数等级log-rank test进行显著性分析。实验结果采用originlab作图软件进行作图。p《0.05视为两组数据之间具有统计学显著性差异。(p《0.05*表示两组间具有显著性差异，p《0.01**表示两组间差异极显著)。
[0035]
实验结果：
[0036]
nl5901线虫中的α-syn即帕金森疾病的致病因素，其产生的毒素会影响线虫的寿命，所以研究连翘脂素对帕金森疾病的作用，首先要研究连翘脂素对nl5901线虫寿命的影响。实验结果显示，与对照组相比较，20μg/ml和40μg/ml的连翘脂素作用线虫后均显著性地延长了线虫平均寿命，延长率分别为23％(p《0.01)和17％(p《0.05)，如图1和表1所示。由数据可知，连翘脂素浓度较低的情况下对nl5901线虫寿命的延长率越高，具有浓度低效果显著的优点。
[0037]
表1连翘脂素对帕金森病模型线虫寿命的影响
[0038][0039]
实施例2连翘脂素可以延缓nl5901线虫运动能力的减弱
[0040]
将连翘脂素溶于dmso溶液后，将不同浓度的连翘脂素溶液(0、10、20、40μg/ml)与e.coli op50菌悬液(od
600
为0.2～0.3)按体积比1:1混合均匀后，分别取100μl混合液涂布于加有线虫ngm培养基的平板表面。再将同步化到l4期的nl5901线虫分别挑取30只加入到上述涂布好的平板中，之后置于20℃的恒温培养箱中培养，记为实验的第0天。在第5天，第10天，第15天的时候观察线虫的运动情况并进行记录。本实验中将线虫的运动情况分为了三个等级：a等级代表线虫在没有任何碰触的情况下均能自由活动，b等级代表线虫需要被外界刺激(铂丝碰触)后身体自由活动，c等级代表线虫在用铂丝碰触后不能自由运动且仅有吞咽动作。实验独立重复3次。
[0041]
实验结果：
[0042]
nl5901线虫中有害的α-syn聚集会引起da神经元毒性导致线虫出现运动障碍，对线虫的运动能力产生一定的副作用，所以本发明研究了连翘脂素对nl5901线虫运动能力的影响。结果显示，与对照相比，连翘脂素处理过的线虫在第10天的运动能力为a级的提高了12％、27％、21％，在第15天的运动能力为b级的提高了16％、16％、11％(如图2所示)，证明连翘脂素延缓了秀丽隐杆线虫nl5901运动能力的减弱。
[0043]
实施例3连翘脂素降低nl5901线虫α-syn的聚集
[0044]
将连翘脂素溶于dmso溶液后，将不同浓度的连翘脂素溶液(0、10、20、40μg/ml)与e.coli op50菌悬液(od
600
为0.2～0.3)按体积比1:1混合均匀后，分别取100μl混合液涂布于加有线虫ngm培养基的平板表面。再将同步化到l4期的nl5901线虫分别挑取20只加入到上述涂布好的平板中，置于20℃的恒温培养箱中培养2天后，用deltavision去卷积荧光显微镜观察线虫绿色荧光蛋白的聚集情况，统计分析。
[0045]
实验结果：
[0046]
在nl5901线虫的体壁肌肉细胞中会表达具有yfp荧光信号的α-syn，α-syn是一种参与pd发病机制的紊乱蛋白，所以本发明研究了连翘脂素对nl5901线虫α-syn聚集的影响。结果显示，连翘脂素降低了α-syn的聚集，如图3中a-b所示。
[0047]
实施例4连翘脂素增强bz555线虫da神经元表达
[0048]
将连翘脂素溶于dmso溶液后，将不同浓度的连翘脂素溶液(0、10、20、40μg/ml)与e.coli op50菌悬液(od
600
为0.2～0.3)按体积比1:1混合均匀后，分别取100μl混合液涂布于加有线虫ngm培养基的平板表面。将同步化到l4期的bz555线虫在室温下放于2mm的mpp
+
溶液中，每隔10min晃动一次，1小时后用m9缓冲液离心冲洗3次，分别转移到上述涂布好的有不同浓度连翘脂素的ngm培养基中，每板30条，20℃培养2天；再取同步化到l4期的bz555
线虫，不经mpp
+
溶液处理，直接转移到只有e.coli op50的ngm培养基表面，20℃培养2天，用delta vision去卷积荧光显微镜观察线虫咽部绿色荧光蛋白的聚集情况。
[0049]
实验结果：
[0050]
本发明使用在da神经元中表达gfp的转基因突变体线虫bz555评估了连翘脂素对线虫da神经元活力的影响。如图4中a-b所示，与对照相比，线虫用2mm mpp
+
孵育1小时后，从神经环到鼻尖的细胞体和树突中的gfp荧光降低。当用20μg/ml的连翘脂素处理暴露于mpp
+
的线虫时，线虫体内da神经元的gfp荧光强度显著性增加。研究结果表明mpp
+
可以降低bz555线虫中da神经元的活力，这种降低通过连翘脂素处理显著减弱，证明连翘脂素可以增强线虫的da神经元表达。
[0051]
实施例5连翘脂素增强bz555线虫食物感知行为
[0052]
将连翘脂素溶于dmso溶液后，将不同浓度的连翘脂素溶液(0、10、20、40μg/ml)与e.coli op50菌悬液(od
600
为0.2～0.3)按体积比1:1混合均匀后，分别取100μl混合液涂布于加有线虫ngm培养基的平板表面。将同步化到l4期的bz555线虫在室温下放于2mm的mpp
+
溶液中，每隔10min晃动一次，1小时后用m9缓冲液离心冲洗3次，分别转移到上述涂布好的有不同浓度连翘脂素的ngm培养基中，每板30条，20℃培养2天；再取同步化到l4期的bz555线虫，不经mpp
+
溶液处理，直接转移到干净的ngm培养基表面，20℃培养2天。培养2天后，将每组线虫分别转移到有食物和没有食物的ngm培养基中，室温下放置5min后，体式显微镜下观察并记录线虫30秒内的运动情况，按照公式计算线虫食物感知的降低速率：
[0053]
降低速率＝(线虫在无菌条件下的运动次数-线虫在有菌条件下的运动次数)/线虫在无菌条件下的运动次数
×
100％。
[0054]
实验结果：
[0055]
秀丽隐杆线虫的运动速率随食物的存在与否以及线虫的摄食状态而变化。例如，与培养皿上没有细菌食物源时相比，营养良好的野生型线虫在有细菌存在的情况下运动的更慢。这种觅食行为依赖于多巴胺能神经元的感知食物功能，当食物存在时，动物的运动会随之减慢，这种对充足食物的反应减缓被称为基础减缓。多巴胺能功能的缺陷导致线虫在食物存在的情况下有较高运动，其较低的基础反应证明了这一点。mpp
+
处理后的线虫表现出da神经元退化的表型，直接导致线虫的食物感知行为出现异常。本发明的研究结果表明暴露于mpp
+
中的线虫与未暴露于mpp
+
的对照相比，线虫的食物感知行为参数下降了35％(p《0.01)。线虫经mpp
+
处理后，再用20μg/ml的连翘脂素作用线虫后，与暴露于mpp
+
中的对照线虫相比，食物的感知行为参数提高了16.3％(p《0.05)，如图5所示。表明连翘脂素可以增强bz555线虫的食物感知行为。
[0056]
实施例6连翘脂素可以提高nl5901线虫氧化应激状态下的寿命
[0057]
将nl5901线虫同步化至l4期，分别用0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml连翘脂素作用2天(作用方法同实施例1)。再将线虫转移至含240μm胡桃醌的ngm培养基中，每组30条，每小时观察一次线虫存活状态并进行记录(逃逸线虫需要从统计数据中剔除)，直到线虫全部死亡。线虫死亡和逃逸的判断原则同实施例1。
[0058]
实验结果：
[0059]
诸多研究结果显示氧化应激是pd中多巴胺能神经变性的复杂退化级联的关键驱动因素，因此在本发明中检测了连翘脂素对线虫抗氧化应激能力的影响。本发明选用胡桃
醌可以刺激线虫体内发生急性氧化应激反应。结果表明20μg/ml和40μg/ml的连翘脂素与对照组相比可以延长胡桃醌刺激条件下线虫的平均生存时间，延长率分别为39％和34％(如图6以及表2所示)。证明连翘脂素可降低氧化应激对线虫的损伤。
[0060]
表2连翘脂素对nl5901氧化应激状态下生存时间的影响
[0061][0062]
实施例7连翘脂素可以减低线虫胞内ros的含量
[0063]
将nl5901线虫同步化至l4期，分别用0μg/ml、20μg/ml和40μg/ml连翘脂素作用线虫2天(作用方法同实施例1)，再用m9缓冲液离心冲洗线虫2-3次，加入裂解液用匀浆器进行裂解，高速离心收集上清液。将40μl上清液加入到96孔板中(避光)，再加入100μlh2dcf-da探针，于20℃孵育，每20min读一次数，读140min，激发光为485nm，发射光为528nm，剩下的上清液用bca法测蛋白浓度。
[0064]
实验结果：
[0065]
细胞氧化还原失衡后产生过量的ros会导致多巴胺能神经元的死亡，因此本发明研究了连翘脂素对线虫体内ros含量的影响。结果如图7所示，表明20μg/ml和40μg/ml的连翘脂素处理线虫后与对照组相比，显著性降低了线虫体内的ros含量(p《0.05)。
[0066]
实施例8连翘脂素可以增强线虫体内抗氧化酶活性
[0067]
将nl5901线虫同步化至l4期，分别用0μg/ml、20μg/ml和40μg/ml连翘脂素处理线虫4天(处理方法同实施例1)后，用m9缓冲液离心清洗线虫，放入匀浆器中匀浆，高速离心收集上清液，用试剂盒检测线虫体内的sod和gsh含量。
[0068]
实验结果：
[0069]
抗氧化酶蛋白sod和gsh主要是清除线虫体内的活性氧自由基，从分子角度起到抗帕金森疾病的作用。本实施例的研究结果如图8中a-b所示，表明20μg/ml和40μg/ml的连翘脂素处理线虫后，与对照组相比，显著性提高了线虫体内的抗氧化酶sod和gsh含量(p《0.01)。
[0070]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.连翘脂素在制备治疗帕金森病的药物中的应用。2.一种治疗帕金森病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括连翘脂素。3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或注射剂。

技术总结
本发明公开了连翘脂素在制备治疗帕金森病的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明以模式生物秀丽隐杆线虫作为载体，研究了连翘脂素对神经退行性疾病帕金森病的治疗效果。一方面研究了连翘脂素对帕金森病秀丽隐杆线虫模型NL5901线虫寿命、运动能力以及α-Syn蛋白积累的作用，另一方面研究了连翘脂素对BZ555线虫DA神经元表达情况以及食物感知行为的影响。结果发现连翘脂素可以增强线虫体内抗氧化酶的活性，从而抑制和清除线虫体内多余的活性氧自由基，并且降低α-Syn蛋白的异常聚集，达到保护神经细胞免受活性氧自由基损伤，治疗帕金森病的作用。治疗帕金森病的作用。治疗帕金森病的作用。


技术研发人员：李玉英 高引弟 张立伟
受保护的技术使用者：山西大学
技术研发日：2023.02.16
技术公布日：2023/8/23