用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制作方法

1.本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物。


背景技术：

2.几十年来，癌症一直是一个重要的健康问题，随着癌症诊断率的增加，需要更有效和有针对性的癌症治疗。改善癌症治疗的一种方法是使用旨在瞄准癌细胞并将药物精确传递给它们的纳米药物。碳量子点(cqd)纳米药物由于其独特的性能，包括生物相容性、稳定性和高药物负载能力，正在获得普及。本研究将讨论热诊断型cqd纳米药物的开发，特别是那些基于天然产品a.indica和cd33抗体的纳米药物，用于对急性骨髓性白血病(aml)的靶向药物输送。
3.aml是一种影响骨髓和血细胞的血癌。它是一种高度侵袭性和致命的疾病，五年的生存率只有27％。它的特点是异常白血球的快速生长和积累，会干扰身体的正常功能。aml通常用化疗来治疗，但这种治疗的副作用可能很严重，因此需要更有针对性的有效治疗。
4.cqds是纳米材料，已经被广泛地研究用于药物输送和成像应用。它们的直径通常小于10纳米，由碳基材料制成，如石墨烯、碳纳米管和碳黑。cqds有几个独特的特性，使它们成为用于热诊断纳米医学的理想选择。此外，cqd可以用靶向配体(如抗体)进行功能化，以专门针对癌细胞。
5.cqds已被广泛研究，用于癌症治疗中的药物输送和成像应用。它们的体积小，容易进入细胞，使它们成为靶向药物输送的理想选择。cqds可以装载各种药物，包括化疗剂和sirna，并且可以与靶向配体(如抗体)共轭，以专门针对癌细胞。
6.a.indica，也被称为楝树、苦楝树，是一种在传统医学中使用了几个世纪的天然产品。它已被证明具有广泛的生物活性，包括抗真菌、抗菌、抗病毒和抗癌特性。近年来，楝树因其在癌症治疗中的潜在用途而被广泛研究，并且已经开发了一些基于楝树的产品。由于楝树和cqd的独特性能，基于楝树的cqd纳米药物有可能成为高效的癌症治疗方法。一些研究已经调查了使用基于印楝的cqd纳米医学药物治疗癌症，包括急性髓细胞白血病。
7.cd33是一种跨膜蛋白，表达在骨髓细胞的表面，包括aml细胞。cd33是开发基于抗体的aml疗法的一个潜在目标。cd33是开发aml抗体疗法的潜在目标，已经开发了几种cd33靶向疗法，包括gemtuzumab ozogamicin(go)。这种cd33靶向的抗体-药物结合物已被批准用于治疗aml。一种方法是将cd33靶向抗体与纳米医学药物(如cqd)相结合。开发基于cd33抗体功能化的cqd的靶向纳米药物代表了治疗aml的一个有希望的战略。由于cqd体积小、生物相容性高、光致发光性能好，因此是靶向药物输送的理想选择。
8.热诊断是一类结合了诊断和治疗功能的纳米大小的药品。它们被设计为直接向癌细胞提供药物，同时提供实时疾病成像。这使医生能够监测治疗的进展并根据需要调整剂量。改善癌症治疗的一种方法是使用旨在瞄准癌细胞并向其精确输送药物的纳米药物。热诊断cqd纳米药物是结合了治疗和诊断能力的新型纳米药物。这些纳米药物可以被设计成
专门针对癌细胞并向其输送药物，同时还提供成像功能，可用于监测疾病的进展和治疗的有效性。基于cqd的热诊断技术的发展有可能使aml的治疗发生革命性的变化，使化疗药物有针对性地输送到癌细胞。
9.近年来，研究人员已经开发了基于cqd的治疗平台，该平台同时包含了化疗药物和成像剂。这些纳米药物可以选择性地针对癌细胞，导致更好的治疗效果和减少毒性。总的来说，开发基于cqd的纳米医学药物用于aml治疗代表了癌症治疗领域的重大进展，有可能改善患者的治疗效果和生活质量。
10.药物是较小的分子，不能独立引发免疫反应。免疫原性较低或无免疫原性的载体蛋白，能够引发免疫原体的体液反应，对于传递较小的多肽和药物是必要的。我们已经开发了五种类型的热诊断纳米医学药物。目前缺乏关于cqd作为纳米制剂中的纳米载体的特点和使用的数据。


技术实现要素：

11.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物，本发明开发的新型热诊断碳量子点纳米药物与a.indica共轭，对于药物和纳米药物向急性骨髓性白血病细胞的定向输送和治疗非常有用。
12.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
13.本发明的一方面，提供一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物，所述化合物为由cqd纳米材料与植物化学物质形成的衍生物cqds，所述植物化学物质为楝树甲醇提取物，所述化合物包括以下任意一种：
14.(a)酚类共轭cqds，由cqd纳米材料与楝树甲醇提取物合成，记为oh-cqds；
15.(b)nf 1，由(a)与兔多克隆cd33合成，记为cd33-oh-cqds；
16.(c)醛类共轭cqds，由cqd纳米材料与氧化后具有醛基的楝树甲醇提取物合成，记为醛-cqds，所述具有醛基的楝树甲醇提取物，是指楝树甲醇提取物通过转移氧或去除电子而得到的产物；
17.(d)nf 2，由(c)与兔多克隆cd33合成，记为cd33-醛-cqds。
18.siglec-3(sialic acid binding ig-like lectin 3)或cd33是一种跨膜蛋白，在骨髓细胞包括aml细胞的表面表达。cd33是开发基于抗体的aml疗法的一个潜在目标。这种cd33靶向的抗体-药物结合物已被批准用于治疗aml。本发明将cd33靶向抗体与纳米药物相结合，并使用cqds的a.indica。本发明所设计的靶向cqds与植物药物共轭，并与cd33抗体功能化，在治疗aml方面表现出良好的效果。本发明设计的热诊断cqd由于其体积小，是靶向药物输送的理想选择。这将使医生能够监测治疗的进展，并根据需要调整药物的剂量。本发明的热诊断cqd纳米医学药品在急性髓细胞白血病中具有治疗和诊断的作用。我们开发的配方可用于监测疾病的进展和治疗的有效性。
19.可选地，在本发明的一个实施例中，氧化是指印楝树的甲醇提取物中的羟基(oh-)氧化为醛基(＝o)。本发明中的氧化方法包括能够实现羟基(oh-)氧化为醛基(＝o)的所有方法，例如氧转移或电子去除。在本发明的一个实例中，采用了氧传递的方法，具体是将印楝树的甲醇提取物置于常规环境中，用空气进行自然氧化，氧化后得到含醛基(＝o)的印楝
树的甲醇提取物。在其他例子中，还可以使用诸如电子去除的其他氧化方法，这些方法在本发明中不受限制。
20.可选的，在本发明的一种实施方式中，制备所述楝树甲醇提取物的方法具体包括：将50g干印楝叶粉(即为楝树叶粉)与500ml甲醇混合，1周后过滤，冷凝干燥得到印楝叶甲醇提取物(即为楝树甲醇提取物)，储存在-20℃以备将来使用。
21.可选地，在本发明的一个实施方案中，将0.57g l-半胱氨酸溶解于10ml水中，向混合物中加入1.5g柠檬酸，通过微波加热将cqd纳米材料溶解2-8分钟，冷却至室温，并溶解于10ml去离子水中，得到棕色溶液，经离心过滤后用乙酸乙酯提取cqd溶液。
22.可选地，在本发明的一个实施例中，微波加热时间为2-6分钟，优选为4分钟。可选的，在本发明的一种实施方式中，所述离心过滤为在9000rpm下离心10分钟，以去除杂质，并用过滤器过滤。
23.本发明的另一方面，提供一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，所述化合物为如权利要求1所述的(a)，所述方法包括以下步骤：
24.将印楝树的甲醇提取物悬浮于含有50mg/ml n，n
’‑
羰基二咪唑的四氢呋喃悬浮液中，并在室温下混合2小时，得到活性颗粒，再用四氢呋喃洗涤，以10mg/ml的浓度重悬于冷偶联缓冲液i中，再用冰水洗涤，偶联缓冲液i为0.1m，ph＝8-10；
25.按照楝树甲醇提取物冷偶联缓冲液i与cqd为1：1的体积比，加入cqd纳米材料，通过在4℃下搅拌至少18小时获得所述化合物(a)。
26.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述cqd纳米材料的浓度为4.28μg/μl。
27.可选的，在本发明的一种实施方式中，偶联缓冲液i的ph值为9.5。
28.本发明的另一方面，提供一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，所述化合物为如权利要求1所述的化合物(b)，所述方法为，以1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳二亚胺edc为交联剂，使用碳二亚胺法将酚类共轭cqds与兔多克隆cd33相连。
[0029]
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
[0030]
10mg oh-cqds置于10ml耦合缓冲液ⅱ中，并用1m naoh调节至ph 8；
[0031]
50μl兔多克隆cd33置于10ml偶联缓冲液中；
[0032]
两种溶液充分混合，按edc与cqd的质量比为1:1加入edc以激活cqd的羧基，用1m hcl调节至ph 6.4；
[0033]
将反应混合物在37℃的黑暗环境中培养2小时，以100rpm的速度持续摇动，经离心、洗涤后得化合物(b)；
[0034]
所述耦合缓冲液ⅱ为50mm磷酸钠。
[0035]
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述离心指在40℃下以12,000rpm的转速离心10分钟，除去剩余的未附着的分子。
[0036]
本发明的另一方面，提供一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，所述化合物为如权利要求1所述的(c)，所述方法包括以下步骤：
[0037]
将含醛基的苦楝树甲醇提取物以1-10mg/ml的浓度在缓冲液iii中氧化，其中缓冲液iii由0.05m碳酸和0.1m柠檬酸钠组成，ph值为8-10；将cqd纳米材料以含醛基的氧化苦楝树甲醇提取物与cqd纳米材料按1:4的摩尔比溶解在缓冲液iii中以获得共轭溶液；化合物
(c)通过透析纯化并在4℃保存。
[0038]
可选地，在本发明的一个实施例中，缓冲溶液iii的ph值为9.6，氧化后含醛基(＝o)的印楝树的甲醇提取物为1mg/ml。
[0039]
可选地，在本发明的一个实施例中，中断反应的方法是向每毫升共轭溶液中加入10μl乙醇胺(ph＝9.6)以阻断未反应位点。
[0040]
本发明的另一方面，提供一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，所述化合物为如权利要求1所述的(d)，所述方法为，以1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳二亚胺edc为交联剂，使用碳二亚胺法将醛类共轭cqds与兔多克隆cd33相连。
[0041]
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
[0042]
在10ml耦合缓冲液ⅱ中加入10mg醛-cqds，用1m naoh调节至ph8；
[0043]
在10ml耦合缓冲液ⅱ中加入50μl cd33，用1m naoh调节至ph8；
[0044]
两种溶液充分混合，按照cqds与edc的质量比为1:1加入edc，用1m hcl调节ph6.4以激活羧基；
[0045]
反应混合物在37℃的黑暗环境中培养2小时，以100rpm的速度持续摇动，经离心、洗涤后得化合物(d)；
[0046]
所述耦合缓冲液ⅱ为50mm磷酸钠。
[0047]
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述离心指在4℃下以12,000rpm离心10分钟，以去除任何未附着的分子。
[0048]
本发明的另一方面，提供所述的化合物在制备急性髓系白血病靶向药物中的用途。
[0049]
有益效果：本发明提供的用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物，与现有技术相比，具有以下优势：所设计的靶向cqd与植物药共轭，并与cd33抗体功能化，在治疗aml方面表现出了很好的效果。本发明设计的热诊断cqds由于其体积小，是靶向药物输送的理想选择。这将使医生能够监测治疗的进展，并根据需要调整药物的剂量。我们的热诊断cqds纳米医学药品在急性髓细胞白血病中具有治疗和诊断的作用。我们开发的配方可用于监测疾病的进展和治疗的有效性。
附图说明
[0050]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0051]
图1：a.indica甲醇提取物中植物化学物质的存在(黄酮类、生物碱、单宁、苯酚、皂甙、甾体和萜类)。
[0052]
图2：cqd的合成示意图。
[0053]
图3：合成cqd热诊断纳米制剂的反应序列的建议模型。方案展示了标准药物(b)在cqd(a)上的整合，使标准药物纳米制剂与阿糖胞苷反应，最终形成热诊断纳米药物(c)。植物化学物质(d)与cqd(a)反应，进行还原胺化，与胺基共轭，激活oh基(e)。然后cd33蛋白与
cqd反应(e)。cd33与cqd的羧基结合，最终形成靶向热诊断nf1和nf2(g)。
[0054]
图4：cqd的紫外亮度分析。图像表明，cqd纳米颗粒在uv盘上具有明显的亮度，并与水区分开来。清晰的亮度表明合成了更小、高质量的量子点纳米颗粒。
[0055]
图5：cqd的紫外可见吸收光谱(a)、标准药物nf的紫外可见吸收光谱(b)、oh-cqd的紫外可见吸收光谱(c)、nf1的紫外可见吸收光谱(d)、醛-cqd的紫外可见吸收光谱(e)、nf2的紫外可见吸收光谱(f)。
[0056]
图6：cqds纳米颗粒的ftir红外光谱(a)、标准药物nf的ftir红外光谱(b)、oh-cqds(c)和nf1(d)的ftir红外光谱、醛-cqd(e)和nf2(f)的ftir红外光谱。
[0057]
图7：cqd的xrd(a)、标准药物nf的xrd(b)、nf1(c)、nf2(d)的xrd。
[0058]
图8：cqd纳米颗粒的zeta电位(a)、标准药物nf的zeta电位(b)、靶向nf1的zeta电位(c)、靶向nf2的zeta电位(d)。
[0059]
图9：cqd纳米颗粒的dls分析(a)、标准药物nf的dls分析(b)、oh-cqd(c)和nf1(d)的dls分析、醛-cqd(e)和nf2(f)的dls分析。
[0060]
图10a：cqds在200nm和100nm尺度下的sem图像。
[0061]
图10b：标准药物nf在200nm和100nm尺度下的sem图像。
[0062]
图10c：目标nf1在300nm和100nm尺度下的sem图像。
[0063]
图10d：目标nf2在300nm和100nm尺度下的sem图像。
[0064]
图11a：cqds元素组成的edx图像，条件如下：电压：20kv，放大倍数:100，启动:26.3，检测时间(s):50，时间常数:3.84μs，分辨率:137.9ev。
[0065]
图11b：cqds的edx显微照片。
[0066]
图12:cqd综合原理图。
[0067]
图13：大鼠注射诊断用纳米制剂组示意图。
[0068]
图14：第1天至第25天大鼠(诱导)体重。
[0069]
图15：诱导大鼠第1天至第23天的剂量。
[0070]
图16：第1天至第12天大鼠体重(治疗组)。
[0071]
图17：cqd诊断纳米药物在白血病血玻片上的体外受体结合。不同的荧光过滤器表明血液中存在cqd纳米颗粒和纳米制剂。仅在血液中的荧光显示了纳米制剂的血液受体靶向和结合。
[0072]
图18:对照组和治疗组全血细胞计数水平。
[0073]
图19:对照组和治疗组lft参数。
[0074]
图20:对照组和治疗组rft概况。
[0075]
图21:经诊断性纳米制剂处理的大鼠血液的宏观检查。(a)对照组，(b)阴性对照组，(c)纳米载体组，(d)提取物基组，(e)标准药物纳米制剂组，(f)oh-cqd组，(g)醛-cqd组，(h)nf1，(i)nf2。
具体实施方式
[0076]
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发
明。
[0077]
实施例1制备a.indica甲醇提取物
[0078]
楝树植物(a.indica)的新鲜植物样本于2022年3月从nibge faisalabad收集。这些植物作为野生植物自由生长，并由imbb部门的植物学家yasin ashraf博士鉴定。
[0079]
制备甲醇提取物的方法具体为：将50g粉碎的干楝树叶粉与500ml甲醇混合，放置1周后将混合物过滤，用旋转蒸发器冷凝，并冻干，以获得用于进一步分析的甲醇提取物。甲醇提取方法采用本领域常用的溶剂提取法，本技术在此不再赘述。
[0080]
由于其生物和治疗特性，许多植物化学物质被广泛用于药物和制药行业。a.indica已经变得越来越重要，因为它具有解决各种健康问题的潜力。楝树植物(a.indica)的定性分析结果如图1及表1所示，其中对照组为苦楝甲醇提取物。可以看出，苦楝甲醇提取物含有最高水平的皂甙(皂素)、类固醇和萜类化合物，单宁酸的水平适中，苯酚、生物碱和黄酮类化合物的水平低。
[0081]
表1楝树植物(a.india)的植物化学含量。
[0082][0083]
+++:最多存在的；++:中等程度的存在；+:最少存在的实施例2制备cqd
[0084]
如图2所示为cqd的合成示意图，以半胱氨酸和柠檬酸为原料，使用快速微波辅助合成方法制备cqd，成功实现了cqd纳米粒子的合成。本发明，制备方法具体如下。
[0085]
将0.57g l-半胱氨酸(cysteine)溶解在10ml去离子水中，加入1.5g柠檬酸(citric acid)混合；溶液经超声处理10分钟，然后在微波炉中加热4分钟；将溶液冷却至室温后，将其溶解在10ml去离子水中，得到棕色溶液；然后将该溶液在9000rpm下离心10分钟，以去除杂质，并用过滤器过滤；最后用乙酸乙酯提取cqd溶液，获得浓度为4.28μg/μl的cqd纳米材料，并储存在4℃的冰箱中，备用。
[0086]
图4所示的cqd的紫外亮度分析中，在紫外盘上观察到合成的cqd纳米颗粒的发光情况。图像表明，cqd纳米颗粒在uv盘上具有明显的亮度，并与水区分开来。清晰的亮度表明合成了更小、高质量的量子点纳米颗粒，证实本发明实施例成功合成了具有强烈发光的cqd纳米颗粒。
[0087]
图5(a)所示的紫外可见光谱显示cqd在364纳米处有一个吸收峰。
[0088]
图6(a)所示的傅立叶变换红外光谱分析证实了cqd表面存在羰基、羧基和羟基功能团。
[0089]
图7(a)所示的xrd结果显示了cqd在19.3℃左右具有峰值，表明cqds是天然存在的
无定形碳颗粒。
[0090]
图8(a)所示的zeta电位结果显示了cqd的zeta电位在-3.1mv有一个单峰，表明cqd表面有负电荷分子。
[0091]
图9(a)所示的动态光散射(dls)结果显示了cqd的单分散性和2-5nm的狭窄尺寸范围。
[0092]
图10(a)所示的sem结果显示，cqd是直径为30-40纳米的不规则球形结构。
[0093]
图11(a)所示的cqd的edx光谱显示了对应于o、c、na、rb、au、s和pb的峰。
[0094]
从图12所示的制备过程中获得的cqd的实际产品图显示了cqd纳米材料的成功制备。
[0095]
实施例3-7制备五种热诊断纳米药物
[0096]
由于其独特的物理特性，cqd被用作所有纳米医学药物的纳米载体。本技术制备了五种热诊断纳米药物，以研究纳米药物对靶向药物输送的影响。
[0097]
图3描述了用cqd进行热诊断的纳米医学的特征过程，下面分别以实施例3-实施例7分别制备靶向和非靶向nfs(oh-cqds、nf 1、醛-cqds、nf 2)及标准药物nf，逐一进行详细说明。
[0098]
实施例3酚类共轭cqds(oh-cqds)(非靶向)：
[0099]
第一种纳米药物涉及cqds-oh，它还可以进一步被衍生，为生物分子的耦合提供不同的官能团，制备其他的cqds，如后续实施例4-6的产物。该实施例的方法为使用4.28μg/μl的cqd纳米材料和植物化学物质(即实施例1制得的甲醇提取物)共轭。
[0100]
冻干的印楝树甲醇提取物(实施例1中的甲醇提取物)悬浮在含有50mg/ml的n,n'-羰基二咪唑(cdi)的四氢呋喃(thf)悬浮液中，在室温下混合2小时激活粒子。活化的颗粒用四氢呋喃清洗以去除多余的cdi和副产品，然后以10mg/ml的浓度重新悬浮于冷的耦合缓冲液ⅰ(0.1m碳酸钠，ph＝9.5)中，并用冰冷的去离子水清洗。最后，按照楝树甲醇提取物与cqd为1：1的体积比，加入4.28μg/μl含核糖核酸的胺(即实施例2制得的cqd)，并在4℃下通过搅拌使其反应至少18小时。
[0101]
实施例4cd33结合的oh-cqds(cd33-oh-cqds)(nf 1)：
[0102]
nf1使用碳二亚胺法(1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳二亚胺edc为交联剂)将酚类结合的cqds与兔多克隆cd33相连，具体步骤如下。
[0103]
将10mg oh-cqds置于10ml耦合缓冲液ⅱ(50mm磷酸钠)中，并用1m naoh调节至ph 8。然后，将50μl兔多克隆cd33(总浓度500μg)溶解于10ml偶联缓冲液(ph9.5的0.1m碳酸)中。将两种溶液充分混合，并加入10mg edc(edc与cqd的质量比为1:1)以激活cqd的羧基，同时用1m hcl调节至ph 6.4。然后将反应混合物在37℃的黑暗环境中培养2小时，以100rpm的速度持续摇动。在40℃下以12,000rpm的转速离心10分钟，除去剩余的未附着的分子，然后用tbs洗涤三次(每次20ml)。最后，将洗过的颗粒悬浮在1
×
tbs缓冲液中，并在-20℃储存备用。
[0104]
实施例5醛共轭cqds(aldehyde-cqds)(非靶向)：
[0105]
醛-cqds涉及将植物化学物质与胺功能化的cqd共轭，具体步骤如下。
[0106]
(1)氧化:将植物化学物质(实施例1中的甲醇提取物)氧化后，得到含有醛基的甲醇提取物的中间产物。苦楝甲醇提取物氧化后含醛基是指苦楝甲醇提取物转移氧或去除电
子后得到的产物。在本实验中，苦楝的甲醇提取物通过氧传递的方法直接放置在常规的环境中，即氧传递，在空气中自然氧化，氧化后得到含醛基(＝o)的苦楝树的甲醇提取物。
[0107]
(2)醛键结合：将氧化处理后含醛基(＝o)印楝树甲醇提取物悬浮在缓冲液ⅲ(0.05m碳酸钠和0.1m柠檬酸钠，ph＝9.6)中，浓度为1mg/ml。接着，将胺官能化的cqd(即实施例2制得的cqd)加入到步骤(1)将含醛基的氧化苦楝树甲醇提取物中，以氧化后具有醛基的楝树甲醇提取物与cqd纳米材料的摩尔比为1:4的比例，溶解在上述缓冲液ⅲ中，获得共轭溶液。然后，每毫升共轭溶液中加入10μl含5m氰化钠硼氢化物的1m氢氧化钠溶液，并让该溶液在旋转器上反应2小时。通过在每毫升共轭溶液中加入10μl乙醇胺(ph＝9.6)来阻断未反应的部位，并让其在旋转器上反应30分钟。然后通过透析纯化颗粒15分钟，并在4℃储存备用。
[0108]
实施例6cd33结合的醛基-cqds(cd33-醛-cqds)(nf 2)：
[0109]
nf2的制备方法具体如下：
[0110]
在10ml耦合缓冲液ⅱ(50mm磷酸钠)中加入10mg的醛-cqds(实施例5制得)，另在10ml耦合缓冲液ⅱ(50mm磷酸钠)中加入50μl的cd33，分别用1m naoh调节至ph8。两种溶液充分混合，然后加入10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)(cqds与edc的质量比为1:1)，用1m hcl调节ph6.4以激活羧基。反应混合物在37℃的黑暗环境中培养2小时，以100rpm的速度持续摇动。然后在4℃下以12,000rpm离心10分钟，以去除任何未附着的分子，接着用tbs洗涤三次(每次20毫升)。最后，将洗过的颗粒悬浮在1
×
tbs缓冲液中，并在-20℃储存备用。
[0111]
实施例7标准药物nf纳米配方：
[0112]
使用标准药物(阿糖胞苷，cytarabine)并使用戊二醛法将其与cqd结合，具体方法如下。
[0113]
首先，通过吸出上清液和用偶联缓冲液清洗cqd，去除多余的戊二醛：通过高功率超声处理10分钟，将100mg的cqd(实施例2制得)分散在100ml的偶联缓冲液(0.01m吡啶盐酸盐，ph6.0，0.1m氯化钠)中。然后将悬浮液以14,000rpm离心40分钟，10分钟后除去上清液。第二次洗涤后，将cqd悬浮在连接缓冲液(含有5％戊二醛的耦合缓冲液)中，在25℃下以100rpm的速度摇晃3小时，然后以14,000rpm离心20分钟。
[0114]
然后，将10mg阿糖胞苷溶解在100ml偶联缓冲液(0.05毫升碳酸，0.1毫升柠檬酸钠，ph9.5)中，保留1ml作为预耦合缓冲液。剩余的溶液与100mg洗过的cqd结合。将该混合物在25℃下从头到尾摇动24小时，然后在4℃下以8000rpm离心，得到标准药物nf。将已定性的共轭cqds保存在-20℃的0.01m tris-cl的储存缓冲溶液中，ph值为0.01。
[0115]
测试例
[0116]
为了表征采用cqd制备的五种热诊断纳米药物cqds，本技术采用包括紫外可见光谱、傅里叶变换红外(ftir)光谱、x射线衍射(xrd)、动态光散射(dls)、zeta电位、扫描电子显微镜(sem)和能量色散x射线(edx)等技术对cqd和热诊断纳米药物进行了进一步的表征，用来确定cqds的形态、化学成分和尺寸。
[0117]
此外，本技术还采用五种热诊断纳米药物进行体内、体外实验，验证其药性作用。
[0118]
测试例1cqds的物性表征
[0119]
(1)紫外可见光谱
[0120]
我们检查了紫外-可见光谱数据以更好地了解cqds的尺寸和尺寸分布(图5)。本研究中制备的水溶性cqd呈黄褐色，它们在紫外-蓝色波长范围内表现出强烈的吸光度，延伸到500nm以上，与大多数cqd吸收光谱数据一致。在245nm和355nm处观察到两个明显的峰值，对应于c＝c/c＝n和c＝o双键的π-π*和n-π*电子转换。
[0121]
荧光检测在统一条件下进行，激发波长和发射范围分别设置为355和380～750nm(图5a)，激发和发射的狭缝宽度分别设置为10nm和15nm(图5)。紫外-可见光扫描在200～750nm之间进行。对于标准药物nf，在380nm处观察到一个峰值(图5b)，而对于oh-cqds，在390nm处观察到一个具有更大红移的峰值(图5c)。图5d显示了nf1在387nm处的峰值和醛基-cqds在375nm处的峰值(图5e)。如图5f所示，nf2在385nm处观察到峰值。cqds表现出两个不同的发射峰。使用五种不同方法合成的cqds观察到不同的荧光强度。
[0122]
(2)ftir
[0123]
在图6中，ftir光谱显示了存在于cqd中的各种官能团的特征峰。在3515.59-3607.81cm-1
的范围内观察到了oh和nh的拉伸振动峰，而2914.94cm-1
的小波段可能是由于c-h键的拉伸振动。在2086.09cm-1
处的较弱的峰值证实了-sh基团的存在。c＝o键在1654.23-1720.23cm-1
的拉伸振动峰表明了羧基的存在，而1620.62cm-1
的峰则归因于c-o的拉伸和弯曲振动。c＝c峰证实了cqd的石墨结构，而oh、c＝o和c-h弯曲峰表明了相应的表面分子的存在。温和的胺n-h弯曲峰出现在1580.54cm-1
，而1380.41cm-1
与c-n、n-h和-coo键的拉伸振动有关。图6b显示了标准药物与cqd的共轭情况。在3515.59-3607.81cm-1
位置没有胺基的n-h拉伸，在3653.32位置的弯曲证实了阿糖胞苷与cqd纳米颗粒的共轭。在图6c中，只有oh-cqd在1720.23cm-1
处观察到一个c＝o峰，证实了羧基的存在。用羰基-咪唑激活cqd的羟基，导致3515.59-3907.69cm-1
处的oh伸展消失，1720.23cm-1
处的c＝o键伸展出现，证实了oh-cqd(图6c)。当用氰基硼氢化物激活cqd的醛基并与植物化学物质共轭时，c＝o拉伸峰出现在1720.23cm-1
，而胺基的n-h拉伸峰在3854.32cm-1
消失(图6e)。在植物化学制品与cqd共轭的过程中，碳二亚胺被用来激活oh-cqd和醛-cqd上的羧基。3515.59-3907.69cm-1
处的o-h拉伸在两种植物化学物共轭的cqd中都消失了，证实了蛋白质在cqd上的共轭(图6d，6f)。
[0124]
(3)xrd
[0125]
在图7中，使用x射线衍射(xrd)对cqd进行了表征。石墨碳的存在导致在19-24
°
的2θ范围内出现明显的衍射峰，对应于(002)平面。根据布拉格公式(1.1)，确定了cqds的晶格间距，约为0.402纳米。这些发现表明，cqd具有无定形结构，其石墨碳核心包括sp2混合碳。
[0126]
2d sinθ＝nλ
………………………………………
(1.1)
[0127]
其中d是cqd晶格间距，θ是衍射角，n是反射系列，λ是波长。
[0128]
cqds的x射线衍射(xrd)分析见图7a。在19.3℃左右的峰值表明，经xrd测定，cqds是天然存在的无定形碳颗粒。图7b中标准药物纳米制剂的xrd图案显示在22.26℃有一个大峰，在25.48℃有一个小峰，对应于(002)。图7c显示在nf1的xrd图案中，在19.86℃有一个大峰，在23.84℃有一个小峰，对应于(002)。在图7d中，nf2的xrd图案显示在20.1℃有一个大峰，在28.46℃有一个小峰，对应于(002)。
[0129]
(4)zeta电位
[0130]
在图8中，合成的cqd的尺寸分布被zeta-仪确认。发现cqd的zeta电位在-3.1mv有
一个单峰(图8a)，表明cqd表面有负电荷分子。在水介质中，cqd表面的羟基、羰基和羧基的高浓度导致zeta电位为-3.1mv，表明带负电荷的cqd在水溶液中的高分散性和稳定性。图8b显示，即使在共轭后，标准药物纳米制剂的zeta电位仍然是负的，为-3.8mv，表明cqd表面继续存在羧基。图8c显示nf1的zeta电位为-3.3mv，表明在cqd纳米颗粒的表面有形成键的趋势。图8d显示nf2的zeta电位为-5.4mv，表明在cqd纳米颗粒表面形成键的趋势更强。
[0131]
(5)dls
[0132]
图9显示了通过dls分析的cqd纳米颗粒的尺寸和分散情况。cqd纳米颗粒的尺寸从2-3.3nm不等，平均尺寸为2.909nm(图9a)。标准药物纳米制剂的dls分析显示，纳米颗粒的平均尺寸为50nm，尺寸范围小于100nm(图9b)。oh-cqd纳米颗粒的尺寸范围为15nm～100nm和100nm～600nm，平均尺寸为140纳米(图9c)。同样，在nf1之后，纳米粒子的尺寸范围据说在150～200纳米之间，平均尺寸为164nm(图9d)。醛-cqd纳米颗粒的大小为13nm～23nm，40nm～300nm，平均大小为112nm(图9e)。一些醛-cqd纳米颗粒由于植物化学的结合而显示出较大的尺寸。在蛋白质附着在nf2上之后，观察到的尺寸范围为150nm～250nm，平均尺寸为211nm，这表明纳米粒子的尺寸变得稳定(图9f)。
[0133]
(6)sem
[0134]
图10显示，配备edx的sem被用来展示合成的纳米药物的形态特征和元素组成。使用100nm和200nm的不同放大率来捕捉cqds的表面形态。图10a描述了cqds的不规则球形形状，直径约为10～40nm。sem中使用的高能电子束提供了固体标本的信息，导致信号集中在目标标本上。如图10b所示，标准药物纳米制剂显示出不规则的立方体形态，其直径约为50～110nm。目标的nf1和nf2表现出不同大小的聚集颗粒，由于植物化学成分的作用，直径小于100nm，如图10c和10d所描述。
[0135]
(7)edx
[0136]
为了确定所合成的cqds的元素组成，进行了edx分析，如图11a所示。表2显示，edx证实了o、c和其他元素的存在。cqds的edx光谱显示了对应于氧(o)、碳(c)和钠(na)的峰值，其原子百分比分别为81.28％、44.85％和6.41％。存在于cqd中的其他元素的重量百分比为铷(rb)、金(au)、硫(s)和铅(pb)。cqds只显示c和o的信号。edx数据证实，cqds在被c和o功能化的同时保持了它们的形态。cqds的元素组成在edx图像中被突出显示，覆盖了整个图的区域，如图11b所示。显微照片描绘了o、c、na、rb、au、s和pb等元素，o、c、na、rb、au、s和pb的原子和重量百分比分别为81.28、28.21、5.9、0.12、0.96、11.16和0.59，和61.47、44.85、6.41、0.48、8.94、16.91和5.8。
[0137]
表2：cqd的元素组成。
[0138][0139]
测试例2aml潜力分析：
[0140]
为了进行aml的潜在分析，从拉合尔大学imb部门的动物房购买了体重超过100克的雄性wistar大鼠，并在动物房的单独笼子里饲养。所有的动物护理和处理都按照我们机构的实验动物指南进行。
[0141]
对照组包括4-5周大的雄性(n＝3)，饲养在单独的笼子里，给予正常的商业饮食和蒸馏水。
[0142]
使用n-乙基-n-亚硝基脲(enu)对大鼠进行aml诱导，enu已被证明可诱发白血病效应。使用腹腔注射(ip)的aml诱导方案先前已有报道，所有大鼠根据其组别被关在不同的笼子里。给大鼠喂食商业饮食，并根据它们的体重用特定剂量的enu和nacl进行诱导。
[0143]
四周后，阴性对照组的三只大鼠被牺牲，并被检查出诊断为aml。其余的大鼠用治疗性纳米药物治疗，在接触enu的整个过程中监测它们的体重。在解剖时，记录每只大鼠的体重，并用氯仿麻醉它们10-15分钟。然后刺穿大鼠的心脏，将其全血收集在一个小瓶中，血清被分离并保存在-20℃，备用。
[0144]
对大鼠的全血进行cbc和d-dimers检查，并测定血红蛋白、白细胞、总红细胞、pvc、mcv、mch、mchc、中性粒细胞与淋巴细胞比率(nlr)、血小板、单核细胞数和嗜酸性粒细胞等参数。
[0145]
对解冻的血清进行lft和rft检测，以确定碱性磷酸酶(alp)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、胆红素、白蛋白、总蛋白、球蛋白、a/g比率、肌酐和尿素。
[0146]
每张载玻片只做一次涂片，用主导的手将第二张显微镜载玻片的边缘放在第一张载玻片上的血滴前面，角度约为35-45℃。用轻柔的压力将第二张载玻片拉回血滴中，并让血液扩散到载玻片的边缘。迅速而轻柔地移动顶部的载玻片，使血液扩散到涂片的其余部分。然后将涂片用空气吹干，在100％甲醇中浸泡，然后用10％的吉姆萨溶液和蒸馏水进行染色。用自来水冲洗载玻片，并用比色纸擦干。
[0147]
测试例2结果1通过靶向给药(体内和体外)实现热诊断的纳米医学效果
[0148]
热诊断纳米药物有可能作为诊断、预后和治疗的单一配方。这些纳米药物在体内和体外的靶向给药方面已显示出良好的效果。
[0149]
如图12所示，用24只aml诱导大鼠(enu+nacl)来评估其疗效和药物与白血病细胞的结合情况(体内和体外)。在使用不同的纳米制剂治疗前后，对大鼠的体重和活动进行监测。
[0150]
大鼠被分为七组，每组有三只大鼠，如下表3所示。a组用生理盐水(阴性对照)，b组使用含50mg/kg cqd纳米材料的生理盐水，c组用实施例1所得的甲醇提取物，d组用50mg/kg标准药物的纳米制剂(实施例7所得的标准药物nf)，e组至h组用盐水中含有50mg/kg cqds的靶向和非靶向nfs治疗(实施例3-6所得的oh-cqds、nf 1、醛-cqds、nf 2)，每周三次ip注射。
[0151]
对动物进行30天的观察，并在给药期间记录其活动和体重。动物在治疗期间没有表现出不良反应，存活率也很有效。这些结果证明了热诊断纳米药物在体内定向给药方面的潜力。
[0152]
表3：热诊断纳米药物的标记处理组
[0153][0154]
治疗一个月后，给大鼠打针并解剖。在解剖前，记录大鼠的体重，并用氯仿麻醉它们。进行心脏穿刺以宰杀大鼠，并在三个小瓶中收集血液，包括薰衣草色、浅蓝色和黄色盖子的试管，如图1所示。
[0155]
20微升血液被分离用于荧光分析，而剩余的血液被用于各种血液测试，如cbc，lft，rft，d-二聚体，nlr和血液切片研究。从这些测试中获得的数据用柱状图进行分析，结果用平均值和标准差表示。数据分析采用spss 26版，结果显著性水平为p《0.05。结果是使用originpro8构建的，如图13所示。
[0156]
测试例2结果2纳米药物的治疗效果(体外)
[0157]
在对大鼠进行解剖后，在体外评估了热诊断纳米医学药物对靶向药物输送的效果。在荧光显微镜下检查经处理的大鼠的血液，以评估白蛋白涂层载玻片上的粘附血细胞。用甲醇固定载玻片，然后在37℃下培养20-25分钟。用pbs清洗后，在荧光显微镜下用蓝色和绿色激发滤光片观察结合情况。
[0158]
用软件分析荧光强度，并通过测量67平方厘米区域的强度来估计血液中纳米颗粒和靶向药物的浓度。这些实验为热诊断纳米医学对体外靶向药物输送的影响提供了宝贵的见解。
[0159]
30天的治疗监测结果见图14。诱导enu剂量后，aml诱导的体重逐日下降(图14)。enu的剂量随着体重的下降而增加(图15)。纳米制剂对接受治疗的大鼠是有活性的，尽管有些大鼠在用药后出现了头晕，但很快就消退了，它们又恢复了正常的活动。图16中总结了治
疗对30天内体重增加或减少的影响。所有用cqd热诊断纳米药物治疗的大鼠都活得更长，通常体重增加。
[0160]
体外调查验证了热诊断纳米药物的配方影响了aml受体的结合部位。图17显示了cqd热诊断纳米药物成功地附着在aml血液受体上。通过蓝色和绿色荧光过滤器观察到血液中cqd纳米颗粒的存在。nf1和nf2与aml细胞受体有效结合。
[0161]
测试例2结果3cqd热诊断纳米医学对白血病治疗的影响
[0162]
对照组、阴性对照组和治疗组(纳米载体、提取物、标准药物、oh-cqd、醛-cqd、nf1和nf2)通过血液测试(cbc、lft、rft和d-dimers)进行检查，标准药物纳米配方、nf1和nf2显示出最佳效果。
[0163]
对照组、阴性对照组和治疗组的生化标志物水平：
[0164]
该研究比较了各种纳米药物对治疗组血液参数的影响，并与对照组和阴性对照组进行比较，如图18所示，具体分析如下。
[0165]
治疗组的平均wbcs水平明显接近于对照组(p《0.047)。与其他治疗组相比，有效的纳米药物是adehyde-cqd、标准药物纳米制剂、a.indica提取物、nf1和nf2组。
[0166]
治疗组的平均血红蛋白水平、总rbcs和pvc计数明显高于对照组和阴性对照组。醛-cqd和标准药物纳米制剂是最有效的纳米医学药物。
[0167]
治疗组的平均mcv计数与对照组相似，其中cqd-醛、标准药物纳米制剂、nf1和nf2最有效。
[0168]
治疗组的平均血小板计数与对照组和阴性对照组相似，纳米载体和nf1是最有效的纳米医学药物。
[0169]
治疗组的中性粒细胞和淋巴细胞水平与对照组和阴性对照组相似，nf1和nf2是最有效的纳米医学药物。
[0170]
治疗组的平均单核细胞数和嗜酸性粒细胞数高于对照组和阴性对照组，其中oh-cqd、提取物组、nf1和nf2是最有效的纳米药物。
[0171]
在图19中，阴性对照组的alt很高，而两组的ast和alp水平都很低。治疗药物的有效性被证明了，因为所有的治疗都更接近于对照组，标准药物纳米制剂、nf1和nf2显示出最好的效果。
[0172]
在图20中，阴性对照组的总蛋白、白蛋白和球蛋白比对照组高，而白蛋白在这些组中较低。
[0173]
与对照组相比，阴性对照组的尿素和肌酐水平更高。所有的治疗都更接近于对照组，显示了治疗药物的有效性。
[0174]
总的来说，所有的纳米药物在rft谱系中显示出最佳效果。
[0175]
图21显示了研究组中所有大鼠的组织学切片，显示了aml的存在。在健康大鼠中(图21a)，血细胞，特别是白细胞和红细胞，都在正常范围内。另一方面，阴性对照组(图21b)有高水平的异常白细胞和较少的中性粒细胞。然而，所有治疗组都显示出较少的异常wbc和较多的中性粒细胞，明显优于阴性对照组。
[0176]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物，其特征在于，所述化合物为由cqd纳米材料与植物化学物质形成的衍生物cqds，所述植物化学物质为楝树甲醇提取物，所述化合物包括以下任意一种：（a）酚类共轭cqds，由cqd纳米材料与楝树甲醇提取物合成，记为oh-cqds；（b）nf 1，由（a）与兔多克隆cd33合成，记为cd33-oh-cqds；（c）醛类共轭cqds，由cqd纳米材料与氧化后具有醛基的楝树甲醇提取物合成，记为醛-cqds，所述具有醛基的氧化苦楝树甲醇提取物是指苦楝树甲醇提取物通过转移氧或去除电子而得到的产物；（d）nf 2，由（c）与兔多克隆cd33合成，记为cd33-醛-cqds。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，制备所述楝树甲醇提取物的方法具体包括：将50g 干楝树叶粉与500ml 甲醇混合，1周后过滤，冷凝干燥得到楝树甲醇提取物，在-20℃储存备用。3. 权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述cqd纳米材料的制备方法包括以下步骤：将0.57g l-半胱氨酸溶于10ml水中，向混合物中加入1.5g柠檬酸，通过2-8分钟微波加热溶解 cqd 纳米材料，冷却至室温，溶于10ml去离子水中，得到棕色溶液，经离心过滤后用乙酸乙酯提取cqd溶液。4.一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物为如权利要求1所述的（a），所述方法包括以下步骤：将印楝树的甲醇提取物悬浮于含有50mg/ml n，n
’‑
羰基二咪唑的四氢呋喃悬浮液中，并在室温下混合2小时，得到用四氢呋喃洗涤的活性颗粒；以10mg/ml 的浓度重悬于冷偶联缓冲液 i 中，并用冰水洗涤，偶联缓冲液 i 为0.1 m 碳酸，ph = 9.5；通过在4℃下搅拌至少18小时获得含有胺的cqd 纳米材料。5.一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物为如权利要求1所述的化合物（b），所述方法为，以1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳二亚胺edc为交联剂，使用碳二亚胺法将酚类共轭cqds与兔多克隆cd33相连。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：10 mg oh-cqds置于10 ml耦合缓冲液ⅱ中，并用1m naoh调节至ph 8；50 μl兔多克隆cd33置于10 ml偶联缓冲液中；两种溶液充分混合，按edc与cqd的质量比为1:1加入edc以激活cqd的羧基，用1m hcl调节至ph 6.4；将反应混合物在37℃的黑暗环境中培养2小时，以100 rpm的速度持续摇动，经离心、洗涤后得化合物（b）；所述耦合缓冲液ⅱ为50 mm磷酸钠。7.一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物为如权利要求1所述的（c），所述方法包括以下步骤：将含有醛基的印楝氧化甲醇提取物悬浮于缓冲液 iii 中，浓度为1-10mg/ml，其中缓冲液 iii 由0.05 m 碳酸和0.1 m柠檬酸钠组成，ph 值为8-10；将 cqd 纳米材料在缓冲溶液 iii 中以醛基氧化苦楝树甲醇提取物与 cqd 纳米材料按1:4摩尔比溶解，得到共轭溶液；
在每毫升共轭溶液中加入10毫升含有5m 氰化钠硼氢化物的1m 氢氧化钠溶液，旋转2小时，中断，再旋转30分钟,化合物(c)通过透析纯化并在4℃保存。8.一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物为如权利要求1所述的（d），所述方法为，以1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳二亚胺edc为交联剂，使用碳二亚胺法将醛类共轭cqds与兔多克隆cd33相连。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在10 ml耦合缓冲液ⅱ中加入10 mg醛-cqds，用1m naoh调节至ph8；在10 ml耦合缓冲液ⅱ中加入50 μl cd33，用1m naoh调节至ph8；两种溶液充分混合，按照cqds 与edc的质量比为1:1加入edc，用1m hcl调节ph6.4以激活羧基；反应混合物在37℃的黑暗环境中培养2小时，以100 rpm的速度持续摇动，经离心、洗涤后得化合物（d）；所述耦合缓冲液ⅱ为50mm磷酸钠。10.根据权利要求1所述的化合物在制备急性髓系白血病靶向药物中的用途。

技术总结
本发明公开了一种用于急性髓系白血病靶向给药的热诊断碳量子点纳米化合物，由CQD纳米材料与楝树甲醇提取物形成的衍生物CQDs，所述化合物包括以下任意一种：（a）酚类共轭CQDs，由CQD纳米材料与楝树甲醇提取物合成，记为OH-CQDs；（b）NF 1，由（a）与兔多克隆CD33合成，记为CD33-OH-CQDs；（c）醛类共轭CQDs，由CQD纳米材料与氧化的楝树甲醇提取物合成，记为醛-CQDs；（d）NF 2，由（c）与兔多克隆CD33合成，记为CD33-醛-CQDs。本发明所设计的靶向CQDs与植物药物共轭，并与CD33抗体功能化，在治疗AML方面表现出良好的效果。我们设计的热诊断CQDs由于其体积小，是靶向药物输送的理想选择。是靶向药物输送的理想选择。是靶向药物输送的理想选择。


技术研发人员：玛德哈
受保护的技术使用者：仲景中医药产业研究院
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/23