一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用

1.本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用。


背景技术：

2.跨膜蛋白是指一种贯穿生物膜两端的蛋白。细胞可通过跨膜蛋白感知周围环境，以对细胞外环境做出应答反应，实现信号转导，从而调控细胞的状态。跨膜蛋白参与到了包括细胞增殖、细胞分化、细胞生存、凋亡、血管生成和肿瘤等多种重要的生理及病理进程中。许多疾病都与跨膜蛋白的功能异常有关，如胰岛素受体功能异常导致的糖尿病，人表皮生长因子受体-2(her2受体)异常导致肿瘤的发生等。
3.跨膜蛋白的功能使其成为许多药物作用的靶点，如目前约30％的药物靶点都为g蛋白偶联受体(gprotein-coupledreceptors，gpcr)。由于跨膜蛋白是一种跨越整个生物膜一次或多次的蛋白，其跨膜区具有较强的疏水性，因此跨膜蛋白在水中会聚集并形成沉淀。因此，在体外跨膜蛋白需要维持脂双层膜或类脂环境才可以保持其活性。
4.目前对于跨膜蛋白的体外制备，通常是直接将整个抗原一起表达，并利用去污剂进行纯化，存在表达量低、提取困难、均一性差、难以定点标记的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用，所述制备方法可以实现对跨膜蛋白的定点标记，提高跨膜蛋白的表达量。
6.本发明提供了一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，包括如下步骤：
7.在编码跨膜蛋白的跨膜区的基因片段中引入半胱氨酸突变，得到含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段；
8.将所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段进行表达，得到含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段；
9.将标记化合物与所述含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段上的半胱氨酸突变位点偶联，得到含定点标记位点的跨膜区。
10.优选的，所述跨膜蛋白包括含胞外域和跨膜区的跨膜蛋白。
11.本发明还提供了一种含定点标记位点的跨膜区，采用上述技术方案所述的制备方法制备得到。
12.本发明还提供了一种含定点标记位点的跨膜区纳米盘，所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘包括上述技术方案所述的含定点标记位点的跨膜区和纳米盘；所述纳米盘包裹或插入所述含定点标记位点的跨膜区。
13.优选的，所述纳米盘包括磷脂纳米盘。
14.本发明还提供了一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘，包括上述技术方案所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘和胞外域。
15.本发明还提供了上述技术方案所述的定点标记跨膜蛋白纳米盘的制备方法，将所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘的氨基端与胞外域的羧基端进行连接，得到所述可定点标记的跨膜蛋白纳米盘。
16.优选的，所述连接的方式包括酶连反应或肽链连接。
17.优选的，所述酶连反应使用的酶包括sortase酶或butelase酶。
18.本发明还提供了上述技术方案所述的含定点标记位点的跨膜区、含定点标记位点的跨膜区纳米盘、定点标记的跨膜蛋白纳米盘或所述的制备方法制备得到定点标记的跨膜蛋白纳米盘在抗体的筛选和/或验证中的应用。
19.有益效果：
20.本发明提供了一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，所述制备方法通过在跨膜蛋白的跨膜区(tmd)中引入半胱氨酸突变后与标记化合物进行偶联实现跨膜蛋白跨膜区的定点标记，得到含定点标记位点的跨膜区。
21.进一步的，本发明通过将所述含定点标记位点的跨膜区和胞外域(ecd)，分别进行表达，并将tmd和ecd连接后置于最接近生理环境的纳米盘中，得到含定点标记的跨膜蛋白纳米盘，与传统直接将整个抗原一起表达，并利用去污剂进行纯化的跨膜蛋白制备方法相比，本发明所述制备方法在实现对跨膜蛋白定点标记的同时，还可以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
23.图1为实施例1中hcd137 tmd的制备液相色谱纯化峰图；
24.图2为实施例1中引入半胱氨酸的hcd137 tmd的sds-page胶和质谱检测结果图；
25.图3为实施例2中proxyl-tmd的制备液相色谱纯化峰图；
26.图4为实施例2中proxyl-tmd的质谱检测结果图；
27.图5为实施例3中msp蛋白的sds-page胶检测结果；
28.图6为实施例3中含定点标记的proxyl-tmd纳米盘的sds-page胶检测结果；
29.图7为实施例4中hcd137 ecd的sds-page胶检测结果；
30.图8为实施例5中sortase a酶的sds-page胶检测结果；
31.图9为实施例5中含hcd137 ecd-tm的纳米盘的sds-page胶检测结果；
32.图10为实施例5中用含三氟甲基的化合物标记的hcd137 ecd-tm的纳米盘的
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f-nmr结果；
33.图11为应用例1中anti-hcd137纳米抗体的sds-page胶检测结果；
34.图12应用例1中与纳米抗体结合后的含hcd137跨膜抗原纳米盘的fplc和sds-page胶检测结果图；
35.图13为实施例6中proxyl-hher2 tmd的峰图；
36.图14为实施例6中proxyl-hher2 tmd纳米盘的sds-page胶检测结果；
37.图15为实施例6中hher2 ecd的sds-page胶检测结果；
38.图16为实施例6中hher2 ecd-tm纳米盘的sds-page胶检测结果；
39.图17为应用例2中anti-hher2纳米抗体的sds-page胶检测结果；
40.图18为应用例2中与纳米抗体结合后的含hher2跨膜抗原纳米盘的fplc和sds-page胶检测结果图。
具体实施方式
41.本发明提供了一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，包括如下步骤：
42.在编码跨膜蛋白的跨膜区的基因片段中引入半胱氨酸突变，得到含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段；
43.将所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段进行表达，得到含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段；
44.将标记化合物与所述含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段上的半胱氨酸突变位点偶联，得到含定点标记位点的跨膜区。
45.在本发明中，所述跨膜蛋白优选包括但不限于含胞外域与跨膜区的跨膜蛋白，进一步优选包括cd137或her2，更优选包括hcd137或hher2。本发明优选以hcd137或hher2为例对本发明的制备方法进行具体优选和限定，但不能仅仅将其认定为本发明的全部保护范围。
46.本发明在编码跨膜蛋白的跨膜区的基因片段中引入半胱氨酸突变，得到所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段。本发明所述引入半胱氨酸突变的方式优选包括在编码跨膜蛋白的跨膜区的基因片段的任意位置插入半胱氨酸的密码子。
47.得到所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段后，本发明将编码所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段进行表达，得到含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段。本发明在进行所述表达前，优选还包括按照宿主的密码子偏好性对编码所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段进行密码子优化，以使所述跨膜蛋白的高效表达。
48.本发明对所述表达的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，如原核表达或真核表达。在本发明的一个实施例中，将编码所述引入半胱氨酸突变的hcd137的跨膜区的基因片段亚克隆至质粒中进行所述表达；所述表达的方式优选为原核表达；使用的宿主优选为大肠杆菌，质粒优选包括pmm-lr6。如在本发明的一个实施例中，引入半胱氨酸突变的hcd137的跨膜区的氨基酸序列优选如seq id no.1所示，具体为：ciisfflaltsta llfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqp，所述半胱氨酸突变位于所述hcd137的跨膜区的氨基端点处；在本发明的另外一个实施例中，引入半胱氨酸突变的hher2的跨膜区的氨基酸序列优选如seq id no.2所示，具体为：cpaeqraspltsiisavvgillvvvlgvvfgilik rrqqkirkytlrrllqetelvepltpsg，所述半胱氨酸突变优选位于所述hher2的第642氨基酸处。
49.得到所述含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段后，本发明将标记化合物与所述含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段上的半胱氨酸位点进行偶联，得到含定点标记位点的跨膜区。本发明所述标记化合物优选包括与半胱氨酸进行特异性反应的一类标记化合物，更优选为自由基标签、染料或
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f-标签，如含马来酰亚胺反应基团的自由基标签、cy3或cy5染料、含苯砜基取代基团的
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f-化学标签；所述特异性反应优选包括迈克尔加成、巯基取代或巯基环化。本发明对所述自由基标签、染料和
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f-标签的具体类型没有特殊限定，任意类型
的上述标记化合物均可以用于本发明。本发明对所述偶联方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的偶联方式即可，如在本发明中的一个实施例中，本发明优选将所述hcd137的跨膜区上半胱氨酸位点与3-马来酰亚胺-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-1-氧自由基(3-maleimido-proxyl)进行偶联，具体为：将粉末状的含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段溶解于hepes反应缓冲液后，与tcep和3-maleimido-proxyl进行偶联反应，得到含有proxyl定点标记的hcd137的跨膜区。本发明所述粉末状的含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段、tcep和3-maleimido-proxyl在hepes反应缓冲液中的摩尔浓度比优选为1：2：2。
50.本发明还提供了一种含定点标记位点的跨膜区，采用上述技术方案所述的制备方法制备得到。本发明通过在跨膜蛋白的跨膜区中引入半胱氨酸突变后与标记化合物进行偶联实现跨膜蛋白跨膜区的定点标记。
51.本发明还提供了一种含定点标记位点的跨膜区纳米盘，所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘包括上述技术方案所述的含定点标记位点的跨膜区和纳米盘；所述纳米盘包裹或插入所述含定点标记位点的跨膜区。
52.本发明所述含定点标记的跨膜区纳米盘优选通过将所述含定点标记位点的跨膜区与纳米盘结合得到。本发明所述纳米盘优选包括磷脂纳米盘，进一步优选包括膜支架纳米盘(msp纳米盘)、多肽支架纳米盘或合成纳米盘，更优选为膜支架纳米盘。
53.本发明优选通过原核表达或真核表达的方式制备所述纳米盘。本发明进行所述原核表达或真核表达前，优选还包括对纳米盘的基因序列进行密码子优化，使纳米盘高效表达。本发明对所述原核表达或真核表达的具体步骤没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的步骤即可。本发明进行所述原核表达或真核表达时，优选包括在所述纳米盘的羧基末端引入纯化标签，用于纳米盘的纯化。本发明对所述纯化的具体过程没有特殊限定，本领域技术人员可根据对应的跨膜蛋白进行常规调整。在本发明的一个实施例中，优选使用的是msp纳米盘，且在所述msp纳米盘的羧基末端引入strep标签，引入所述strep标签后的msp纳米盘的氨基酸序列优选如seq id no.3所示，具体为：mgsstfsklreqlgpvtqefwdnleketegl rqemskdleevkakvqpylddfqkkwqeemelyrqkveplraelqegarqklhelqek lsplgeemrdrarahvdalrthlapysdelrqrlaarlealkenggarlaeyhakateh lstlsekakpaledlrqgllpvlesfkvsflsaleeytkklntqggggsssawshpqfe。在本发明所述的实施例中，优选采用原核表达的方式制备所述msp纳米盘，使用的宿主优选为大肠杆菌，质粒优选包括pet-28b(+)。在本发明所述的实施例中，优选采用streptactin亲和柱对得到的msp纳米盘进行纯化，得到纯化的msp纳米盘。
54.得到所述纯化的纳米盘后，本发明优选将所述含定点标记位点的跨膜区通过bicelle重构的方式与所述纯化的msp纳米盘结合，得到含定点标记的跨膜区纳米盘。在本发明的一个实施例中，将所述含有proxyl定点标记的hcd137的跨膜区与纯化的msp纳米盘进行结合的具体步骤优选包括：将粉末状的含有proxyl定点标记的hcd137的跨膜区溶解于尿素后，与dmpc和dhpc混合，将得到的混合物在n2环境下吹干后真空冷冻，得到粉末状混合物；以尿素缓冲液对所述粉末状混合物溶解，得到尿素溶液；以hepes buffer将所述尿素溶液中的尿素透析出去进行bicelle重构后，将得到的双胞体与所述纯化的msp纳米盘混合后，继续透析，得到含有proxyl定点标记的hcd137跨膜区的纳米盘。本发明所述实施例中，所述含有proxyl定点标记的hcd137的跨膜区、dmpc和dhpc的浓度比优选为1:35:140。本发
明所述尿素缓冲液优选包括如下浓度的组分：8m尿素，20mm hepes和75mm nacl；所述尿素缓冲液的ph值优选为7.4。本发明所述hepes buffer优选包括如下浓度的组分：20mm hepes和75mm nacl，ph值优选为7.4。本发明所述透析用的透析袋的截留分子量优选为3kda。
55.本发明还提供了一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘，包括上述技术方案所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘和胞外域。
56.本发明还提供了上述技术方案所述的定点标记的跨膜蛋白纳米盘的制备方法，包括：将所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘的氨基端与胞外域的羧基端进行连接，得到所述可定点标记的跨膜蛋白纳米盘。
57.本发明优选制备所述胞外域肽段；具体优选包括：将编码胞外域肽段的基因片段进行表达，得到胞外域肽段。本发明所述表达的方式优选包括原核表达或真核表达，更优选为真核表达。本发明在进行所述表达前，优选还包括对编码胞外域肽段的基因片段进行密码子优化，使胞外域肽段高效表达。本发明在进行所述表达时，优选在胞外域肽段的氨基端引入纯化标签，进而对胞外域肽段进行纯化。在本发明的一个实施例中，优选通过将编码hcd137的胞外域肽段的基因片段进行密码子优化后亚克隆至pcdna3.4(+)质粒，将得到的表达载体进行瞬时转染，得到hcd137的胞外域肽段。本发明所述hcd137的胞外域肽段上优选包括his标签，具体氨基酸序列优选如seq id no.4所示，具体为：hhhhhhlqdpcsncpagtfc dnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagc smceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvc gpspadlspgassvtppaparepghspq。
58.得到所述胞外域肽段后，本发明将所述含定点标记的跨膜区纳米盘与胞外域肽段进行连接，得到可定点标记的跨膜蛋白纳米盘。本发明所述连接的方式优选包括酶连反应或肽链连接；所述酶连反应优选为酶介导的肽链连接反应，所述肽链连接优选为化学小分子介导的肽链连接；所述酶连反应使用的酶优选包括sortase酶或butelase酶，更优选为sortase a酶。本发明对所述酶连反应的具体步骤没有特殊限定，依据跨膜蛋白和使用的酶进行常规调整即可。
59.当以酶连反应进行所述连接时，本发明优选还包括分别于跨膜蛋白的跨膜区的氨基端和胞外域的羧基端分别引入酶连接位点。如在本发明的一个实施例中，优选在hcd137的跨膜区的氨基端引入sortase a酶的酶连接位点g，在hcd137的胞外域的羧基端引入sortase a酶的酶连接位点lpetgg。本发明优选还包括在所述sortase a酶的羧基末端添加his标签用于蛋白纯化，添加his标签后的氨基酸序列优选如seq id no.5所示，具体为：mqakpqi pkdkskvagyieipdadikepvypgpatreqlnrgvsfaeeneslddqnisiaghtfidrpny qftnlkaakkgsmvyfkvgnetrkykmtsirnvkptavevldeqkgkdkqltlitcddy neetgvwetrkifvatevklehhhhhh。
60.本发明所述实施例中的酶连反应的具体步骤优选为：将含有proxyl定点标记的hcd137跨膜区的纳米盘、hcd137的胞外域肽段和sortase a酶混合，得到的混合物进行酶连反应，得到含有proxyl定点标记的hcd137纳米盘。本发明所述含有proxyl定点标记的hcd137跨膜区的纳米盘和hcd137的胞外域肽段的摩尔比优选为1～4:1～8，更优选为1:8、1:4、1:2、4:1、3:1或2:1。本发明所述酶连反应的温度优选为室温，时间优选为4小时。本发明所述sor tase a酶的终浓度优选为2.5μm。
61.本发明通过将所述含定点标记位点的跨膜区和胞外域(ecd)，分别进行表达，并将
tmd和ecd连接后置于最接近生理环境的纳米盘中，得到含定点标记的跨膜蛋白纳米盘，与传统直接将整个抗原一起表达，并利用去污剂进行纯化的跨膜蛋白制备方法相比，本发明所述制备方法在实现对跨膜蛋白定点标记的同时，还可以提高跨膜蛋白的表达量且相对更易提取。
62.基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的可定点标记的跨膜蛋白纳米盘在抗体筛选和/或验证中的应用，更优选为抗体筛选和验证。
63.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
64.实施例1跨膜蛋白跨膜区(tmd)的表达与纯化
65.为了定点标记跨膜抗原，在tmd任意位置中引入半胱氨酸突变用于定点偶联，同时在tmd氨基端添加酶连反应位点(如sortase a酶连接位点g)，将其基因序列优化为大肠杆菌偏爱的密码子，然后亚克隆至表达质粒中。
66.以hcd137 tmd为例，其含有sortase a酶连接位点g和半胱氨酸突变的跨膜区氨基酸序列为：gciisfflaltstallfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqp(seq id no.6)，编码seq id no.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为5
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ggctgtattatatcatttttcctggc gctgacctccaccgctctgctgttcctcttgtttttcttgacgctgcgttttagcgttgt gaagcgcggtcgtaaaaagctgttatacatctttaaacagccg-3’(seq id no.7)，将seq id no.1所示的核苷酸序列插入到pmm-lr6的hind iii和bamh i酶切位点之间，得到hcd137 tmd表达载体。
67.取1μl构建好的hcd137 tmd表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)中，挑取转化后的bl21(de3)单克隆至lb培养基中(含100μg/ml卡那霉素)，37℃培养至od
600
＝0.6～0.8，加入iptg诱导表达，18℃继续培养18小时。离心收集表达后的菌体沉淀，并重悬于tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph 7.4)中。利用超声破碎细菌，12000rpm离心30min，弃掉上清。沉淀用盐酸胍缓冲液(6m盐酸胍，50mm tris，200mmnacl，ph值为8.0)重悬，磁力搅拌过夜。第二天12000rpm离心30min收集上清。用his标签亲和柱纯化上清中的跨膜区融合蛋白，上清过柱后分别用盐酸胍缓冲液(6m盐酸胍，50mm tris，200mm nacl，ph值8.0)、尿素缓冲液(8m尿素)和去离子水洗涤柱子，用90％甲酸洗脱结合在柱子上的跨膜区融合蛋白。加入cnbr后混匀，通入n2，通过cnbr将trple和tmd分离，之后用去离子水将cnbr透析出去。将其真空冻干后，加入1ml dmso和0.5ml 90％甲酸溶解，用0.8μm尼龙滤膜过滤，利用跨膜区肽段的疏水性，通过高效液相色谱(venusil xbp c18(2))进一步分离纯化跨膜区肽段。分离过程通过梯度洗脱实现，缓冲液a为含0.1％tfa的去离子水，缓冲液b为含0.1％tfa的30％乙腈和70％异丙醇，35％-100％的缓冲液b进行梯度洗脱，trple、trple-tmd和tmd先后出峰，如图1所示；将收集含tmd的管，真空冷冻，获得引入半胱氨酸的hcd137 tmd粉末，记为cys-tmd粉末，并用sds-page胶与质谱对其纯度与分子量进行表征，结果如图2所示。
68.由图2可以得出：sds-page胶上可以看到样品中的主要成分为tmd；从质谱结果看，其分子量与理论分子量几乎一致，为本实施例的目的产物。
69.实施例2：跨膜区的定点偶联
70.以引入半胱氨酸的hcd137 tmd连接3-马来酰亚胺-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-1-氧自由基(3-maleimido-proxyl)为例，将实施例1中制备得到的cys-tmd粉末溶解于hepes反应缓冲液中，加入1～2倍摩尔比过量的tcep和3-maleimido-proxyl，具体cys-tmd、tcep和
[3-maleimido-proxyl]的摩尔浓度比为1:2:2，混匀后室温反应4小时。用n2吹干，按实施例1中的高效液相色谱纯化方法纯化连接后的proxyl-tmd。未连接的proxyl和proxyl-tmd先后出峰，如图3所示，收集proxyl-tmd，真空冷冻，获得proxyl-tmd粉末。
[0071]
通过质谱表征引入半胱氨酸的hcd137 tmd与3-maleimido-proxyl的连接效率和连接纯度，结果如图4所示。
[0072]
由图4可以得出：产物分子量与hcd137 tmd-proxyl分子量一致，表明是本实施例中的产物峰，且连接效率为100％。
[0073]
实施例3：含定点标记的受体跨膜区纳米盘的制备
[0074]
在膜骨架蛋白(membrane scaffold protein,msp)msp的羧基末端引入strep标签用于蛋白纯化。引入strep标签的msp的氨基酸序列如seq id no.3所示，具体为：mgsstfs klreqlgpvtqefwdnleketeglrqemskdleevkakvqpylddfqkkwqeemelyrqkveplraelqegarqklhelqeklsplgeemrdrarahvdalrthlapysdelrqrlaarlealkenggarlaeyhakatehlstlsekakpaledlrqgllpvlesfkvsflsaleeytkklntqggggsssawshpqfek。
[0075]
将msp的基因序列优化为大肠杆菌偏爱密码子，优化后的核苷酸序列如seq id no.8所示，具体为5
’‑
atgggcagcagcacctttagcaaactgcgtgaacagctgggcccggt gacccaggaattttgggataacctggaaaaagaaaccgaaggcctgcgtcaggaaatgagcaaagatctggaagaggtgaaagcgaaagtgcagccgtatctggatgactttcagaaaaaatggcaggaagagatggaactgtatcgtcagaaagtggaaccgctgcgtgcggaactgcaggaaggcgcgcgtcagaaactgcatgaactgcaggaaaaactgagcccgctgggcgaagagatgcgtgatcgtgcgcgtgcgcatgtggatgcgctgcgtacccatctggcgccgtatagcgatgaactgcgtcagcgtctggcggcccgtctggaagcgctgaaagaaaacggcggtgcgcgtctggcggaatatcatgcgaaagcgaccgaacatctgagcaccctgagcgaaaaagcgaaaccggcgctggaagatctgcgtcagggcctgctgccggtgctggaaagctttaaagtgagctttctgagcgcgctggaagagtataccaaaaaactgaacacccagggcggcggcggcagcagcagcgcgtggtcgcatccacagttcgagaaataa-3’，然后亚克隆至pet-28b(+)质粒中，插入nco i和sac i酶切位点之间，得到msp表达载体。
[0076]
取1μl构建好的msp表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)中，挑取转化后的bl21(de3)单克隆至lb培养基中(含100μg/ml卡那霉素)，37℃培养至od
600
＝0.6～0.8，加入在终浓度为0.15mm的iptg诱导表达，37℃继续培养4小时。离心收集表达后的菌体沉淀，并重悬于tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph值为7.4)中。利用超声破碎细菌，12000rpm离心30min，收集上清。用streptactin亲和柱纯化上清中的msp，上清过柱后分别用tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph值为7.4)、hepes缓冲液(20mm hepes，75mm nacl，ph值为7.4)洗掉杂蛋白，用含2.5mm脱硫生物素的hepes缓冲液(20mm hepes，75mmnacl，ph值为7.4)将结合在柱子上的msp蛋白洗脱下来，获得msp蛋白，结果如图5所示。
[0077]
由图5可以得出：在泳道7和泳道8中可以得到仅含msp蛋白的条带，说明获得的msp蛋白的纯度较高。
[0078]
将实施例2中得到冻干好的proxyl-tmd粉末溶解于尿素中，加入dmpc和dhpc，tmd:dmpc:dhpc的摩尔浓度比为1：35:140，n2吹干后真空冷冻过夜。第二天用尿素缓冲液(8m urea，20mm hepes，75mmnacl，ph 7.4)溶解，用hepes buffer(20mm hepes，75mmnacl，ph值为7.4)将尿素透析出去进行bicelle重构，然后在bicelle中加入msp蛋白继续透析，最终制备含定点标记的proxyl-tmd纳米盘，如图6所示。
[0079]
实施例4：受体胞外域ecd的制备
[0080]
在ecd的氨基端和信号肽之间添加his标签用于蛋白纯化，在ecd的羧基末端引入酶连位点(如sortase a酶连位点lpetgg)。添加有his标签和sortase a酶连位点的hcd137ecd的氨基酸序列如seq id no.9所示，具体为：hhhhhhlqdpcsncpagtfcdnn rnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmc eqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgps padlspgassvtppaparepghspqlpetgg。
[0081]
将hcd137 ecd的基因序列优化为hek 293偏爱的密码子，具体如seq id no.10所示，具体为5
’‑
caccaccaccaccaccacctgcaggacccctgctctaactgtcctgccgg caccttctgcgataacaatcggaaccagatctgctccccatgtccccctaattcttttagctccgccggcggccagaggacatgcgatatctgtcgccagtgcaagggcgtgttccggaccagaaaggagtgttctagcacaagcaacgccgagtgcgactgtacccctggatttcactgcctgggagcaggatgttccatgtgcgagcaggattgtaagcagggccaggagctgaccaagaagggctgcaaggactgctgtttcggcaccttcaacgatcagaagcggggcatctgtagaccatggaccaactgcagcctggacggcaagtccgtgctggtgaatggcacaaaggagagggacgtggtgtgcggaccttctccagcagatctgagcccaggagcatcctctgtgacaccaccagcaccagcaagagagcctggacactccccacagctgcctgagacaggcggc-3’，然后亚克隆至pcdna3.4(+)质粒中，插入ecor i和hind iii酶切位点之间，得到hcd137 ecd表达载体。
[0082]
构建好的hcd137 ecd表达载体转染至hek 293f细胞中。将hek 293f培养至活率≥95％时即可转染，将其传代至1
×
106个/ml，按照每1
×
106个细胞对应1μg质粒和3μg的pei，取相应的质粒和pei加入opti-mem中，混匀后室温静置20min，将其缓慢滴加至含细胞培养液中，放入培养箱中培养7天。第7天离心收集培养上清，用his标签亲和柱纯化上清中的ecd。上清过柱后，分别用含0mm，30mm，50mm咪唑的tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，10μm tcep，ph值为7.4)洗涤柱子至杂蛋白不再流出(收集流穿液并用uv检测流穿液的a280吸收，直至a280稳定于某个数值附近)。用含250mm和500mm咪唑的tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，10μm tcep，ph值为7.4)洗脱结合在柱子上的ecd，最终获得纯度较高的hcd137 ecd，结果如图7所示。
[0083]
实施例5：含定点标记的跨膜全长受体hcd137纳米盘制备
[0084]
在sortase a的羧基末端添加his标签用于蛋白纯化。带有his标签的sortase a的氨基酸序列如seq id no.5所示，具体为：mqakpqipkdkskvagyieipdadikepvypgpat reqlnrgvsfaeeneslddqnisiaghtfidrpnyqftnlkaakkgsmvyfkvgnetrkyk mtsirnvkptavevldeqkgkdkqltlitcddyneetgvwetrkifvatevklehhhhhh。
[0085]
将sortase a的基因序列优化为大肠杆菌偏爱的密码子，具体如seq id no.11所示，具体为5
’‑
atgcaagctaaacctcaaattccgaaagataaatcaaaagtggcaggctatat tgaaattccagatgctgatattaaagaaccagtatatccaggaccagcaacacgcgaacaattaaatagaggtgtaagctttgcagaagaaaatgaatcactagatgatcaaaatatttcaattgcaggacacactttcattgaccgtccgaactatcaatttacaaatcttaaagcagccaaaaaaggtagtatggtgtactttaaagttggtaatgaaacacgtaagtataaaatgacaagtataagaaacgttaagccaacagctgtagaagttctagatgaacaaaaaggtaaagataaacaattaacattaattacttgtgatgattacaatgaagagacaggcgtttgggaaacacgtaaaatctttgtagctacagaagtcaaactcgagcaccaccaccaccaccac-3’，然后亚克隆至pet-28b(+)质粒中，插入nco i和xho i酶切位点之间，得到sortase a表达载体。
[0086]
取1μl构建好的sortase a表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)中，挑取转化后的bl21(de3)单克隆至lb培养基中(含100μg/ml卡那霉素)，37℃培养至od
600
＝0.6～0.8，加入在终浓度为1mm的iptg诱导表达，18℃继续培养18小时。离心收集表达后的菌体沉淀，并重悬于tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mm nacl，ph值为7.4)中。利用超声破碎细菌，12000rpm离心30min，收集上清。用his标签亲和柱纯化上清中的sortase a，上清过柱后，分别用含0mm,30mm，50mm咪唑的tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mm nacl，ph值为7.4)洗涤柱子至杂蛋白不再流出(收集流穿液并用uv检测流穿液的a280吸收，直至a280稳定于某个数值附近)。用含250mm和500mm咪唑的tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mm nacl，ph值7.4)洗脱结合在柱子上的sortase a，最终获得纯度较高的sortase a酶，如图8所示。
[0087]
hcd137 ecd羧基末端具有lpetgg，tmd氨基端具有g，因此可以通过sortase酶进行酶连。按1:4的摩尔浓度比混匀hcd137 ecd和含tmd的纳米盘，加入sortase酶后混匀，室温反应4小时。由于ecd具有his标签，而含tmd的纳米盘中没有，因此可以通过his-tag pulldown拿到连接好的hcd137 ecd-tm，从而除去未连接的含tmd的纳米盘。
[0088]
用his标签亲和柱纯化酶连后的产物，产物过柱后分别用hepes buffer(20mm hepes，75mm nacl，10μm tcep，ph值为7.4)，50mm咪唑洗去未连接上ecd的纳米盘，用500mm咪唑洗脱结合在柱子上的ecd-tm纳米盘，最终获得纯度较高的含hcd137 ecd-tm的纳米盘，如图9所示。
[0089]
为了证明该方法可应用于多种化学标签的定点偶联，本发明用类似方法连接了含三氟甲基的化合物，并进行了bicelle和纳米盘构建，最后利用
19
f-溶液核磁检测
19
f定点标记的hcd137跨膜抗原纳米盘，如图10所示。
[0090]
应用例1：含定点标记的跨膜抗原hcd137的功能验证
[0091]
制备抗-hcd137的纳米抗体，具体步骤如下：
[0092]
在纳米抗体的氨基末端添加his标签和tev酶切位点，用于蛋白纯化。序列如seq id no.5所示，具体为：mhhhhhhenlyfqsevqllesgggevqpggslrlscaasgfsfsinamgwyrqapgkrre fvaaiesgrntvyaesvkgrftisrdnakntvylqmsslraedtavyycgllkgnrvvsp svaywgqgtlvtvkp。
[0093]
将抗hcd137的纳米抗体基因序列优化为大肠杆菌偏爱的密码子，具体如seq id no.12所示，具体为5
’‑
atgcaccaccaccaccaccacgaaaacctgtactttcagagcgaggtgcaactgctggaaagcggtggcggtgaggttcaaccgggcggtagcctgcgtctgagctgcgcggcgagcggtttcagctttagcatcaacgcgatgggctggtatcgtcaagcgccgggcaagcgtcgtgaattcgtggcggcgatcgagagcggccgtaacaccgtgtacgcggaaagcgttaagggtcgttttaccattagccgtgacaacgcgaaaaacaccgtgtatctgcagatgagcagcctgcgtgcggaggataccgcggtttactattgcggcctgctgaagggtaaccgtgtggttagcccgagcgttgcgtactggggccaaggtaccctggtgaccgttaaaccg-3’。然后亚克隆至pet-28b(+)质粒中，插入nco i和xho i酶切位点之间，得到抗hcd137纳米抗体的表达载体。
[0094]
取1μl构建好的抗hcd137纳米抗体表达载体转化至大肠杆菌t7 shuffle中，挑取转化后的t7 shuffle单克隆至lb培养基中(含100μg/ml卡那霉素)，37℃培养至od
600
＝0.6～0.8，加入在终浓度为0.15mm的iptg诱导表达，37℃继续培养4小时。离心收集表达后的菌体沉淀，并重悬于tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph值为7.4)中。利用超声破碎细菌，12000rpm离心30min，收集上清。用his标签亲和柱纯化上清中的纳米抗体，上清过柱后，
分别用含0mm,30mm，50mm咪唑的tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph值为7.4)洗涤柱子至杂蛋白不再流出(收集流穿液并用uv检测流穿液的a280吸收，直至a280稳定于某个数值附近)。用含250mm和500mm咪唑的tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph值7.4)洗脱结合在柱子上的纳米抗体。将含纳米抗体的250mm和500mm咪唑洗脱液加入3kda透析袋中，放入3l tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph值7.4)中将咪唑透析出去。将纳米抗体浓缩后，按[纳米抗体]:[tev酶]＝20：1的比例加入tev酶，室温酶切2h。用his标签亲和柱进一步纯化纳米抗体。由于tev酶及未酶切的纳米抗体含有his标签，样品过柱后，tev酶及未酶切的纳米抗体会结合在亲和柱上，收集上样流穿液，用tris缓冲液(20mm tris-hcl，150mmnacl，ph值为7.4)进一步洗脱酶切后的纳米抗体，最终获得纯度较高的抗hcd137的纳米抗体，如图11所示。
[0095]
将上述纯化好的anti-hcd137纳米抗体按[anti-hcd137纳米抗体]:[ecd]＝2:1的摩尔浓度比加入到实施例5制备得到的含hcd137 ecd-tm的纳米盘中，混匀后室温孵育2小时。12000rpm离心3min，吸取上清利用快速蛋白液相色谱(superdex75 increase 10/300gl)检测含hcd137 ecd-tm纳米盘的生物学活性，所用缓冲液为20mm hepes，75mmnacl，10μmtcep，ph值为7.4，出峰顺序为与纳米抗体结合后的含hcd137跨膜抗原纳米盘、msp、未连接跨膜区的ecd和未结合的纳米抗体，如图12所示。
[0096]
由图12可以得出：anti-hcd137的纳米抗体能够与含hcd137 ecd-tm的纳米盘共洗脱，说明跨膜全长抗原hcd137纳米盘具有抗体结合功能。
[0097]
实施例6：含定点标记的跨膜受体hher2纳米盘制备
[0098]
实施例1～5中的制备定点标记跨膜蛋白纳米盘的方法同样适用于其他跨膜蛋白，此实施例以膜蛋白hher2为第二案例展示该膜蛋白纳米盘构建方法的可行性和普适性。
[0099]
1)按上述实施例1中的方法制备hher2 tmd，其其含有sortase a酶连接位点g和半胱氨酸突变的跨膜区的氨基酸序列如seq id no.13所示，具体为：gggggcpaeqraspl tsiisavvgillvvvlgvvfgilikrrqqkirkytlrrllqetelvepltpsga。
[0100]
2)按照实施例2中的方法将步骤1)中制备得到的hher2 tmd与3-maleimido-proxyl进行定点偶联，获得proxyl-hher2 tmd，如图13所示。
[0101]
3)按实施例3所述的方法制备含定点标记的proxyl-hher2 tmd纳米盘，结果如图14所示。
[0102]
4)按实施例4所述表达纯化hher2 ecd，如图15所示；带有his标签和sortase a酶连位点的hher2 ecd的氨基酸序列如seq id no.14所示，具体为：
[0103]
hhhhhhhhhhggggshqallhtanrpedecvgeglachqlcarghcwgpgptqcvncs
[0104]
qflrgqecveecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykd ppfcvarcpsgvkpdlsympiwkfpdeegacqpcpincthscvdlddkglpetgg。
[0105]
将得到的纯化hher2 ecd与proxyl-hher2 tmd纳米盘通过sortase a酶连法及his-tag纯化后续最终获得hher2 ecd-tm纳米盘，结果如图16所示。
[0106]
应用例2：含定点标记的跨膜抗原hher2的功能验证
[0107]
制备抗-hher2的纳米抗体，具体步骤如下：
[0108]
在纳米抗体的氨基末端添加his标签和tev酶切位点，用于蛋白纯化。序列如seq id no.15所示，具体为：mgsahhhhhhgggsgggsenlyfqsevqlvesggglvqaggslrl scaasgitfs
intmgwyrqapgkqrelvalissigdtyyadsvkgrftisrdnakntvylqm nslkpedtavyyckrfrtaaqgtdywgqgtlvtvssgsc。
[0109]
将抗-hher2的纳米抗体基因序列优化为酵母偏爱的密码子，如seq id no.16所示，具体为5
’‑
atgggatcagctcaccaccatcaccaccacggtggtggctcgggcgggggctcggagaacctgtatttccagagcgaggttcaactggtggagagtggtggcggcctggtgcaagcgggtggttccctgagactgagctgcgcggcgagcggcattacctttagcatcaacacgatgggttggtaccgccaggctccgggtaaacagcgtgaacttgtcgcactcatcagctccatcggcgacacctattacgcagactccgtgaagggtcgtttcaccattagccgtgacaacgcgaaaaataccgtttacctgcagatgaatagcttgaagccggaagatactgcggtttactactgcaaacgttttcgcaccgctgcccaaggtacggattattggggtcagggtacgttggttaccgtgagctctggttcttgttaa-3’。然后亚克隆至pet28b(+)质粒中，插入ncol i和xhol i酶切位点之间，得到抗-hher2纳米抗体的表达载体。按上述应用例1中的方法表达纯化获得纯度较高的抗-hher2的纳米抗体，如图17所示。
[0110]
将上述纯化好的抗-hher2纳米抗体按[抗-hher2纳米抗体]:[ecd]＝3:1的摩尔浓度比加入到实施例6制备得到的hher2 ecd-tm纳米盘中，混匀后室温孵育2小时。12000rpm离心3min，吸取上清利用快速蛋白液相色谱(superdex75 increase 10/300gl)检测hher2ecd-tm纳米盘的生物学活性，所用缓冲液为20mm hepes，75mm nacl，10μm tcep，ph值为7.4，出峰顺序为与纳米抗体结合后的hher2 ecd-tm纳米盘、msp、未连接跨膜区的ecd和未结合的纳米抗体，如图18所示。
[0111]
由图18可以得出：抗-hher2纳米抗体能够与hher2 ecd-tm纳米盘共洗脱，说明跨膜抗原hher2纳米盘具有抗体结合功能。
[0112]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在编码跨膜蛋白的跨膜区的基因片段中引入半胱氨酸突变，得到含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段；将所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段进行表达，得到含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段；将标记化合物与所述含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段上的半胱氨酸突变位点偶联，得到含定点标记位点的跨膜区。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述跨膜蛋白包括含胞外域和跨膜区的跨膜蛋白。3.一种含定点标记位点的跨膜区，其特征在于，采用权利要求1或2所述的制备方法制备得到。4.一种含定点标记位点的跨膜区纳米盘，其特征在于，所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘包括权利要求3所述的含定点标记位点的跨膜区和纳米盘；所述纳米盘包裹或插入所述含定点标记位点的跨膜区。5.根据权利要求4所述的含定点标记位点的跨膜区纳米盘，其特征在于，所述纳米盘包括磷脂纳米盘。6.一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘，其特征在于，包括权利要求4或5所述的含定点标记位点的跨膜区纳米盘和胞外域。7.权利要求6所述的定点标记的跨膜蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于，将所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘的氨基端与胞外域的羧基端进行连接，得到所述可定点标记的跨膜蛋白纳米盘。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述连接的方式包括酶连反应或肽链连接。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述酶连反应使用的酶包括sortase酶或butelase酶。10.权利要求3所述的含定点标记位点的跨膜区、权利要求4或5所述的含定点标记位点的跨膜区纳米盘、权利要求6所述的定点标记的跨膜蛋白纳米盘或权利要求7～9任一项所述的制备方法制备得到定点标记的跨膜蛋白纳米盘在抗体筛选和/或验证中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用。本发明所述含定点标记位点的跨膜区的制备方法通过在跨膜蛋白的跨膜区(TMD)中引入半胱氨酸突变后与标记化合物进行偶联，实现跨膜蛋白跨膜区的定点标记，得到含定点标记位点的跨膜区。进一步的，本发明通过将所述含定点标记位点的跨膜区和胞外域(ECD)分别进行表达，并将TMD和ECD连接后置于最接近生理环境的纳米盘中，得到含定点标记的跨膜蛋白纳米盘，与传统直接将整个抗原一起表达，并利用去污剂进行纯化的跨膜蛋白制备方法相比，本发明所述制备方法在实现对跨膜蛋白定点标记的同时，还可以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。


技术研发人员：曹婵 龚军源 周小晖 蔺一凡 耿嘉璐
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/23