一种靶向Tim-3的小分子化合物在肿瘤免疫治疗中的应用

一种靶向tim-3的小分子化合物在肿瘤免疫治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于免疫学和抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种靶向tim-3的小分子化合物在肿瘤免疫治疗中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade,icb)疗法已成为继手术治疗、放疗和化疗之后公认有效的肿瘤治疗方式，已经彻底改变了多种肿瘤的治疗。值得注意的是，靶向pd-1和ctla-4的治疗性抗体通过恢复耗竭t细胞的效应功能，在多种肿瘤类型中实现了强有力和持久的抗肿瘤反应。然而，很大一部分癌症患者对pd-1或ctla-4抗体治疗响应性差。因此，寻找新型免疫检查点分子作为治疗靶点十分关键。
4.tim-3参与了慢性病毒感染和肿瘤进展过程中的t细胞终末分化和耗竭，是目前非常有前景的免疫检查点靶点之一。tim-3在肿瘤内耗竭t细胞上高表达，同时在小鼠模型中，靶向tim-3的抗体可以逆转t细胞耗竭并促进肿瘤消退。此外，在黑色素瘤患者和小鼠肿瘤模型中，共表达pd-1和tim-3的cd8
+
t细胞表现出更耗竭的表型，其增殖和细胞因子产生能力严重受损。在多项研究中，tim-3和pd-1联合阻断治疗可显著增强t细胞功能，抑制肿瘤生长，且比单一治疗更有效。值得注意的是，新近临床试验数据表明，tim-3阻断增强了pd-1抗体的抗肿瘤作用。
5.作为ⅰ型膜蛋白，tim-3由一个n端免疫球蛋白可变区(igv)、一个糖基化黏蛋白样结构域、一个跨膜区和一个c端胞质尾部组成。目前已经报道了4种不同的tim-3配体，包括半乳糖凝集素-9(galectin-9)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ptdser)、高迁移率族蛋白b1(hmgb1)和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(cea cell adhesion molecule1，ceacam1)。晶体结构研究表明，在小鼠和人类tim-3的igv结构域中有一个共同的fg-cc'环作为ptdser、ceacam1和hmgb1的结合位点，而galectin-9结合在fg-cc'环另一侧的n-连接聚糖。重要的是，目前被证明有功效的小鼠和人类tim-3抗体的共同特征是阻断tim-3与ptdser和ceacam1的结合，但不阻断tim-3与galectin-9的结合。因此，tim-3的ptdser结合口袋是开发tim-3抑制剂非常关键和有前景的靶点。
6.虽然抗体已被广泛应用于阻断免疫检查点通路，并且目前已有一些tim-3抗体处于临床前开发阶段，但迄今tim-3抗体在早期临床试验中并未展示出强烈的抗肿瘤反应。与抗体相比，小分子免疫检查点抑制剂表现出更高的组织穿透性、良好的生物安全性以及更好的抑制肿瘤生长和迁移的潜力。尽管如此，在免疫检查点阻断领域，小分子抑制剂的开发远远落后于治疗性抗体，只有几种pd-1/pd-l1小分子抑制剂在进行临床试验。目前尚无具有细胞活性的小分子tim-3抑制剂报道。因此，鉴定功能性小分子tim-3抑制剂以改善肿瘤免疫治疗具有极强的临床转化意义。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供一种靶向tim-3的小分子化合物在肿瘤免疫治疗中的应用。本发明通过研究筛选一系列通过靶向tim-3促进免疫细胞抗肿瘤功能的3,5-二取代-3a,6a-二氢螺[呋喃[3,4-c]并吡咯-1,2'-茚]-1',3',4,6(3h,5h)-四酮类小分子化合物，以及包含上述化合物的组合物及其对促进免疫细胞抗肿瘤功能的应用。基于上述研究成果，从而完成本发明。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0009]
本发明的第一个方面，提供化合物在制备tim-3抑制剂中的应用；
[0010]
其中，所述化合物为3,5-二取代-3a,6a-二氢螺[呋喃并[3,4-c]吡咯-1,2'-茚]-1',3',4,6(3h,5h)-四酮类化合物，其具有通式i所示的结构：
[0011][0012]
其中，
[0013]
r1可以为：c
3-c6环烷基、具有0到2个取代的苯环、具有0到2个取代的苄基、具有0到2个取代的六元杂环、具有0到2个取代的五元杂环，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；
[0014]
r2可以为：c
3-c6环烷基、具有0到2个取代的苯环、具有0到2个取代的六元杂环、具有0到2个取代的五元杂环，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；
[0015]
m可以选自0、1或2的整数，r3在每次出现时各自独立地为c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；
[0016]
所述化合物构型可以为消旋体或单一手性构型。
[0017]
根据本发明优选的，
[0018]
r1可以为：具有0到2个取代的苯环、具有0到2个取代的苄基，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；
[0019]
r2可以为：具有0到2个取代的苯环，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；
[0020]
m可以选自0、1或2的整数，r3在每次出现时各自独立地为c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；
[0021]
化合物构型为消旋体或单一手性构型。
[0022]
需要说明的是，关于取代基，本发明所述独立地是指当可能存在多于一个的取代基时，所述取代基可彼此相同或不同的情况。
[0023]
根据本发明进一步优选的，3,5-二取代-3a,6a-二氢螺、[呋喃[3,4-c]并吡咯-1,
2'-茚]-1',3',4,6(3h,5h)-四酮类化合物是下列之一：
[0024]
[0025]
[0026][0027]
进一步的，所述化合物还可以包括其药学上可接受的盐、同位素衍生物、溶剂化物，或者其立体异构体、几何异构体、互变异构体，或者其前药分子、代谢产物。
[0028]
根据本领域一般技术人员的理解，所述药学上可接受的盐包括上述化合物的碱金属盐形式(具体实例如钠盐或钾盐)，或所述化合物与无机盐如盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸形成的盐，以及与有机酸，例如甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸形成的盐。术语“药学可接受的”或者与其可互换使用的“可药用的”，例如在描述“药学可接受的盐”时，表示该盐其不但是受试者生理学上可接受，而且还可指在药学上有使用价值的合成物质，例如在为进行手性拆分时所形成的作为中间体的盐，虽然这种中间体的盐并不能直接给予受试者，但该盐可在为获得本发明终产物中起作用。
[0029]
需要说明的是，本发明上述化合物不仅可作为药物使用，同时显然同样可以作为实验试剂使用，从而用于与tim-3信号通路相关的基础研究。
[0030]
本发明的第二个方面，提供上述化合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
[0031]
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗肿瘤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
[0032]
需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
[0033]
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。实体瘤可以是乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(wilms tumor)。此外，恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。血液瘤可以是例如侵略性和无痛形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓样白血病(cml/aml)、急性淋巴细胞性白血病(all)、霍奇
金病、多发性骨髓瘤和t-细胞型淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤、类肿瘤综合征和未知原发部位的癌症及aids相关的恶性瘤。
[0034]
本发明的第三个方面，提供一种组合物，所述组合物其至少包含上述化合物。
[0035]
本发明的第四个方面，提供一种药物制剂，其至少包含上述化合物，和至少一种药学上可接受的辅料和/或载体。
[0036]
本发明所述辅料是指组合物或药物制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。本领域常用的辅料比如缓冲剂、稳定剂、防腐剂或赋型剂，常用的赋形剂例如粘合剂、填充剂、润湿剂、崩解剂等。
[0037]
作为示例，本发明的所述制剂中可选用的赋形剂包括但不限于：所述赋形剂选自磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糊精、淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐和聚乙烯吡咯烷酮。
[0038]
本发明所述药物载体可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂、囊泡、纳米材料等，用于将本发明上述第一方面所述的化合物递送至动物或人体内。载体可以是液体或固体，并按照计划的给药方式进行选择。此外，蛋白和脂质体也是药物载体。
[0039]
本领域技术人员可采用公知的技术将本发明的化合物配制成组合物或药物制剂。比如将本发明上述第一方面中披露的任意化合物(至少一种化合物)与药用辅料混合，然后如果需要，使所得混合物形成所需的形状。除本发明提到的除外，也可根据现代药物制剂相关书籍进行药物制剂的制备。以及，除本发明提到的以外，合适的药用辅料是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)，在此不再赘述。
[0040]
本发明的第五个方面，提供上述组合物或药物制剂在如下任意一种或多种中的应用：
[0041]
(a)抑制tim-3信号通路或制备tim-3信号通路抑制剂；
[0042]
(b)促进免疫细胞功能及制备促进免疫细胞功能的产品；
[0043]
(c)治疗与tim-3信号通路相关的疾病或制备与tim-3信号通路相关的疾病的产品；
[0044]
其中，所述(b)中，所述免疫细胞包括但不限于t细胞、调节性t细胞(tregs)、树突状细胞(dc)、b细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(nk)和肥大细胞。
[0045]
更具体的，所述促进免疫细胞功能包括：
[0046]
(b1)提高原代cd8+细胞毒性t淋巴细胞和人的嵌合抗原受体t细胞的存活率和效应功能，包括但不限于清除肿瘤细胞或者病毒的功能；
[0047]
(b2)促进nk细胞的杀伤活性和dc抗原提呈能力，包括但不限于促进清除肿瘤细胞或者病毒的功能。
[0048]
所述(c)中，tim-3信号通路相关的疾病包括但不限于肿瘤、病毒感染性疾病以及自身免疫性疾病。
[0049]
其中，所述肿瘤在第二方面已经详细的解释说明，在此不在赘述。
[0050]
所述病毒感染性疾病包括但不限于呼吸道病毒性疾病、胃肠道病毒性疾病、肝脏病毒性疾病、皮肤和黏膜病毒性疾病、眼病毒性疾病、中枢神经系统病毒性疾病、淋巴细胞性病毒性疾病、虫传病毒性疾病以及慢病毒感染疾病。
[0051]
更具体的，所述呼吸道病毒性疾病包括但不限于鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病
毒、副流感病毒和冠状病毒的感染；以及流行性感冒和流行性腮腺炎等。
[0052]
所述胃肠道病毒性疾病包括但不限于病毒性胃肠炎，具体的，包括轮状病毒性胃肠炎、诺瓦克病毒性胃肠炎、腺病毒性胃肠炎、星状病毒性胃肠炎、冠状病毒性胃肠炎和杯状病毒性胃肠炎等。
[0053]
所述肝脏病毒性疾病包括但不限于甲型病毒性肝炎、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、丁型病毒性肝炎、戊型病毒性肝炎和eb病毒性肝炎。
[0054]
所述皮肤和黏膜病毒性疾病包括但不限于麻疹、风疹、幼儿急疹、水痘及带状疱疹、天花、单纯疱疹病毒感染、狂犬病和口蹄疫等。
[0055]
所述眼病毒性疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎、滤泡性结膜炎和疱疹性角膜结膜炎等。
[0056]
所述中枢神经系统病毒性疾病包括流行性乙型脑炎、西方马脑炎、东方马脑炎、圣路易脑炎、委内瑞拉马脑炎、墨累山谷脑炎、加利福尼亚脑炎、森林脑炎和淋巴细胞脉络丛脑膜炎等。
[0057]
所述淋巴细胞性病毒性疾病包括传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染和获得性免疫缺陷综合征等。
[0058]
所述虫传病毒性疾病包括但不限于病毒性出血热、登革热和登革出血热等。
[0059]
所述慢病毒感染疾病包括但不限于亚急性硬化性全脑炎、库鲁病、进行性多灶性白质脑病和亚急性海绵样脑病等。
[0060]
所述自身免疫性疾病包括器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病；
[0061]
其中，所述器官特异性自身免疫病包括但不限于慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等。
[0062]
所述系统性自身免疫病包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎等。
[0063]
特别的，本发明上述组合物或药物制剂具有如下应用：
[0064]
(c1)抑制肿瘤进展或制备抑制肿瘤进展的产品；
[0065]
(c2)协同增强pd-1阻断诱导的抗肿瘤反应或制备协同增强pd-1阻断诱导的抗肿瘤反应的产品；
[0066]
(c3)肿瘤免疫治疗或备肿瘤免疫治疗的产品。
[0067]
当然，上述产品可以为药物或实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用，从而用于与tim-3信号通路相关的基础研究。
[0068]
上述技术方案的有益技术效果：
[0069]
上述技术方案首次提出3,5-二取代-3a,6a-二氢螺[呋喃[3,4-c]并吡咯-1,2'-茚]-1',3',4,6(3h,5h)-四酮类化合物或者其药学上可接受的盐、同位素衍生物、溶剂化物，或者其立体异构体、几何异构体、互变异构体，或者其前药分子、代谢产物在高效、高选择性抑制tim-3信号通路中的作用。具体的，本发明通过虚拟筛选方式从specs库中筛选出一系列小分子化合物，经试验验证，该类化合物显著提高原代cd8+细胞毒性t淋巴细胞和人
的嵌合抗原受体t细胞的存活率和抗肿瘤活性，显著促进nk细胞的杀伤活性和dc抗原提呈能力，表现出与tim-3阻断抗体相当的抑制肿瘤作用，有效地抑制抑制肿瘤进展以及协同增强pd-1阻断诱导的抗肿瘤反应。因此，该类化合物可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或药用组合物，具有良好的潜在开发应用之价值。
附图说明
[0070]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0071]
图1为功能筛选鉴定靶向tim-3的小分子化合物ml-t7；
[0072]
其中：a为使用ot
‑ⅰ
cd8
+
ctl的功能实验流程；b为17个候选小分子化合物对ctl的增殖的影响；c为流式检测17个候选小分子化合物预处理后，cd8
+
ctl细胞因子分泌情况；d为荧光定量检测dmso和ml-t7预处理的cd8
+
ctl中ifn-γ,tnf-α和il-2mrna表达水平；e为dmso和ml-t7预处理的cd8
+
ctl对于2nm ova
257-264
孵育的el4肿瘤的杀伤能力；f为dmso和ml-t7预处理的cd8
+
ctl对于10nm ova
257-264
孵育的脾细胞的体内杀伤能力。
[0073]
图2为ml-t7结合tim-3，并阻断tim-3与ptdser和ceacam1的相互作用；
[0074]
其中：a为spr分析ml-t7与纯化的tim-3蛋白之间的亲和力；b为mst法检测ml-t7与细胞上清中gfp-tim-3融合蛋白之间的亲和力(n＝3)；c为动力学模拟分析ml-t7-htim3、ml-t7-mtim3和ptdser-htim-3复合物的rmsd值；d为mm/gbsa计算ml-t7/ptdser与tim-3的结合亲和力；e为动态模拟预测ml-t7与htim-3igv结构域fg-cc'沟的结合示意图；f为ml-t7-htim3配合物结合模式的二维(2d)示意图，突出了氢键和主要的疏水相互作用；g为纯化的tim-3蛋白与ml-t7或抗tim-3抗体孵育，然后加入地塞米松处理的胸腺细胞，然后流式细胞术分析tim-3与凋亡胸腺细胞的结合(n＝3)，随着ml-t7浓度的增加，tim-3与凋亡胸腺细胞的结合被阻断；h为纯化的tim-3蛋白与ml-t7或抗tim-3抗体孵育后，加入jurkat-ceacam1细胞，流式细胞术分析tim-3与jurkat-ceacam1的细胞结合(n＝3)，随着ml-t7浓度的增加，tim-3与jurkat-ceacam1的结合被阻断。
[0075]
图3为ml-t7通过tim-3增强tcr/stat5信号并促进cd8
+
t细胞的抗肿瘤活性；
[0076]
其中：a为流式检测dmso和ml-t7预处理的wt和tim-3 ko ctl产生ifn-γ、tnf-α、il-2、perforin和granzyme b的水平；b为dmso和ml-t7预处理的wt和tim-3 ko ctl杀伤2nm ova
257-264
孵育的el4肿瘤的能力；c为流式检测dmso和ml-t7预处理的wt和tim-3 ko ctl的凋亡水平；d为流式检测dmso和ml-t7预处理的wt和tim-3 ko ctl的增殖水平；e为流式检测dmso和ml-t7预处理的wt和tim-3 ko ctl表达pd-1和ctla-4水平；f和g为dmso和ml-t7预处理的wt和tim-3 ko ctl的gesa分析结果；h为dmso和ml-t7预处理的wt和tim-3 ko ctl经过2μg/ml cd3/cd28抗体刺激15min后通过western blot检测相应蛋白的磷酸化水平；i为dmso和ml-t7预处理的ctl回输治疗b16-mo5皮下瘤小鼠的示意图；j为检测肿瘤生长曲线；k为记录荷瘤小鼠生存期；l为dmso和ml-t7预处理的ctl回输治疗b16-mo5-fluc肺转移瘤小鼠的示意图；m为检测小鼠肺部荧光素酶活性；n为记录荷瘤小鼠生存期；o为dmso和ml-t7预处理的tim-3ko ctl回输治疗b16-mo5-fluc肺转移瘤小鼠的示意图；p为检测小鼠肺部荧光素酶活性；q为记录荷瘤小鼠生存期。
[0077]
图4为ml-t7直接增强cd8
+
ctl的存活和效应功能；
[0078]
其中：a为dmso(cd45.1
+
)或ml-t7(cd45.1
+
cd45.2
+
)预处理的ot
‑ⅰ
cd8
+
ctl以1:1的比例共回输至b16-mo5荷瘤小鼠流程示意图；b为在第7天和第14天流式监测肿瘤中dmso或ml-t7预处理的ctl比例；c为流式检测肿瘤中annexin v+ctl的比例；d为流式检测脾脏和淋巴结中ki67
+
ctl的比例；e为流式检测肿瘤中cd25+和cd69+ctl的比例；f为流式检测脾脏和淋巴结中cd25
+
ctl的比例；g为流式检测肿瘤、脾脏和淋巴结中ctl分泌ifn-γ、tnf-α和il-2的能力；h为流式检测肿瘤中ctl上pd-1和ctla-4的表达水平。
[0079]
图5为ml-t7可增强nk细胞和dc的效应功能；
[0080]
其中：a为流式检测dmso和ml-t7预处理的nk92细胞的ifn-γ、tnf-α、cd107a和granzyme b的表达水平；b为dmso和ml-t7处理的nk92细胞对k562-fluc靶细胞的体外杀伤能力；c为dmso和ml-t7预处理的dc中cd11c、cd80、cd86和mhcii的表达水平；d为dmso和ml-t7预处理的dc刺激的ctl的活化水平；e为dmso和ml-t7预处理的dc刺激的ctl分泌细胞因子能力。
[0081]
图6为ml-t7腹腔给药野生型和人源化小鼠的hcc模型中均表现出抗肿瘤活性；
[0082]
其中：a为不同剂量ml-t7(dmso为对照，每2天一次)或tim-3抗体(igg为对照，每周3次)腹腔注射治疗akt/cmyc诱导的原位hcc模型示意图；b和c为活体成像检测小鼠肝部荧光素酶活性，监测肿瘤进展；d为小鼠生存曲线；e为流式检测肿瘤中cd8
+
t细胞的百分比和数量；f为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞的ki67水平；g为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞的ifn-γ、tnf-α和il-2分泌能力；h为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞的pd-1表达水平；i为流式检测肿瘤浸润nk细胞的ifn-γ和tnf-α表达水平；j为流式检测肿瘤内dc的cd40和cd86的表达水平；k为在tim-3人源化小鼠建立hcc模型并进行ml-t7腹腔注射给药；l为生物发光成像监测肿瘤生长；m为小鼠生存曲线。
[0083]
图7为在hcc小鼠模型中ml-t7腹腔给药促进抗肿瘤免疫应答；
[0084]
其中：a为给药处理后hcc小鼠体重变化曲线；b为hcc小鼠的肝重体重比；c为hcc小鼠的ast和alt水平；d为流式检测脾脏中cd8
+
t细胞的百分比和数量；e为流式检测脾脏cd8
+
t细胞的ki67水平；f为流式检测脾脏cd8
+
t细胞的ifn-γ、tnf-α和il-2分泌能力；g为流式检测脾脏cd8
+
t细胞的pd-1表达水平；h为流式检测脾脏nk细胞的ifn-γ和tnf-α表达水平；i为流式检测脾脏dc的cd40和cd86的表达水平；j为流式检测肿瘤中mdsc的百分比和数量；k为流式检测脾脏中mdsc的百分比和数量；l为流式检测肿瘤中treg的百分比和数量；m为流式检测脾脏中treg的百分比和数量。
[0085]
图8为在小鼠黑色素瘤模型中ml-t7腹腔给药表现出抗肿瘤活性；
[0086]
其中：a为50mg/kg ml-t7(dmso为对照，每2天一次)腹腔注射治疗b16f10皮下瘤模型示意图；b为小鼠肿瘤生长曲线和肿瘤照片；c为流式检测肿瘤和脾脏cd8
+
t细胞的比例；d为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞的ifn-γ、tnf-α和il-2分泌能力；e为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞pd-1和tox表达；f为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞cd25和cd69表达；g为流式检测肿瘤内nk细胞比例；h为流式检测肿瘤内nk细胞分泌ifn-γ和tnf-α的能力。
[0087]
图9为ml-t7处理增强人car t细胞的抗肿瘤活性；
[0088]
其中：a为流式细胞术检测dmso和ml-t7预处理的19bbz car t细胞对namalwa细胞的杀伤能力；b为流式检测dmso和ml-t7预处理的19bbz car t细胞的凋亡和增殖状况；c为荧光定量检测dmso和ml-t7预处理的19bbz car t细胞中ifn-γ、tnf-α和il-2的mrna表达
水平；d为将car t细胞与namalwa细胞按1:1、2:1和4:1的e:t比例共培养18h，采用elisa法检测上清中ifn-γ、tnf-α和il-2的含量；e为将dmso或ml-t7处理过的19bbz car-t细胞过继转移到namalva-fluc荷瘤b-ndg小鼠的示意图；f和g为采用生物发光成像监测肿瘤生长情况；h为荷瘤鼠生存曲线；i为流式检测荷瘤b-ndg小鼠外周血中cd3
+
car t细胞比例；j为流式检测荷瘤b-ndg小鼠外周血中cd8
+
car t细胞比例；k为流式检测荷瘤b-ndg小鼠外周血中cd8
+
car t细胞凋亡比例；l为流式检测荷瘤b-ndg小鼠中cd8
+
car t细胞ifn-γ和tnf-α表达水平。
[0089]
图10为在hcc模型中ml-t7治疗与pd-1抗体治疗具有协同作用；
[0090]
其中：a为ml-t7(dmso为对照，每2天一次)和pd-1抗体(igg为对照，每周3次)单独或联合治疗akt/cmyc诱导的hcc模型示意图；b为hcc小鼠的肝重体重比；c和d为利用生物发光成像评估肿瘤生长；e为hcc小鼠生存曲线；f为hcc小鼠血清ast和atl水平；g为hcc小鼠肝脏的he染色和ki67免疫组化染色。
[0091]
图11为ml-t7在体内与pd-1抗体治疗协同促进肿瘤免疫应答；
[0092]
其中：a为流式检测肿瘤中cd45
+
t细胞的百分比和数量；b为流式检测肿瘤中cd8
+
t细胞的百分比和数量；c为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞的ki67水平；d为流式检测脾脏cd8
+
t细胞的百分比和数量；e为流式检测脾脏cd8
+
t细胞的ki67水平；f为流式检测脾脏cd8
+
t细胞的ifn-γ、tnf-α和il-2分泌能力；g为流式检测肿瘤浸润cd8
+
t细胞的ifn-γ和tnf-α分泌能力；h为流式检测肿瘤浸润nk细胞的ifn-γ和tnf-α表达水平；i为流式检测脾脏nk细胞的ifn-γ和tnf-α表达水平；j为流式检测肿瘤中mdsc细胞的百分比和数量；k为流式检测脾脏中mdsc细胞的百分比和数量；l为流式检测肿瘤中treg的百分比和数量。
[0093]
图12为ml-t7在小鼠体内显示出良好的生物安全性；
[0094]
其中：a为c57bl/6小鼠每天腹腔注射50mg/kg ml-t7或dmso，体重变化；b为心、脾、肾重量；c为心、肝、脾、肺、肾的he切片；d为血清ast和alt水平；e为结肠长度；f为血液学分析红细胞(rbc)和白细胞(wbc)的全血计数；g为血液学分析中血小板、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的全血计数；h为ml-t7对herg钾通道的抑制作用；该化合物对herg的抑制作用较低，目前ml-t7在30μm时的抑制率仅为29.04％。
[0095]
图13为derek软件预测ml-t7毒性；
[0096]
图14为ml-t7类似化合物具有增强nk效应功能的作用；
[0097]
其中：a为ml-t7类似化合物处理后nk92细胞系杀伤k562靶细胞能力；b为流式检测nk92细胞cd107表达；c为流式检测nk92细胞tnf-α分泌水平；d为流式检测nk92细胞ifn-γ分泌水平。
具体实施方式
[0098]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0099]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0100]
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例中所使用到的化合物(包括ml-t7及其系列类似化合物ml-t7s1～ml-t7s17)均购自荷兰specs公司，均为specs公司化合物库中的已有化合物。
[0101]
实施例
[0102]
实验方法
[0103]
1、实验小鼠
[0104]
ot
‑ⅰ
转基因小鼠(cd45.1或cd45.1.2,c57bl/6j背景)表达h-2kb/ova
257 ‑
264
特异性tcr。c57bl/6j(cd45.2)小鼠和tim-3人源化小鼠(tim-3-hu)购自集萃药康有限公司(中国江苏南京)。tim-3基因敲除(ko)小鼠(c57bl/6j背景)由中国上海司丹赛生物技术公司构建，与ot-ι小鼠杂交获得ot-ιtim-3 ko小鼠。在山东大学实验动物中心，恒定的室温(20～24℃)和无特定病原体的条件下，按常规12h光照/12h黑暗程序饲养小鼠。除非另有说明，所有小鼠均在8～12周龄时使用。所有动物实验均严格按照伦理学标准进行，并经山东大学动物保护与使用委员会批准。
[0105]
2、ot-ιctl的诱导
[0106]
无菌环境取6-8周龄的雄性ot
‑ⅰ
小鼠脾脏，研磨后用培养基重悬，注意边研磨边补加培养基。将上一步得到的细胞悬液1200r/5min离心，弃上清，加入5ml红细胞裂解液，冰上或者冰箱4℃裂解10min。1200r/5min离心，弃上清，培养基重悬细胞，离心后5ml培养基(rpmi 1640+10％ fbs+50μmβ-巯基乙醇+双抗)重悬，计数，以3x106个/ml的密度种板，同时加入ova
257-264
刺激细胞，浓度10nm，刺激3天后，离心换液，继续培养2天即可获得ctls。
[0107]
3、流式检测细胞因子分泌
[0108]
(1)取足量的el4细胞，分别与2nm，200pm，20pmova
257-264
抗原孵育1h，pbs洗一遍；
[0109]
(2)对ctl细胞和el4细胞进行计数，使ctl细胞与el4细胞的数量分别为5x105个和2.5x105个，最终体积之和为500μl，向ctl中加入el4的同时，加入高尔基体抑制剂混匀；
[0110]
(3)将ctl细胞与el4混匀，37℃孵箱孵育4-6h；
[0111]
(4)收细胞，1000r/5min离心，弃上清，50μl pbs重悬细胞；
[0112]
(5)准备cd8抗体稀释液(1个样品0.25μl抗体)，每个样品加5μl抗体稀释液，将50μl细胞加入抗体稀释液，混匀；剩余细胞混在一起作为空白对照，4℃冰箱染色45min；
[0113]
(6)500μl pbs+5mm edta重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清，加入100μl 2％多聚甲醛固定液，4℃冰箱固定30min；
[0114]
(7)500μl穿膜液重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清，50μl穿膜液重悬细胞；
[0115]
(8)准备tnf-α(pe)，ifn-γ(apc)，il-2(fitc)抗体稀释液(1个样品0.25μl抗体)，每个样品加5μl抗体稀释液，将50μl细胞加入抗体稀释液，混匀，4℃冰箱染色45min；
[0116]
(9)500μl穿膜液重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清；
[0117]
(10)500μl pbs重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清；
[0118]
(11)300μl pbs重悬细胞，滤网过滤后，流式上机检测。
[0119]
4、表面等离子共振(spr)实验
[0120]
spr结合实验使用biacore t200生物传感器系统(ge healthcare)在25℃进行。所有缓冲液均从ge healthcare购买。将cm5微传感器芯片(ge healthcare)与hepes缓冲液
(10mm hepes,150mm nacl,cacl2,ph 7.4)平衡，直至达到稳定的信号。根据仪器说明书，将his标记的人tim-3蛋白(cat#tm-h5229,acrobiosystems group，北京，中国)在10mm醋酸钠缓冲液(ph＝4.0)中稀释，使用胺偶联试剂盒固定在cm5芯片上。然后，用运行缓冲平衡芯片以稳定信号。ml-t7在hepes缓冲液中从最大浓度25μm开始进行2倍梯度稀释6点。以30μl/min的流速在hepes缓冲液中连续稀释ml-t7 90s结合和90s解离。采用biacore t200软件进行数据分析，采用1:1动力学拟合模型计算平衡常数(kd)。
[0121]
5、微量热泳动实验(mst)
[0122]
使用monolith nt.115仪器(nanotemper technologies)进行mst实验。简单地说，使用聚乙烯亚胺(pei)试剂将表达gfp-tim-3融合蛋白的质粒或gfp(对照)转染hek293t细胞。于转染后48h收集细胞上清液，用0.45μm滤器过滤。将ml-t7溶于含5％ dmso浓度625μm的pbs中，梯度稀释2倍。将梯度稀释的ml-t7与含gfp-tim-3融合蛋白的细胞上清液或含5％ dmso的gfp(对照)以1∶1的比例孵育20min，然后将样品装入玻璃毛细血管中，使用20％的led激发功率和40％的mst功率进行mst。使用mo.affinity analysis软件(nanotemper,version 2.3)分析结合曲线。
[0123]
6、使用凋亡胸腺细胞或jurkat-ceacam1测定tim-3结合
[0124]
使用0.1mm的calcein-am(thermofisher)标记c57bl/6j小鼠胸腺细胞，然后用1mm地塞米松(sigma)在含10％ fbs的dmem中在37℃处理6h诱导细胞凋亡。annexin v(bd pharmingen)染色证实细胞凋亡。将重组人tim-3蛋白(三优生物)与指定浓度的ml-t7或dmso在室温下孵育30min，然后加入凋亡胸腺细胞或过表达ceacam1的人t淋巴母细胞系(jukrat-ceacam1)中，用抗人tim-3 apc抗体(biolegend)染色。流式细胞术检测tim-3结合情况。
[0125]
7、小鼠黑色素瘤模型的过继性ctl转移治疗
[0126]
建立小鼠皮下黑素瘤模型，于第0天将2
×
105个b16-mo5黑素瘤细胞接种于野生型c57bl/6j小鼠皮下。荷瘤小鼠于第10天可触及肿瘤时静脉注射10μm ml-t7或4
×
106dmso处理的ot
‑ⅰ
cd8
+
ctl。每隔2～3天用数字卡尺测量肿瘤，以肿瘤体积表示(以width2×
length/2计算)。基于伦理考虑，肿瘤大小为》20mm的小鼠将通过吸入co2实施安乐死。每天记录生存率。
[0127]
建立肺转移瘤模型，野生型c57bl/6j小鼠第0天静脉注射2
×
105个表达萤火虫荧光素酶的b16-mo5黑色素瘤细胞(b15-mo5-fluc)建立肺转移模型。荷瘤小鼠第10天静脉注射经ml-t7或dmso处理的ot
‑ⅰ
cd8+ctl(4
×
106)。采用ivis spectrum系统(perkinelmer)进行生物发光成像监测肺转移灶。荧光素酶活性水平表示为p/sec/cm2/sr。每天记录生存率。
[0128]
8、肿瘤小鼠模型制备
[0129]
小鼠黑素瘤模型：5-6周龄的雄性c57bl/6小鼠，皮下注射2x105个b16-mo5细胞，待长出肿瘤后(大约6d)，每隔一天游标卡尺测量肿瘤短径(a)和长径(b)，计算肿瘤体积v＝a2b/2；统计小鼠死亡时间，绘制小鼠生存曲线。
[0130]
水动力注射akt/cmyc质粒诱导肝细胞肝癌(hcc)模型：按照质粒提取试剂盒步骤提取cmyc、akt/fluc基因质粒及编码sleeping beauty转座酶的质粒sb100，将cmyc、akt基因质粒与sb100质粒按每只小鼠12μg：12μg：1μg的比例，一定体积的(体重的10％，例如20g体重使用2ml pbs)0.9％氯化钠溶液中，涡旋混匀，过0.22μm微孔滤膜，将配置好的质粒经
小鼠尾静脉水动力高压注射法注入8周龄的野生型雄性c57bl6小鼠。质粒注射后3～4周可见小鼠肝脏形成肝细胞肝癌。
[0131]
9、人car t细胞的制备和功能实验
[0132]
制备靶向人cd19的人19bbz car-t细胞。使用lentifit(汉生物，中国)转染试剂将慢病毒19bbz car表达质粒与pspax2(addgene，#12260)和pmd2g(addgene，#12259)一起转染lenti-x 293t细胞。分别于转染后48、72h收集含上清液的慢病毒，超速离心法浓缩，用0.22μm滤器过滤。从健康供者的外周血单个核细胞(pbmcs)中分离出原代人t细胞，在添加10％ fbs和50iu/ml il-2的texmacs gmp培养基(miltenyi biotec)中以1∶1的比例(miltenyi biotec,bergisch gladbach，德国)用抗cd3/cd28珠活化2天，然后在32℃离心转导含有人19bbz car慢病毒颗粒的浓缩上清液2小时。将转导后的细胞用含50iu/ml il-2的新鲜培养液以1:2的比例每天传代5d。通过流式细胞术检测car质粒的gfp表达来确定转染效率。
[0133]
扩增后，car t细胞用10μm ml-t7或dmso处理48h。ml-t7或dmso处理的car t细胞与namalwa靶细胞以1:1、2:1、4:1的比例共培养18h。收集细胞上清液，采用elisa试剂盒(dakewe)检测il-2、ifn-γ和tnf-α水平。根据dil标记的靶细胞与抗人cd19-apc抗体(cat#561742,bd)标记的car t细胞的比例，采用流式细胞术检测car t细胞的细胞毒能力。
[0134]
10、car t细胞治疗
[0135]
将5
×
105个表达萤火虫荧光素酶的namalwa细胞(namalwa-fluc)在200μl pbs中尾静脉注射到b-ndg(nod-prkdcscid il2rgtm1)小鼠，并在第5天和第10天随机分为3组，分别接受pbs、3
×
106个dmso处理的19bbz car-t细胞和3
×
106个ml-t7处理的19bbz car-t细胞。分别于第10、16天采用ivis spectrum系统(perkinelmer)进行生物发光成像监测肿瘤进展情况，并每天记录生存率。从受体小鼠分离pbmcs，用指定的抗体染色，并使用流式细胞术分析。
[0136]
11、肿瘤浸润淋巴细胞的分离及刺激方法
[0137]
剥离小鼠肿瘤组织(皮下瘤或者肝癌)，研钵研碎，过滤网，收集细胞液，600rpm 1min离心，倾倒上清液进一个干净的50ml离心管，1200rpm 5min离心，弃上清后，加入8ml percoll工作液，2000rpm 20min离心，弃上层后，加入5ml红细胞裂解液，冰上裂解10min，1200rpm 5min离心，弃上清，加入2ml pbs，取少量细胞进行cd8
+
t细胞计数，剩余细胞离心后，加入1640完全培养基，pma(200ng/ml)和离子霉素(1μm)刺激4-6h后收细胞进行流式抗体染色，收细胞4h之前加入高尔基体抑制剂。
[0138]
12、流式细胞术分析
[0139]
表面染色：细胞在4℃避光条件下标记表面标志物30min。对于细胞内染色，使用ic固定缓冲液(cat#00-8222-49,ebioscience)固定细胞，使用破膜缓冲液(cat#00-8333-56,ebioscience)对细胞破膜，并使用指定的抗体染色。对于转录因子染色，用固定/破膜浓缩物和稀释缓冲液(cat#00-5521,ebioscience)对细胞进行固定和破膜。使用cytoflex s流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)运行样本，并使用cytexpert程序(贝克曼库尔特)和flowjo软件进行数据分析。
[0140]
实验结果
[0141]
1、功能筛选鉴定到促进ctl功能细胞的小分子化合物ml-t7
[0142]
为了寻找tim-3小分子抑制剂，我们采用了一种虚拟筛选联合功能筛选的策略。考虑到人和鼠的tim-3的氨基酸同源性超过63％，且在ptdser结合位点结构高度保守，我们以鼠tim-3(mtim-3)与ptdser(pdb:3kaa)形成复合物为模板进行了人tim-3(htim-3)的同源模建。利用该模型以ptdser结合位点为结合口袋，对specs库中204380种化合物进行对虚拟筛选，共鉴定出192个与靶点预测亲和力大于-7.4kcal/mol的化合物(图1a)。然后，通过结构相似性聚类、理化性质预测和结合模式分析等多种策略对这些化合物进行进一步筛选。最后选择17个小分子化合物，命名为ml-t1到ml-t17，用于后续基于cd8
+
ctl功能筛选。
[0143]
我们将ot
‑ⅰ
t细胞受体(tcr)转基因小鼠(一种广泛用于评估cd8
+
t细胞抗肿瘤免疫功能的小鼠模型)的脾细胞与卵清白蛋白多肽(257-264)(siinfekl,ova
257-264
)在ml-t1到ml-t17(10μm浓度)的存在下进行孵育(图1b)。ml-t7对细胞活力无明显影响(图1c)，在mrna和蛋白水平上显著增强ot
‑ⅰ
细胞中ifn-γ，tnf-α和il-2的产生(图1d和e)。ml-t7预处理的ot
‑ⅰ
cd8
+
ctl在体外和体内均显示更强的杀伤靶细胞能力(图1f和g)。
[0144]
2、ml-t7结合tim-3，并阻断tim-3与ptdser和ceacam1的相互作用
[0145]
为了确定ml-t7是否直接结合tim-3并作为tim-3抑制剂发挥作用，我们使用商品化的his标记htim-3蛋白进行了表面等离子共振(spr)实验。如图2a所示，ml-t7与htim-3结合，kd值为6.98μm，表明ml-t7与htim-3之间存在中等程度的相互作用。为了验证这种相互作用，我们使用含有与绿色荧光蛋白融合的htim-3(gfp-htim-3)或对照gfp的细胞上清进行了微量热泳动(mst)实验。只有gfp-htim-3细胞上清液与ml-t7产生了结合曲线(图2b)，进一步证明了ml-t7可以与htim-3的结合。
[0146]
分子动力学模拟研究进一步支持了ml-t7与htim-3的相互作用。如图2c所示，位置均方根偏差(rmsd)分析的结果表明，mtim-3和htim-3均与ml-t7稳定结合，与原始构象相比仅略有波动。通过mm/gbsa计算的分子力学表明，ml-t7对htim-3和mtim-3的亲和力都高于ptdser对tim-3的亲和力，这意味着ml-t7可以有效地中断ptdser与tim-3的相互作用(图2d)。对分子动力学结果的代表性构象的详细分析表明，ml-t7与htim-3的fg-cc'环的残基形成广泛的相互作用：来自配体骨架的吡啶中的一个氧与glu33主链的氮原子形成极性接触，而ml-t7的三个末端芳香环与相邻残基val31、phe32、cys34、arg82、gln84和ile88有多个疏水相互作用(图2e和f)。
[0147]
晶体结构研究表明fg-cc'环是ptdser的结合位点。为了检测ml-t7阻断tim-3与ptdser结合的能力，用地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡使其表面暴露ptdser，然后在ml-t7存在的情况下与tim-3蛋白共孵育。我们观察到ml-t7以剂量依赖的方式抑制凋亡胸腺细胞与htim-3的结合(图2g)。此外，流式细胞术分析显示，ml-t7也可以浓度依赖性方式阻断了htim-3与ceacam1过表达jurkat细胞的结合(图2h)，这与ptdser和ceacam1与tim-3结合在同一口袋的观点一致。
[0148]
3、ml-t7通过tim-3增强tcr/stat5信号并促进cd8
+
t细胞抗肿瘤活性
[0149]
为了证实ml-t7作为tim-3抑制剂促进cd8
+
t细胞功能，我们将tim-3基因敲除(tim-3 ko)小鼠与ot
‑ⅰ
小鼠杂交，产生tim-3敲除(tim-3 ko)的tcr特异性cd8
+
ctl。正如预期的那样，ml-t7在野生型(wt)ctl中显著促进了ifn-γ、tnf-α、il-2、穿孔素和颗粒酶b的产生，而在tim-3 ko ctl中则没有促进作用(图3a)。此外，tim-3敲除消除了ml-t7增强ctl体外杀伤肿瘤细胞能力的作用(图3b)。我们还发现，ml-t7处理降低了ctl的凋亡，并增加了
增殖能力，而ml-t7对tim-3 ko ctl的凋亡和细胞增殖没有影响或影响很小(图3c和d)。同时，ml-t7处理在wt细胞中抑制了抑制性受体pd-1和ctla-4的表达，但在tim-3 ko ctl没有影响，说明ml-t7处理可以抑制t细胞耗竭(图3e)。进一步的rna测序(rna-seq)结合基因集富集分析(gsea)显示tcr信号通路和il2-stat5通路在ml-t7处理的ctl中显著富集(图3f和g)。相应的，ml-t7处理增加了抗cd3/cd28抗体刺激后plcγ1,zap70,lck,erk1/2和stat5的磷酸化水平。值得注意的是，ml-t7不影响tim-3 ko ot
‑ⅰ
cd8
+
ctl中的tcr和stat5信号(图3h)。上述结果表明，ml-t7通过tim-3增强cd8
+
ctl的tcr和stat5信号通路。
[0150]
为了进一步验证ml-t7是否可以增强ctl的体内抗肿瘤功能，我们将ml-t7处理的或对照ot
‑ⅰ
cd8
+
ctl过继回输到b16-mo5黑色素瘤荷瘤小鼠(图3i)。令人鼓舞的是，回输ml-t7预处理的ctl显著抑制了肿瘤进展，延长了受体小鼠的生存期(图3j和3k)。在携带萤火虫荧光素酶的b16-mo5(b16-mo5-fluc)肺转移肿瘤模型小鼠中获得了类似结果(图3l)。与对照小鼠相比，接受ml-t7处理的ot
‑ⅰ
cd8
+
ctl的受体小鼠在肺内显示出较低的肿瘤负荷(图3m)，并且生存时间更长(图3n)。重要的是，当我们将ml-t7处理或dmso处理的tim-3 ko cd8
+
ctl转移到b16-mo5-fluc肺转移瘤小鼠中(图3o)，发现两组之间的肿瘤进展和生存时间没有差异(图3p和q)。因此，上述实验表明ml-t7通过tim-3调节ctl抗肿瘤功能。
[0151]
4、ml-t7直接增强cd8+ctl的存活和效应功能
[0152]
为了验证ml-t7是否内源性促进ctl的效应功能，我们将等量的对照和ml-t7处理的ctl回输至b16-mo5皮下瘤模型鼠中(图4a)。流式细胞术结果显示，ml-t7处理显著促进了ctl在肿瘤内的聚集和持续能力(图4b)。与之一致的是，ml-t7处理使ctl在肿瘤中的凋亡减少，而增殖增加(图4c)。在脾脏和淋巴结中我们也观察到ml-t7处理的ctl的增殖的增加(图4d)。此外，在受体小鼠的肿瘤、脾脏和淋巴结中，ml-t7处理的cd8
+
ctl不仅表达更高的活化分子cd25和cd69(图4e和f)，而且产生更多的ifn-γ、tnf-α和il-2(图4g)。我们还观察到，在浸润肿瘤的ml-t7处理的ctl中，pd-1和ctla-4的表达显著降低，提示其耗竭程度更低(图4h)。因此，ml-t7可直接延长cd8+ctl的存活时间和增强其效应功能。
[0153]
5、ml-t7增强nk细胞和dc的功能
[0154]
考虑到tim-3在固有免疫细胞上大量表达，并在自然杀伤(nk)细胞和树突状细胞(dcs)的负性调节功能中发挥重要作用，而这两种细胞对肿瘤免疫治疗至关重要。因此，我们检测了ml-t7对nk细胞功能的影响。流式细胞术分析显示，10μm ml-t7处理显著增强了人nk细胞系nk92细胞中效应分子ifn-γ、tnf-α、cd107a和颗粒酶b的产生(图5a)。与对照nk92细胞相比，ml-t7处理的nk92细胞在不同的e:t比值下对k562-fluc细胞的杀伤活性均显著升高(图5b)。
[0155]
为检测ml-t7对dc功能的调节作用，我们使用粒细胞-巨噬细胞刺激集落因子(gm-csf)和白细胞介素-4(il-4)培养骨髓细胞5天，然后在第6天加入1μg/ml lps和10μm ml-t7培养24h，制备成熟dc(mdc)。与dmso相比，ml-t7处理增加了dc表面cd11c、cd80、cd86和mhcii的表达(图5c)，表明dc成熟增强，抗原提呈能力增强。进一步功能实验表明，由ml-t7处理的dc激活的t细胞活化更强并具有更强的效应功能(图5d和e)。综上所述，我们的结果表明，ml-t7处理可以促进dc成熟和nk细胞的抗肿瘤功能。
[0156]
6、ml-t7腹腔给药在小鼠hcc肝癌模型和人源化小鼠中均表现出抗肿瘤活性
[0157]
为了评估ml-t7是否可以作为一种直接的肿瘤免疫治疗药物，我们用不同剂量的
car t细胞在携带namalwa-fluc肿瘤的b-ndg小鼠中显示出显著增强的抗肿瘤活性。过继转移ml-t7处理的19bbz car t细胞极大地诱导肿瘤消退，并延长小鼠生存期(图9e到h)。此外，与接受对照car t细胞的小鼠相比，在接受ml-t7预处理car t细胞的小鼠外周血中检测到更多的cd3
+
和cd8
+
car t细胞(图9i和j)。与对照car t细胞相比，回输的ml-t7处理的cd8
+
car t细胞显示出较少的凋亡(图9k)和较高的ifn-γ和tnf-α分泌水平(图9l)，这与ml-t7处理的小鼠ctl的数据一致。
[0164]
综上所述，上述结果表明，在car t细胞制备过程中，ml-t7处理显著增强了人类car t细胞过继转移的治疗潜力，进一步支持ml-t7也适用于人类t细胞。
[0165]
9、ml-t7在体内与pd-1抗体治疗有协同作用
[0166]
之前的研究已经报道了联合阻断tim-3和pd-1可以协同提高抗肿瘤反应，我们进一步探索了在akt/myc hcc肿瘤模型中，ml-t7是否可以与pd-1抗体在肿瘤免疫治疗中协同作用(图10a)。根据活体成像、生存曲线、肝脏重量测量、alt/ast评估、苏木精-伊红(he)染色和ki67染色，20mg/kg的ml-t7单独治疗显示出几乎与100mg/kg的pd-1单克隆抗体相似的抗肿瘤活性(图10b到g)。最重要的是，ml-t7和pd-1抗体联合治疗比任何一种单独治疗显示出更强的抗肿瘤活性(图7b至e，接受联合治疗的50％小鼠(3/6)在第120日存活，而接受ml-t7或pd-1抗体单药治疗的0或1/6小鼠存活至第120日(图10e)。这些结果表明，ml-t7联合治疗可显著提高pd-1抗体的抗肿瘤疗效。
[0167]
接下来，我们进一步探索了ml-t7和pd-1抗体单独或联合治疗对hcc肿瘤模型中免疫细胞的影响。与单独pd-1抗体治疗相似，ml-t7单独治疗或联合pd-1抗体治疗均显著促进了肿瘤中cd45
+
免疫细胞的浸润(图11a)，增加了肿瘤和脾脏中cd8
+
t细胞的比例、数目和增殖(图11b到e)，还显著增强了肿瘤和脾脏中cd8
+
t细胞产生细胞因子(ifn-γ、tnf-α和il-2)的能力(图11f和g)。与tim-3和pd-1对nk细胞功能的负性调节作用一致，我们还观察到ml-t7和pd-1抗体治疗均强烈增加了nk细胞的ifn-γ和tnf-α的产生(图11h和i)，这表明了增强了nk肿瘤杀伤活性。值得注意的是，ml-t7疗法与pd-1抗体疗法在恢复nk细胞活力和抑制mdscs和treg浸润方面显示出巨大的协同作用(图11j到l)。
[0168]
综上所述，ml-t7不仅在体内显示出强大的抗肿瘤活性，而且还与pd-1抗体治疗协同缓解了肿瘤微环境中的抑制性免疫环境，并重新激活了cd8
+
t细胞和nk细胞的抗肿瘤反应。
[0169]
10、ml-t7在小鼠体内显示出良好的生物安全性
[0170]
为了确定ml-t7的生物安全性，并进一步探讨其临床转化前景。我们每天给c57bl/6小鼠腹腔注射50mg/kg ml-t7 2周。在实验期间ml-t7处理未引起体重或临床症状的任何异常变化(图12a)。在尸检时，ml-t7处理的小鼠在心脏、脾脏和肾脏的重量方面没有任何显著差异(图12b)。通过he染色对心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的进一步组织学分析显示，ml-t7处理的小鼠没有明显的异常(图12c)。此外，血清生化检测显示，ml-t7处理后，alt和ast水平正常，表明50mg/kg ml-t7对小鼠没有明显的肝毒性(图12d)。同时，ml-t7不影响结肠长度(图12e)。此外，在ml-t7治疗的小鼠中，血液学评估未显示贫血、明显白细胞减少或白细胞增多的迹象(图12f)。我们未观察到血小板、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数发生明显变化(图12g)。我们还测试了该化合物的herg抑制作用，这是严重快速性心律失常的并发原因。结果表明，ml-t7以可接受的ic50》30μm并没有显著抑制herg钾通
道(图12h)。采用著名毒性预测软件derek对ml-t7进行毒性评估，也支持了ml-t7在56个测试项目中的安全性(图13)。
[0171]
综上所述，ml-t7在小鼠体内的耐受性良好，未导致明显的不良反应，提示ml-t7是一种安全有效的抗肿瘤小分子药物，值得进一步开发用于临床转化。
[0172]
11、ml-t7系列类似化合物具有增强nk细胞抗肿瘤活性的作用
[0173]
本发明进一步测试更多ml-t7类似化合物促进nk92细胞杀伤肿瘤细胞以及分泌效应因子ifn-γ、tnfα和cd107a的能力。结果显示该类化合物均可以显著促进nk92细胞杀伤能力和分泌效应细胞因子能力(图14)，提示该类化合物具有和mt-l7类似的抑制tim-3的免疫治疗潜能。
[0174]
综上所述，本发明成功地发现了一种小分子tim-3抑制剂，它可以增强ctl或car t细胞的过继转移治疗效果，以及nk细胞和dc的功能，并在临床前肿瘤模型中直接发挥抗肿瘤活性，抑制肿瘤进展。ml-t7单药或与pd-1抗体联合治疗的疗效支持其进一步的临床转化。
[0175]
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.化合物在制备tim-3抑制剂中的应用；其中，所述化合物为3,5-二取代-3a,6a-二氢螺[呋喃并[3,4-c]吡咯-1,2'-茚]-1',3',4,6(3h,5h)-四酮类化合物，其具有通式i所示的结构：其中，r1为：c
3-c6环烷基、具有0到2个取代的苯环、具有0到2个取代的苄基、具有0到2个取代的六元杂环、具有0到2个取代的五元杂环，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；r2为：c
3-c6环烷基、具有0到2个取代的苯环、具有0到2个取代的六元杂环、具有0到2个取代的五元杂环，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；m选自0、1或2的整数，r3在每次出现时各自独立地为c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，r1为：具有0到2个取代的苯环、具有0到2个取代的苄基，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；r2为：具有0到2个取代的苯环，所述的取代基各自独立地选自c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；m选自0、1或2的整数，r3在每次出现时各自独立地为c
1-c2的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、甲基氨基、氰基、硝基、卤代甲基、甲酰胺、羧基、酯基；化合物构型为消旋体或单一手性构型。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物是下列之一：
4.如权利要求1-3所述应用，其特征在于，所述化合物还包括其药学上可接受的盐、同位素衍生物、溶剂化物，或者其立体异构体、几何异构体、互变异构体，或者其前药分子、代谢产物。5.权利要求1-4中任一项所述应用中的化合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物。6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤；所述恶性肿瘤包括实体瘤和血液瘤；优选为实体瘤，所述实体瘤包括肝癌。7.一种组合物，其特征在于，所述组合物其至少包含权利要求1-4中任一项所述应用中的化合物。8.一种药物制剂，其特征在于，其至少包含权利要求1-4中任一项所述应用中的化合物。9.权利要求7所述组合物或权利要求8所述药物制剂在如下任意一种或多种中的应用：(a)抑制tim-3信号通路或制备tim-3信号通路抑制剂；(b)促进免疫细胞功能及制备促进免疫细胞功能的产品；(c)治疗与tim-3信号通路相关的疾病或制备与tim-3信号通路相关的疾病的产品；其中，所述(b)中，所述免疫细胞包括t细胞、调节性t细胞、树突状细胞、b细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞；更具体的，所述促进免疫细胞功能包括：(b1)提高原代cd8+细胞毒性t淋巴细胞和人的嵌合抗原受体t细胞的存活率和效应功能，包括但不限于清除肿瘤细胞或者病毒的功能；(b2)促进nk细胞的杀伤活性和dc抗原提呈能力，包括但不限于促进清除肿瘤细胞或者病毒的功能；所述(c)中，tim-3信号通路相关的疾病包括肿瘤、病毒感染性疾病以及自身免疫性疾
病；具体的，所述(c)应用包括：(c1)抑制肿瘤进展或制备抑制肿瘤进展的产品；(c2)协同增强pd-1阻断诱导的抗肿瘤反应或制备协同增强pd-1阻断诱导的抗肿瘤反应的产品；(c3)肿瘤免疫治疗或备肿瘤免疫治疗的产品。10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述产品为药物或实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。

技术总结
本发明属于免疫学和抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种靶向Tim-3的小分子化合物在肿瘤免疫治疗中的应用。本发明通过研究筛选一系列通过靶向Tim-3促进免疫细胞抗肿瘤功能的3,5-二取代-3a,6a-二氢螺[呋喃[3,4-c]并吡咯-1,2'-茚]-1',3',4,6(3H,5H)-四酮类小分子化合物。该类化合物显著提高原代CD8+细胞毒性T淋巴细胞和人的嵌合抗原受体T细胞的存活率和抗肿瘤活性，显著促进NK细胞的杀伤活性和DC抗原提呈能力，表现出与Tim-3阻断抗体相当的抑制肿瘤作用，有效地抑制抑制肿瘤进展以及协同增强PD-1阻断诱导的抗肿瘤反应，具有良好的潜在开发应用之价值。开发应用之价值。开发应用之价值。


技术研发人员：马春红 李春阳 刘新泳 马帅雅 田野 彭加丽 梁晓红 高立芬 武专昌 岳学田
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/23