一种组胺H2受体拮抗剂在制备治疗心肌纤维化药物中的应用的制作方法

一种组胺h2受体拮抗剂在制备治疗心肌纤维化药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及心肌纤维化药物领域，具体涉及一种组胺h2受体拮抗剂在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。


背景技术：

2.目前，心血管病占我国总死亡原因的44.26％-46.74％，给社会和人们带来的巨大经济负担，是重大的公共卫生问题。心肌纤维化是多种心血管疾病的共同病理特征，是导致心脏结构损伤和心肌功能障碍的关键原因之一。
3.临床上对心肌纤维化有治疗作用的药物包括血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等raas抑制剂，其他抗纤维化药物对心肌纤维化临床治疗效果不佳。总体来看，由于纤维化机制的不明确和肌成纤维细胞缺乏特异性靶点，抗纤维化治疗受到阻碍。
4.临床研究发现，雷尼替丁可能通过抑制成纤维细胞的增殖与胆管癌细胞的迁移发挥抗纤维化作用，具有治疗肺纤维化和胆管损伤的潜在效果，但在心肌纤维化中的作用尚不清楚。因此，发现雷尼替丁的临床新适应症，阐明其治疗心肌纤维化的潜在机制，为临床开发新的抗心肌纤维化药物提供理论和实验基础，缩短药物研发进程，缓解目前心肌纤维化治疗药物的窘迫处境，有一定社会效益和经济效益。


技术实现要素：

5.针对现有心肌纤维化治疗中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种组胺h2受体拮抗剂雷尼替丁在制备治疗心肌纤维化药物中的应用，为研发抗心肌纤维化新药物提供理论和实验基础。
6.本发明通过tac手术诱导压力超负荷模型模拟体内心肌纤维化过程，以及利用tgf-β1刺激小鼠胚胎成纤维细胞构建体外心肌纤维化模型进行实验研究。雷尼替丁通过作用于组胺h2受体，抑制成纤维细胞活化，降低成纤维细胞活化标志物α-sma的mrna水平和蛋白表达，降低胶原合成，减轻心肌纤维化，其抗心肌纤维化作用可能是通过抑制fak/src蛋白磷酸化发挥的。作为临床一线用药，雷尼替丁药理明晰，副作用小，安全性好。本发明提出雷尼替丁可以减轻压力超负荷诱导的心肌纤维化，对缓解心肌纤维化治疗药物的窘迫处境具有重大意义。
7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.根据本发明第一方面提供的一种组胺h2受体拮抗剂在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。
9.进一步的，所述组胺h2受体拮抗剂为雷尼替丁。
10.进一步的，所述心肌纤维化为tac诱导的心肌纤维化。
11.进一步的，所述组胺h2受体拮抗剂雷尼替丁是通过减少心肌胶原沉积，抑制心肌纤维化相关蛋白的表达发挥对心肌纤维化的治疗作用。
12.进一步的，所述心肌纤维化为tgf-β1诱导的细胞纤维化。
13.根据本发明第二方面提供的一种组胺h2受体拮抗剂在制备抑制成纤维细胞活化并减少胶原蛋白分泌的药物中的应用，所述组胺h2受体拮抗剂为雷尼替丁。
14.进一步的，所述雷尼替丁通过抑制fak和src蛋白磷酸化减少下游胶原纤维合成与沉积，进而减轻心肌纤维化。
15.根据本发明第三方面提供的组胺h2受体拮抗剂在下调α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ纤维化标志物的表达水平或减少tgf-β1诱导的胶原沉积的药物中的应用。
16.本发明具有如下优点：
17.本发明提供了一种组胺h2受体拮抗剂雷尼替丁在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。本发明通过tac手术构建小鼠心肌纤维化模型，以及利用tgf-β1刺激小鼠胚胎成纤维细胞构建体外心肌纤维化模型。经研究发现，雷尼替丁可以减少成纤维细胞活化标志物α-sma的mrna和蛋白表达，抑制collagenⅰ和collagenⅲ的转录与蛋白表达，降低心肌间质胶原含量，减轻心肌纤维化。fak/src的激活被认为可能促进成纤维细胞的迁移与肌成纤维细胞的转化，是纤维化疾病中潜在的治疗靶点。本发明发现，fak/src复合物参与心肌纤维化的发展过程，雷尼替丁通过抑制fak/src激活可以有效减少下游胶原纤维合成与沉积，进而减轻心肌纤维化程度。本发明提供的雷尼替丁治疗心肌纤维化的新适应症，对探索心肌纤维化作用机制和缓解心肌纤维化治疗药物的窘迫处境具有重大意义。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
19.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
20.图1为超声成像系统心脏形态与功能检测结果，(a.胸骨旁长轴m超图像；b.左心室收缩期内径统计图；c.左心室射血分数统计图；d.左心室短轴缩短率统计图。sham：假手术组；model：模型组。*p《0.05)；
21.图2为雷尼替丁对tac诱导的心肌组织形态结构的影响，(a.20倍光镜下he染色结果；b.20倍光镜下masson染色结果；c.20倍光镜下天狼猩红染色结果；d.masson染色纤维化统计结果；e.天狼猩红染色纤维化统计结果。sham：假手术组；model：模型组。***p《0.001；****p＜0.0001)；
22.图3为雷尼替丁抑制tgf-β1诱导的细胞总胶原蛋白合成(*p＜0.05)；
23.图4为雷尼替丁抑制成纤维细胞纤维化标志物的表达，(a.雷尼替丁抑制纤维化标志物蛋白表达；b.α-sma蛋白表达统计；c.collagenⅰ蛋白表达统计；d.collagenⅲ蛋白表达统计；e.雷尼替丁抑制α-sma的mrna表达；f.雷尼替丁抑制collagenⅰ的mrna表达；g.雷尼替丁抑制collagenⅲ的mrna表达。*p＜0.05；**p＜0.01；****p＜0.0001)；
24.图5为雷尼替丁抑制小鼠成纤维细胞fak和src蛋白磷酸化，(a.雷尼替丁抑制纤维
化细胞中fak、p-fak、src和p-src的蛋白表达；b.fak蛋白表达统计结果；c.p-fak蛋白表达统计结果；d.src蛋白表达统计结果；e.p-src蛋白表达统计结果。**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001)。
具体实施方式
25.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.主要试剂与药品见表1：
27.表1实验所用试剂与药品
28.29.[0030][0031]
实施例1
[0032]
1、tac小鼠模型建立与实验分组
[0033]
通过横向主动脉弓缩窄术构建压力超负荷诱导的小鼠心肌纤维化模型。手术2周后利用超声成像系统检测主动脉弓结扎处血流动力学指标，判断造模是否成功。假手术组仅打开胸腔并进行缝合，不对主动脉弓结扎缩窄。
[0034]
手术2周后剩余25只tac模型鼠存活。根据体重随机分组，持续灌胃给药2周(假手术组和模型组小鼠灌胃0.5％羧甲基纤维素钠)。实验分组如下：假手术组(n＝6)，tac模型组(n＝7)，val组(阳性药缬沙坦10mg/kg，n＝6)，rn组(雷尼替丁400mg/kg，n＝6)。各组药物剂量通过小鼠与人体表面积的转换系数进行计算(0.0026)。
[0035]
2、超声成像系统心脏形态与功能检测
[0036]
tac手术后，使用visualsonics公司vevo1100小动物超声成像系统(探头频率30mhz)进行超声心动图评估各组小鼠心脏功能。具体步骤如下：将小鼠放入诱导盒中，设置异氟烷浓度为2％进行麻醉。然后仰卧位置于生理信息监测平台上，此时调整异氟烷浓度为0.5％。在小鼠眼睛上涂抹眼部保护润滑膏以防止眼部干燥；将小鼠脚掌固定在涂抹少量导电胶的生理信息监测台的铜片上，以便获得小鼠ecg和呼吸等生理信息。利用脱毛膏脱去小鼠胸部毛发，用湿润的棉签擦拭干净。采集主动脉弓切面的脉冲多普勒图像，获取小鼠主动脉弓结扎处血流速度，判断tac造模手术是否成功。采集胸骨旁左室长轴切面b超、m超图像，用配套的分析软件测量收缩期左心室内径(lvid；s)、左心室射血分数(ejectionfraction，ef％)和左室短轴缩短率(fractional shortening，fs％)，评估小鼠心脏功能。
[0037]
3、取材
[0038]
小鼠称重，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉。从小鼠剑骨处皮肤开始，沿胸骨下缘剪开皮肤，打开胸腔，暴露心脏。从左心尖部倾斜进针，抽取心尖血液约400μl，转移至含有肝素钠的取血管中，摇晃取血管使血液与肝素钠充分接触，静置反应10min。3000g离心10min，小心吸取上清(血浆)至1.5ml离心管中，负80℃保存。剪开右心耳，从取血进针处缓慢灌注生理盐水至肝脏发白后继续灌流1ml4％多聚甲醛。剪下心脏，切下心室部分放入的4％多聚甲醛中固定。
[0039]
4、病理染色
[0040]
小鼠心脏经生理盐水、4％多聚甲醛灌注后，切下心室部分置于4％多聚甲醛中固定48h。经70％、80％、90％梯度乙醇溶液各30min，再放入95％、100％乙醇溶液各2次，每次20min。然后将组织依次放入乙醇与二甲苯等量混合液15min，依次放入不同的二甲苯缸中，每次15min，至组织透明。将组织放入二甲苯与石蜡等量的混合液中，15min后再依次放入2个不同的石蜡缸中透蜡各60min。镊子和石蜡模子先在酒精灯上稍加热，倒入少许石蜡，夹取组织并将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。放上包埋盒，继续倒入熔蜡。切片前将包埋了组织的石蜡块置于冷冻台上冰冻30min，利用石蜡切片机切片(4μm)，切好的薄片于40℃水浴锅中展片，用粘附载玻片捞出，58℃烘箱烘片2h备用。制好的切片在使用前放入烘箱58℃烘片1h，再进行脱蜡、染色等步骤。
[0041]
4.1he染色
[0042]
切片常规脱蜡至水(依次放入两罐新的二甲苯中各10min，两罐新的无水乙醇各5min、85％乙醇溶液5min、75％乙醇溶液5min，最后用蒸馏水洗2min)。滴加苏木素染色5min，自来水冲洗掉染液。滴加分化液分化30s后自来水冲洗30s。返蓝液返蓝1min，自来水冲洗。伊红染色1min，自来水冲洗。最后分别在75％，85％，95％和100％梯度乙醇溶液中浸洗5s脱水，放入二甲苯中透明1min。滴加中性树脂封片后镜检。
[0043]
4.2masson染色
[0044]
切片脱蜡至水后，滴加新配制的weigert铁苏木素染色液染核5min。用酸性乙醇分化液分化15s后水洗。滴加masson蓝化液返蓝3min，水洗后滴加丽春红品红染色液染色4min，再用弱酸工作液洗1min。滴加磷钼酸溶液染色2min，弱酸工作液洗1min。滴加苯胺蓝染色液染色1min，弱酸工作液洗1min。常规脱水透明，中性树脂封固后镜检。
[0045]
4.3改良天狼猩红染色
[0046]
切片脱蜡至水，滴加新配制的铁苏木素染色液染色5min，水洗5min。滴加天狼猩红染色液染色12min，水洗表面染液。脱水透明后滴加中性树脂封固，在显微镜下观察。
[0047]
5、心肌纤维化细胞模型建立与分组
[0048]
小鼠胚胎成纤维细胞系(nih3t3)培养于含有10％胎牛血清(fbs)、1％青/链霉素的高糖dmem培养基。培养细胞至70％融合时，吸出培养液，用pbs清洗后更换为不含fbs的培养基饥饿12h。吸出培养液，用pbs清洗。control组更换不含fbs的培养基继续培养，模型组更换含15ng/mltgf-β1的培养基作用48h。治疗组用15ng/ml的tgf-β1刺激后分别添加val(1μm)，bhm(5μm)，dlt(10μm)共同作用48h后，收集细胞进行检测。
[0049]
6、天狼猩红染色法测定细胞总胶原蛋白
[0050]
细胞接种至十二孔板，待细胞贴壁至60％-70％融合时给予tgf-β1(15ng/ml)和对应浓度药物干预，共同作用48h后，吸去细胞培养液并用pbs清洗细胞。每孔加入1ml0.05m乙酸，用细胞刮刀刮下细胞，准备样品和标准品溶液。向1.5ml离心管中添加100μl空白、稀释的标准品溶液和样品。每管加入500μl天狼猩红溶液，涡旋并在室温下孵育20min。10000rpm离心3min获得红色胶原沉淀，小心移除上清液。向每管中添加500μl洗涤液，涡旋使沉淀重新悬浮在洗涤液中。10000rpm离心3min，吸去上清液。向每管中添加250μl提取缓冲液溶解沉淀。用酶标仪读取530nm处的od值。
[0051]
7、rt-qpcr
[0052]
收集细胞，利用trizol法提取rna。根据反转录试剂盒说明进行反转录操作，反应结束后得到cdna。选择gapdh作为内参，采用sybrgreeni realtimepcr检测collagenⅰ、collagenⅲ和α-sma的表达量。根据在ncbi中检索到的序列在primer5或bd中设计和合成引物，序列编号见表2。pcr反应按以下程序进行：95℃2min；95℃15s，58℃30s，40个循环。熔解曲线建立程序60℃～95℃。每个样检测3个复孔。数据采用2
^
‑△△
ct
法进行分析。
[0053]
8、westernblot
[0054]
收集细胞用pbs清洗后加入ripa裂解液，随后按照比例(pmsf：ripa＝1:100)加入pmsf，收集备用。利用bca法定量蛋白质并绘制标准曲线。取各组样品总蛋白上样，进行sds-page，转膜后以5％bsa封闭。一抗孵育后用tbst洗涤，然后孵育二抗。洗膜后加入ecl显色液显影，利用凝胶成像系统和软件分析每个条带的灰度值和蛋白表达情况。
[0055]
9、统计分析
[0056]
数据分析采用mean
±
sd进行比较分析，应用graphpadprism8进行数据处理并绘图，检验方差齐性用anova单因素方差分析，两两比较用t检验。显著性水平取α＝0.05，p《0.05认为差异有统计学意义。
[0057]
表2引物序列
[0058][0059][0060]
实验结果
[0061]
1、心肌纤维化小鼠心脏形态与功能检测
[0062]
为了探索雷尼替丁对tac模型诱导的心肌纤维化的影响，术后4周进行了心脏超声成像以测定小鼠的心脏形态与心功能。超声实验结果显示(如图1所示)，假手术组小鼠收缩期左心室内径(lvids)统计结果为2.185
±
0.21mm，tac模型组小鼠lvids统计结果为2.417
±
0.14mm，显著高于假手术组(p＜0.05)。假手术组小鼠左心室射血分数(ef％)统计结果为62.14
±
2.43％，左室短轴缩短率(fs％)统计结果为32.48
±
1.61％，tac术后四周，小鼠ef％和fs％统计结果分别为55.81
±
2.95％和28.30
±
1.98％，显著低于假手术组(p＜0.05)，提示tac诱导小鼠左心室收缩功能障碍。雷尼替丁治疗后，小鼠的lvids恢复至2.159
±
0.56mm，ef％恢复至66.38
±
11.49％，fs％也恢复至36.43
±
8.86％，均恢复至正常水平。
[0063]
2、雷尼替丁改善tac诱导的小鼠心肌纤维化
[0064]
he染色结果显示，假手术组小鼠心肌细胞结构完整且轮廓分明，心肌纤维结构规则、排列整齐而紧密。tac模型组心肌细胞形态不规则，心肌纤维排列紊乱，出现断裂、结缔
组织增生，局部可见炎性细胞浸润。与tac模型组相比，val治疗组心肌纤维排列较整齐，纤维化特征明显改善。rn治疗组光镜下可见细胞形态较规则，细胞间空隙减小，间质内少量胶原纤维增生及炎性细胞浸润，较tac模型组有一定改善，见图2a。masson染色与天狼猩红染色结果显示，与假手术组相比，tac模型组细胞排列紊乱，心肌间质出现大量胶原纤维阳性染色(masson染色：蓝色纤维染色，天狼猩红染色：红色纤维染色)，大面积纤维化替代正常心肌组织。rn治疗后可见细胞形态较规则，胶原纤维阳性染色较少，与模型组相比有明显改善(p＜0.001)，见图2b-e。
[0065]
3、雷尼替丁抑制tgf-β1诱导的细胞纤维化
[0066]
(1)雷尼替丁减少成纤维细胞胶原蛋白含量
[0067]
为了进一步验证rn对心肌纤维化的影响，通过添加15ng/ml的tgf-β1诱导纤维化细胞模型，利用天狼猩红法测定rn治疗后的总胶原浓度。实验结果显示，与空白对照组相比，tgf-β1诱导细胞内胶原蛋白含量显著增多(p＜0.05)。1μm的rn治疗可显著减少成纤维细胞中胶原蛋白的含量，见图3。
[0068]
(2)雷尼替丁抑制成纤维细胞中纤维化标志物的表达
[0069]
α-sma是成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的标志物，collagenⅰ和collagenⅲ是心脏中最主要的两种胶原。rt-qpcr和westernblot结果显示，与空白对照组相比，tgf-β1刺激后小鼠成纤维细胞中α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ的mrna(p＜0.0001)和蛋白(p＜0.01)表达均显著升高。rn治疗后，细胞内α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ表达水平低于tgf-β1模型组，其中10μm的rn治疗效果更加明显，见图4。
[0070]
4、雷尼替丁通过调节fak/src表达抑制心肌纤维化的发展
[0071]
进一步利用westernblot探索rn可能参与的调控机制。结果显示，tgf-β1诱导小鼠成纤维细胞fak和src磷酸化显著上调，提示rn可能通过调节下游fak/src磷酸化抑制小鼠心肌纤维化的发展，见图5。
[0072]
由以上实施例可知，本发明提供了一种组胺h2受体拮抗剂雷尼替丁在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。本发明通过tac构建小鼠心肌纤维化模型，验证雷尼替丁的体内药理学作用。rn治疗后，小鼠的心脏收缩功能得到一定改善，心肌间质胶原纤维明显减少，其减轻心肌纤维化的效果与临床用药缬沙坦相当。同时，本发明利用tgf-β1刺激nih3t3细胞诱导纤维化细胞模型，分别给予rn低(0.1μm)、中(1μm)和高剂量(10μm)进行体外干预治疗。结果显示，雷尼替丁通过参与调节fak和src的激活，抑制fak和src蛋白的磷酸化，进而下调α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ的mrna和蛋白表达水平，显著减少细胞总胶原合成，具有抑制心肌纤维化的作用。本发明结果进一步证实了fak和src在心肌纤维化过程中的重要作用，为雷尼替丁在心肌纤维化治疗中的进一步利用提供了新的理论依据，促进临床治疗心肌纤维化药物的研究与开发，可以缓解目前心肌纤维化治疗药物的窘迫处境，减轻患者负担。
[0073]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0074]
[0075]
[0076]

技术特征：
1.一种组胺h2受体拮抗剂在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组胺h2受体拮抗剂为雷尼替丁。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心肌纤维化为tac诱导的心肌纤维化。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组胺h2受体拮抗剂是通过减少心肌胶原沉积，抑制心肌纤维化相关蛋白的表达发挥对心肌纤维化的治疗作用。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心肌纤维化为tgf-β1诱导的细胞纤维化。6.一种组胺h2受体拮抗剂在制备抑制成纤维细胞活化并减少胶原蛋白分泌的药物中的应用，其特征在于，所述组胺h2受体拮抗剂为雷尼替丁。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述雷尼替丁通过抑制fak和src蛋白磷酸化减少下游胶原纤维合成与沉积，进而减轻心肌纤维化。8.组胺h2受体拮抗剂在下调α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ纤维化标志物的表达水平或减少tgf-β1诱导的胶原沉积的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种组胺H2受体拮抗剂在制备治疗心肌纤维化药物中的应用，具体涉及心肌纤维化药物领域。所述组胺H2受体拮抗剂为雷尼替丁。本发明通过TAC手术诱导压力超负荷模型模拟体内心肌纤维化过程，以及利用TGF-β1刺激小鼠胚胎成纤维细胞构建体外心肌纤维化模型进行实验研究。雷尼替丁通过作用于组胺H2受体，抑制成纤维细胞活化，降低成纤维细胞活化标志物α-SMA的mRNA水平和蛋白表达，降低胶原蛋白合成，减轻心肌纤维化，其抗心肌纤维化作用可能是通过抑制FAK/Src蛋白磷酸化发挥的。作为临床一线用药，雷尼替丁药理明晰，副作用小，安全性好。本发明提出雷尼替丁可以减轻压力超负荷诱导的心肌纤维化，对缓解心肌纤维化治疗药物的窘迫处境具有一定意义。治疗药物的窘迫处境具有一定意义。治疗药物的窘迫处境具有一定意义。


技术研发人员：陈欣 张婕鑫 杨利文 唐宋元 李昆蔚 郑巧奇 呼永河 刘华伟
受保护的技术使用者：成都市第三人民医院
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/23