磷酸化α-突触核蛋白抗原表位肽、抗体及测定唾液中磷酸化α-突触核蛋白的试剂盒及其在帕金森病诊断中的应用的制作方法

磷酸化
α-突触核蛋白抗原表位肽、抗体及测定唾液中磷酸化
α-突触核蛋白的试剂盒及其在帕金森病诊断中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体地涉及磷酸化α-突触核蛋白抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的特异性抗体、所述抗体制备的测定唾液中磷酸化α-突触核蛋白试剂盒以及所述试剂盒在帕金森病诊断中的应用。


背景技术：

2.帕金森病(parkinson
′
s disease)是一种常见的中老年神经系统退行性疾病，主要以黑质多巴胺能神经元进行性退变和路易小体形成的病理变化，纹状体区多巴胺递质降低、多巴胺与乙酰胆碱递质失平衡的生化改变，震颤、肌强直、动作迟缓、姿势平衡障碍的运动症状和睡眠障碍、嗅觉障碍、自主神经功能障碍、认知和精神障碍等非运动症状的临床表现为显著特征。流行病学调查研究显示欧美国家60岁以上帕金森病患病率达到1％，80岁以上超过4％，我国65岁以上人群患病率为1.7％。随着疾病的进展，帕金森病的运动和非运动症状会逐渐加重，一方面会损害患者本身的日常活动，另一方面，也会带来巨大的社会和医疗负担。
3.帕金森病现行的诊断标准包括《中国帕金森病诊断标准(2016版)》、《运动障碍学会帕金森的临床诊断标准(mds-2015)》，二者均是在英国脑库帕金森病研究学会(uk pd brain bank)1997年制定的《帕金森病临床诊断标准》基础上进行完善。以上诊断标准对帕金森病的诊断主要遵循纳入、排除/警示、支持三步法则。临床确诊帕金森病(pd)需要首先判定患者是否出现运动迟缓(自主运动启动缓慢、重复运动速度和幅度进行性减少)或静止性震颤(4-6hz)/肌强直这两项主征的一项，且同时具备不符合绝对排除标准，至少两条支持性标准，且没有警示征象的条件。排除标准和警示征象包括多巴胺类药物治疗效果，患者功能及影像学检验结果。支持性标准包括对多巴胺能药物治疗具有明确且显著的有效应答、出现左旋多巴诱导的异动症、临床体格检查记录的单个肢体静止性震颤(既往或本次检查)及存在嗅觉丧失或心脏mibg闪烁显像法显示存在心脏去交感神经支配。所有核心主征的检查必须按照mds-统一帕金森病评估量表(mds-updrs)中所描述的方法进行。
4.由于缺乏客观的检查手段，目前pd的诊断仍依据长期临床症状的观察及服用多巴胺能类药物是否有效,且pd症状与多系统萎缩,进行性核上麻痹及皮质基底节变性病等在临床症状及病理基础上存在很多重合,以临床症状评估为诊断关键指标不稳定，其漏诊及误诊率均较高，给pd的诊断及治疗带来很大不便。
5.鉴于帕金森病的诊断现状，临床上一直在尝试寻找一种稳定可靠、能对帕金森病进行客观诊断及疗效评估的生物学标记物，目前研究较多的是脑影像学和体液生物标记物。
6.帕金森病属于神经系统变性疾病，其发生与大脑结构和功能的改变有着密切关系，脑影像学是神经变性疾病研究的重要工具。其中经颅超声、磁共振和正电子发射计算断层显像均能够检测到帕金森病病理特征中关键改变，对于帕金森病的诊断与鉴别诊断上有
一定作用。经颅超声无创且操作方便，研究发现超过90％帕金森患者出现黑质异常，即强回声(sn+)现象，但只针对pd可能性较高人群，仍需优先进行上述临床诊断。血氧水平依赖功能磁共振成像显示的pd患者与正常人兴奋性的差异缺乏具体量化标准,仍然能够受到诊断者主观意识的影响,但由于目前的磁共振技术还受到诸多影响因素的制约，如疾病的异质性；缺少正常脑的影像学标准；磁共振对受试者生理或外源化学物质变化的高度敏感性(如激动、咖啡、抽烟、温度等)；统计学分析方法局限性；测量变量的局限性等，且由于个体差异,不同个体间小脑－丘脑－皮质环路及纹状体－丘脑－皮质环路兴奋性受到很多外在因素的影响,给pd诊断带来困难，其性能还远达不到临床应用所需的要求。pet突触前膜多巴胺转运体是目前认为最敏感的pd标志物,灵敏度高，可作为纹状体功能状态的评价指标，能够大大减少帕金森病的误诊率,同时在帕金森病鉴别诊断方面也起到了关键作用。但由于该项操作扫描时间长,费用高且对操作者技术及设备要求较高,另外pet示踪剂可能增加电离辐射的基因毒性。故影像学暂不能作为帕金森病的诊断指标应用于临床实践。
7.目前认为，帕金森病的病理特征为路易小体，即黑质致密部的多巴胺能神经元大量变性丢失，残存的神经元胞质内出现的嗜酸性包涵体。而在pd患者的神经细胞中发现的路易小体，含有大量ser129位点磷酸化的α-突触核蛋白，对比研究发现，正常人脑内仅4％以下的a-syn在ser129位点被磷酸化修饰，但在pd患者脑内形成的路易小体中至少有90％的a-syn在此位点被磷酸化，提示ser129位点磷酸化的a-syn易于聚集，在pd发病机制中至关重要。因此，研究者希望分析磷酸化α-突触核蛋白(p-α-syn)作为帕金森病生物标志物的潜力。然而，由于脑脊液样本较难获取，相关研究往往来自小样本临床，对应脑脊液p-α-syn水平和结构成像显示帕金森病的结果与整体病程关联中断，仍需更多的纵向研究来支持它们的潜在价值。血液p-a-syn水平受红细胞内α-syn及外泌体α-syn的影响，缺乏区分能力，使其无法作为帕金森病诊断的个体生物标志物，诊断准确性较低，无法被认为是pd的单一诊断或预后生物标志物。
8.随着研究的深入，发现p-α-syn并不局限于中枢神经系统和血液，在唾液中也检测到磷酸化α-突触核蛋白的存在。唾液标本不仅具有无创,简便易收集特点，且最近有研究证明分泌唾液的下颌下腺是pd早期的受累靶器官，提示唾液磷酸化α-突触核蛋白有可能成为pd早期筛查的潜在生物标记物。
9.目前的临床研究尚未有用于帕金森病诊断的唾液磷酸化α-突触核蛋白测定试剂盒。本领域计划开发一种可测定人唾液中磷酸化α-突触核蛋白浓度水平的试剂盒，为帕金森病的辅助诊断和早期筛查提供一个更切实可行的客观指标。


技术实现要素：

10.为了解决现有技术存在的问题，本发明筛选得到一种磷酸化α-突触核蛋白特异性抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基序列为如下两者之一：
11.tyr-arg-glu-met-pro-ser(po3h2)-glu-glu-gly
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)或
12.tyr-glu-gly-ile-leu-glu-asp-met-pro-val-asp-pro-asp-asn-glu-ala
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)。
13.本发明由此提供一种特异性抗体，其是通过使上述的p-α-syn特异性抗原表位肽(1)偶联载体蛋白后免疫动物制备得到的单克隆抗体。
14.本发明由此提供一种特异性抗体，其是通过使上述的p-α-syn特异性抗原表位肽
(2)偶联载体蛋白后免疫动物制备得到的单克隆抗体或者多克隆抗体。
15.本发明进而提供了一种唾液磷酸化α-突触核蛋白测定试剂盒，该试剂盒包括：固相载体、特异性抗体、标记物和p-α-syn校准品，所述特异性抗体为上文提及的特异性抗体。
16.根据本发明，p-α-syn测定试剂盒用免疫测定方法研制，可使用酶联免疫吸附法(elisa)、化学发光免疫测定法(clia)、荧光免疫层析法或胶体金测定法中的任一种。
17.根据本发明，固相载体可以是微孔反应板、磁性微球或硝酸纤维素膜(nc膜)中的一种。
18.根据本发明，标记物可以是辣根过氧化物酶hrp、碱性磷酸酶ap、生物素、发光物质、荧光微球、胶体金等。例如，用于酶联免疫吸附(elisa)试剂盒时标记物优选为辣根过氧化物酶hrp；用于化学发光免疫测定(clia)试剂盒时标记物优选为碱性磷酸酶ap；用于荧光免疫层析试剂盒时标记物优选为荧光微球；用于胶体金测定试剂盒时标记物为胶体金。
19.根据本发明，磷酸化α-突触核蛋白校准品/质控品为经稀释的提取的磷酸化α-突触核蛋白。
20.特异性抗体分别由抗原表位肽(1)及抗原表位肽(2)偶联载体蛋白后免疫动物(小鼠、大鼠、兔、羊等)制备而成。
21.本发明中，抗原表位肽(1)制备的特异性抗体为p-α-syn特异性抗体(1)，p-α-syn特异性抗体(1)为单克隆抗体；抗原表位肽(2)制备的特异性抗体为p-α-syn特异性抗体((2)，p-α-syn特异性抗体(2)可以为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体；载体蛋白可以是牛血清白蛋白bsa、卵清蛋白ova或匙孔血蓝蛋白klh，优选为匙孔血蓝蛋白klh。
22.在一种优选实施方案中，本发明试剂盒为化学发光免疫测定法试剂盒，用化学发光免疫测定法(clia)结合双抗体夹心法原理研制。
23.在化学发光免疫测定法试剂盒的具体实施方案中，所述固相载体为磁性微珠，所述磁性微珠与所述p-α-syn特异性抗体(1)直接或者间接相连形成磁分离试剂；所述磁分离试剂优选为包被p-α-syn特异性抗体(1)的免疫磁珠或者为将链霉亲和素与p-α-syn特异性抗体(1)相连的磁珠。
24.在化学发光免疫测定法试剂盒的具体实施方案中，所述试剂盒还包含发光底物。发光底物的实例包括但不限于鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物或(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物。
25.在一种具体实施方案中，所述试剂盒包括：磁分离试剂、酶标记α-突触核蛋白单克隆抗体[p-α-syn特异性抗体(2)]、磷酸化α-突触核蛋白校准品/质控品、洗涤液、化学发光底物。其中，所述磁分离试剂为所述磁分离试剂优选为包被p-α-syn特异性抗体(1)的免疫磁珠或者为将链霉亲和素与为p-α-syn特异性抗体(1)相连的磁珠；所述α-突触核蛋白单克隆抗体由α-突触核蛋白特异性抗原表位肽(2)偶联载体蛋白后免疫动物制备。
[0026]
本发明还进一步提供了本发明的试剂盒在制备检测、诊断帕金森病的产品中的应用。
[0027]
将本发明的试剂盒用于制备诊断帕金森病产品时，将试剂盒测得的受试者样本磷酸化α-突触核蛋白浓度与对照参考区间(即健康受试者的浓度水平)进行对比，如果受试者样本磷酸化α-突触核蛋白浓度高于对照参考区间的浓度，则受试者有患帕金森病的风险。
[0028]
优选地，所述检测为唾液样本检测。进一步优选地，所述检测为酶联免疫吸附测定
(elisa)法、化学发光测定(clia)法、荧光免疫层析测定盒、胶体金免疫测定法中任一种；更进一步优选为化学发光测定(clia)法。
[0029]
在化学发光法的检测中，检测灵敏度高(最低检测限为7.8pg/ml)，线性范围宽，可以不用稀释直接测量浓度高达2000pg/ml的样品，准确度高(回收试验的回收率93.45％)，精密度高(cv小于10％)，反应时间短，15分钟可出结果，大大提高了检测效率。自动化程度高，无需人工操作，减少了人为操作误差。
[0030]
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0031]
1、本发明将磷酸化α-突触核蛋白作为标志物应用到制备帕金森病辅助诊断试剂盒上，克服了目前临床帕金森病诊断过程所用指标过于主观，客观性不足的缺陷，且取样方便无创，为帕金森病的辅助诊断和筛查提供了一个更为准确可靠和方便的客观指标。
[0032]
2、本发明制备的试剂盒需具有良好的诊断敏感性、特异性和重复性，符合临床应用需求。
[0033]
3、本发明制备的特异性抗体(1)及特异性抗体(2)能够高度特异地与样本中的磷酸化α-突触核蛋白结合。
[0034]
4、本发明筛选的两段磷酸化α-突触核蛋白特异性抗原表位肽具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体或多克隆抗体。
附图说明
[0035]
图1显示了对照与帕金森病患者的唾液磷酸化α-突触核蛋白水平(采用实施例4制备的试剂盒测试结果)
[0036]
图2显示了唾液磷酸化α-突触核蛋白对帕金森病诊断的roc曲线(采用实施例4制备的试剂盒测试结果)
具体实施方式
[0037]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0038]
实施例1：磷酸化α-突触核蛋白特异性抗原表位肽的筛选
[0039]
采用的氨基酸序列是本领域已知的，可以在ncbi等专业数据库中查到(genbank:aal15443.1)。
[0040]
发明人经过大量的理论研究和实验摸索，考虑亲水性、抗原性及是否易于合成等因素，最终筛选得到如下两种具有良好的抗原性的抗原表位肽，其氨基酸序列为：
[0041]
tyr-arg-glu-met-pro-ser(po3h2)-glu-glu-gly
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)或
[0042]
tyr-glu-gly-ile-leu-glu-asp-met-pro-val-asp-pro-asp-asn-glu-ala
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)。
[0043]
后续实验表明，上述抗原表位肽(1)和抗原表位肽(2)有以下特点：
[0044]
a.具有抗原性；
[0045]
b.与载体蛋白连接后可作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；
[0046]
c.制备的抗体可特异性地与样本中的磷酸化α-突触核蛋白结合。
[0047]
实施例2：抗原表位肽(1)以及抗原表位肽(2)的合成
[0048]
1、所用原料：hmp resin(p-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，购自sigma公司)；fmoc-aa(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，购自merck公司)；fmoc-ser(po(obzl)oh)-oh(侧链单苄基保护的磷酸化丝氨基酸，购自merck公司)：nmp(氮甲基吡咯烷酮，购自sigma公司)；dcm(二氯甲烷，购自中原化工公司)；meoh(甲醇，购自中原化工公司)；piperidine(哌啶，购自sigma公司)；dmap(二甲基氨基吡啶，购自sigma公司)；hobt(羟基苯并三唑，购自sigma公司)；dcc(二环己基碳二亚胺，购自sigma公司)；tfa(三氟乙酸，购自sigma公司)；edt(1,2-乙二硫醇，购自sigma公司)；硫代苯甲醚，购自广州伟伯化工有限公司；结晶苯酚，购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈，购自国药集团化学试剂有限公司。
[0049]
2、使用仪器：多肽自动合成仪，型号431a，购自abi公司；旋转蒸发仪，型号r－201，购自上海申顺公司；高效液相色谱仪，waters 600，购自美国waters公司；冷冻干燥机，型号vfd-2000，购自北京博医康公司。
[0050]
3、合成方法和过程：
[0051]
称取hmp树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmolhmp树脂置于美国abi431a型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。
[0052]
4、合成抗原表位肽(1)和抗原表位肽(2)的纯化：
[0053]
采用高效液相色谱分离纯化：
[0054]
条件：色谱柱：c8 10
×
100mm，购自美国waters公司
[0055]
色谱仪：waters 600，美国waters公司
[0056]
流动相：a：0.1％tfa(三氟乙酸)水溶液
[0057]
b：0.1％tfa(三氟乙酸)于60％乙腈
[0058]
检测波长：214nm
[0059]
流速：4ml/分钟
[0060]
洗脱梯度：20-60％b，30分钟
[0061]
hplc(高效液相色谱)分析
[0062]
色谱柱：c184.6
×
150mm，购自美国waters公司
[0063]
流动相：a：0.1％tfa(三氟乙酸)水溶液
[0064]
b：0.1％tfa(三氟乙酸)于乙腈
[0065]
检测波长：214nm
[0066]
流速：1ml/分钟
[0067]
洗脱梯度：0-60％b，30分钟
[0068]
肽段分析结果显示纯化后的抗原表位肽(1)以及抗原表位肽(2)的纯度均为95％以上。
[0069]
实施例3：特异性抗体制备
[0070]
1、抗原的制备：
[0071]
用双偶氮联苯胺二氯化物(bis-diazotizedbenzidine dichloride,bdb)法将抗原表位肽(1)或抗原表位肽(2)与载体蛋白klh(钥孔血蓝蛋白)连接制备成抗原(1)或抗原(2)。
[0072]
取实施例1制备的抗原表位肽(1)或抗原表位肽(2)20.0mg，用0.2m硼酸盐缓冲液(ph 9.0)溶解；取klh 6.25mg/ml 7.36ml，冷却至0℃，取bdb 1ml，放入两者置于冰水混合物中混合避光，在摇床上反应1-1.5h，反应完成后用0.2naoh调ph至9.0，透析过夜后分装，-20℃保存。
[0073]
硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/l硼砂80ml，加0.2mol/l硼酸20ml混合而成。
[0074]
2、免疫动物制备单克隆抗体：
[0075]
2.1、取上述制备的抗原(1)或抗原(2)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后，免疫balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，融合前连续加强免疫两次，之后取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％peg(mw4000)(购自中原化工公司)介导进行融合，并用hat条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入co2培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接elisa进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。
[0076]
2.2、将balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2
×
106个/只，10天后收集腹水。
[0077]
2.3、测定抗体效价：用间接elisa方法测定制备的单克隆抗体的效价，结果显示单抗的效价达到1:32000。
[0078]
3、免疫动物制备多克隆抗体：
[0079]
3.1、选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将2mg上述制备的抗原(2)分别与等体积的弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔2周加强免疫一次，抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后，以1ml/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血,分离血清。
[0080]
3.2、测定抗体效价：用间接elisa法测定多克隆抗体的效价，结果显示抗体效价达到1:32000。
[0081]
3.3、取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。
[0082]
4、分离纯化抗体：
[0083]
将需要上样的特异性抗体，先用平衡缓冲液(0.02m，pb，ph 8.0)，透析至ph一致；装柱，与蛋白层析系统连接，用平衡缓冲液流洗至ph 8.0；上样，将要纯化的磷酸化α-突触核蛋白抗体加入柱子，全部进样后，用洗脱缓冲液(0.05m pb ph8.0)流洗，至蛋白核酸检测仪显示开始出峰时，开始收集蛋白溶液。收集至峰下降平缓时停止收集。用l5s紫外可见分光光度计(博大精科生产)测量并计算出抗体的浓度，并将纯化特异性抗体分装后保存于-20℃。
[0084]
5、抗体的特异性鉴定
[0085]
以elisa进行检测。分别以gfap蛋白、s-100b蛋白(均购自上海联硕公司)为检测抗原包被elisa板，通过elisa分别检测所制备的特异性单克隆抗体或多克隆抗体与该磷酸化α-突触核蛋白的特异性反应，以正常balb/c小鼠血清或兔血清作阴性对照，pbs液作空白对照。
[0086]
结果：抗原(1)和抗原(2)制备的单克隆抗体(1)和单克隆抗体(2)以及抗原(2)制备的多克隆抗体(2)均只与磷酸化α-突触核蛋白反应为阳性(p/n》2.1)，而与gfap蛋白、s-100b蛋白反应为阴性，说明本发明的单克隆抗体(1)、(2)以及多克隆抗体(2)分别具有特异性。
[0087]
实施例4：磷酸化α-突触核蛋白的化学发光试剂盒的制备
[0088]
1、磁分离试剂(包被单克隆抗体(1)免疫磁珠工作液)的制备
[0089]
(1)磁珠的洗涤
[0090]
取1ml 0.1m mes(ph6.0)缓冲液到包被管中，加入2mg jsr磁珠母液(深圳锐思生物技术有限公司)，涡旋混匀1min。将包被管置于磁分离架上1min，弃去上清液。向包被管中加入1ml 0.1m mes(ph6.0)缓冲液涡旋混匀1min。重复以上过程2次。
[0091]
(2)磁珠的活化
[0092]
向包被管中加入800ul 0.1m mes(ph6.0)缓冲液后，加入100ul nhs(10mg/l)溶液，涡旋混匀1min。向包被管中加入，加入100ul edc(10mg/l)溶液。将旋转混合器置于温度25
±
1℃的恒温环境中，将包被管置于旋转混合器上，设定旋转混合器转速50
±
1rpm，反应30分钟。
[0093]
(3)用活化好的磁珠包被单克隆抗体(1)
[0094]
向包被管中加入1ml 0.1m mes(ph6.0)缓冲液，涡旋混匀1min。向包被管中加入12～16ul单克隆抗体(1)10mg/ml，涡旋混匀1min。在室温条件，向包被管中加入1ml 0.1m mes(ph6.0)缓冲液，涡旋混匀1min。将旋转混合器置于温度25
±
1℃的恒温环境中，将包被管置于旋转混合器上，设定旋转混合器转速50
±
1rpm，反应2小时。
[0095]
(4)磁珠封闭
[0096]
将包被管置于磁分离架上1min后弃去上清液，向包被管中加入1ml 0.05m tris(ph7.4)缓冲液涡旋混匀。重复操作两次。将旋转混合器置于温度25
±
1℃的恒温环境中，将包被管置于旋转混合器上，设定旋转混合器转速50
±
1rpm，反应30分钟。
[0097]
(5)清洗
[0098]
封闭完成后，将包被管置于磁分离架上1min后弃去上清液，向包被管中加入1ml 0.05m tris(ph7.4)缓冲液涡旋混匀1min。重复此次操作两次。向包被管中加入1ml 0.05m tris(ph7.4)，涡旋混匀1min。
[0099]
(6)磁分离试剂制备
[0100]
将包被单克隆抗体(1)的磁珠用终洗缓冲液用酶标稀释液0.05m tris(ph7.4)进行稀释获得终浓度0.2mg/ml。
[0101]
2、酶标记抗体(标记有碱性磷酸酶的单克隆抗体(2))的制备
[0102]
取250ul 0.1m mes(ph4.5)浸泡超滤离心管(30kd)2min。加入250ul 0.1m mes(ph4.5)于离心柱中使其定容在500ul。加入12.5ul ap酶于超滤离心管中，上下颠倒轻轻混匀后于离心机上13000rpm离心15min。离心停止后可以观察到离心柱中有100ul液体，弃废液后向离心柱中加入200ul 0.1m mes(ph4.5)于超滤离心管中，然后13000rpm离心20min。离心停止后可以观察到离心柱中有100ul液体，弃废液后向超滤离心管中加入50uledc(10mg/l)，6ulnhs(10mg/l)，然后加入100ul0.1m mes(ph4.5)定容至250ul混匀，放置摇床活化1.5小时。取10ul单克隆抗体(2)10mg/l混匀后13000rpm离心20min,倒掉离心出的液
体。加250ul 0.1mpb(ph9.0)混匀后13000rpm离心20min。重复上一步骤离心一次。然后加入0.1mpb(ph9.0)定容至250ul置于摇床上120r偶联2h。加入0.05m tris ph8.02,加入250ul混匀，置于摇床上120rpm 30min。将离心柱中的偶联完成500ul溶液取出,然后加入等量的甘油混匀-20℃保存。用l5s紫外可见分光光度计(博大精科)测量并计算出碱性磷酸酶标记抗体的浓度，用酶标稀释液0.05m tris(ph7.4)进行1:1000稀释获得酶标记抗体。
[0103]
3、洗涤液的制备
[0104]
由10mm pbs(ph7.2)，0.08％吐温-20和0.03％proclin-300组成。
[0105]
4、磷酸化α-突触核蛋白校准品/质控品的制备
[0106]
将磷酸化α-突触核蛋白用校准品稀释液(含有10mm磷酸盐缓冲液(pbs)(ph7.2)、1％bsa、0.03％生物防腐剂proclin-300)梯度稀释系列校准品(10-2000pg/ml)及配制高、低两个浓度质控品。
[0107]
5、发光底物的制备
[0108]
由化学发光底物(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐(aps-5)及含有0.0003％光泽精、0.001％亚硫酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠(sds)、0.03％吐温20的0.3mtris缓冲液组成。
[0109]
6、试剂盒的组成
[0110]
试剂盒主要由试剂条(24条)、磷酸化α-突触核蛋白校准及质控品组成，每条试剂条为1人份测试，每条试剂条预装磁分离试剂(包被单克隆抗体(1)免疫磁珠工作液)80μl、酶标记抗体130μl、洗涤液2ml和发光底物250μl。
[0111]
实施例5：磷酸化α-突触核蛋白的化学发光试剂盒的制备
[0112]
1、磁分离试剂的制备
[0113]
(1)链霉亲和素磁珠工作液制备
[0114]
jsr磁珠溶液(100mg/ml)购自深圳锐思生物技术有限公司，粒径为1.5μm，用终洗缓冲液0.05m tris(ph7.4)进行的稀释到工作浓度0.2mg/l，获得工作液。
[0115]
(2)生物素标记的单克隆抗体(1)的制备
[0116]
取20ul(0.2mg)单克隆抗体(1)加入离心管中，用400ul 1xpbs溶液进行超速离心纯化一次，再用300ul 1xpbs溶液纯化两次，每次6-7分钟。
[0117]
取3.4mg ape-生物素(深圳锐思生物技术有限公司)和1ml dmso在冻存管中震荡溶解，避光条件下备用。将纯化好的抗体用pbs定容至100ul保存在冻存管中，取100ul ape-生物素溶液震荡混合，放置在4℃的条件下反应2h。将生物素标记好的抗体用1xpbs溶液定容至400ul加入离心管中，超速离心纯化一次，再用300ulpbs溶液纯化第二次，每次6-7分钟。将清洗好的抗体用1xpbs溶液定容至50ul保存在冻存管中，取50ul甘油震荡混匀，冻存。
[0118]
2、酶标记抗体(标记有碱性磷酸酶单克隆抗体(2))的制备
[0119]
同实施例4。
[0120]
3、磷酸化α-突触核蛋白校准品/质控品、洗涤液、发光底物的制备
[0121]
同实施例4。
[0122]
4、试剂盒的组成
[0123]
试剂盒主要由试剂条(24条)、磷酸化α-突触核蛋白校准品及质控品组成，每条试剂条为1人份测试，每条试剂条预装磁分离试剂(链霉亲和素磁珠工作液、生物素标记抗体
各80μl)、酶标记抗体130μl、洗涤液2ml和发光底物250μl。
[0124]
实施例6：磷酸化α-突触核蛋白的化学发光试剂盒的制备
[0125]
1、包被单克隆抗体(1)免疫磁珠的制备
[0126]
同实施例4。
[0127]
2、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体(2)的制备
[0128]
称取2mg的hrp溶解于0.5ml蒸馏水中，加入0.5ml新配的0.06m naio4溶液，4℃避光30分钟；加入160mm的乙二醇0.5ml置于室温30分钟，上液中加入单克隆抗体(2)2mg，混匀。将上述溶液装入透析袋中，置2000ml的0.05mm cb缓冲液中透析，4℃搅拌过夜。(0.05m cb缓冲液：na2co33.18g+nahco35.88g，直至2l蒸馏水)透析液吸至15ml的离心管中，加0.2ml新配的5mg/ml nabh4液，混匀，再置4℃2小时。加入等量的饱和硫酸铵溶液，4℃30分钟，4℃离心4000rpm 20分钟。弃上清，沥干。将沉淀溶于少量pbs中(0.02m，ph7.4)，装入透析袋中，对0.02m ph7.4 pbs透析，4℃过夜(中途换pbs一次)。将透析液中液体吸至ep管中，离心，将上清液吸出，加等量甘油，混匀-20℃保存即可。
[0129]
3、洗涤液的制备
[0130]
同实施例4。
[0131]
4、磷酸化α-突触核蛋白校准品/质控品的制备
[0132]
同实施例4。
[0133]
5、发光底物的制备
[0134]
发光底物分a、b液，a液由0.4g/l过氧化脲、0.1mol/l ph8.6硼酸盐缓冲液配制而成；b液由0.2g/l 4-碘苯酚、0.8g/l鲁米诺、0.5ml/l吐温-20、0.1mol/lph8.6硼酸盐缓冲液配制而成。
[0135]
6、试剂盒的组成
[0136]
试剂盒主要由试剂条(24条)、磷酸化α-突触核蛋白校准品及质控品组成，每条试剂条为1人份测试，每条试剂条预装磁分离试剂(包被单克隆抗体(1)免疫磁珠工作液)80μl、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体(2)130μl、洗涤液2ml和发光底物a、b液各250μl。
[0137]
实施例7：elisa测定试剂盒的制备
[0138]
1、各种缓冲液及试剂的配制：
[0139]
1.1、包被缓冲液：0.05m、ph9.6，cb(碳酸盐缓冲液)
[0140]
na2co3：16.0克
[0141]
nahco3：29.0克
[0142]
去离子水定容至1000ml。
[0143]
1.2、ph7.2，10
×
pbs-tween 20
[0144]
na2hpo4·
12h2o：58克
[0145]
kh2po4：4克
[0146]
nacl：100克
[0147]
kcl：4克
[0148]
tween 20：20ml
[0149]
去离子水定容至1000ml。
[0150]
1.3、封闭液/抗体稀释液：
[0151]
10
×
pbs-tween 20：100ml
[0152]
bsa(牛血清白蛋白)：10克
[0153]
生物防腐剂(proclin-300，购自上海西宝公司)：1ml
[0154]
去离子水定容至1000ml。
[0155]
1.4、酶标记物稀释液：
[0156]
10
×
pbs-tween 20：10ml
[0157]
fcs(小牛血清)：20ml
[0158]
酶稳定剂(购自上海西宝公司，型号为ace0070a)：1克生物防腐剂(proclin-300，购自上海西宝公司)：1ml
[0159]
去离子水定容至1000ml。
[0160]
1.5、显色剂a：
[0161]
柠檬酸：35.5克
[0162]
过氧化脲：10克
[0163]
tween 20：10ml
[0164]
去离子水定容至1000ml。
[0165]
1.6、显色剂b：
[0166]
柠檬酸：120克
[0167]
edta-2na：1克
[0168]
tmb
·
2hcl：2克
[0169]
去离子水定容至1000ml。
[0170]
1.7、浓缩洗涤液(ph7.2，25
×
pbs-tween 20)
[0171]
na2hpo4·
12h2o：145克
[0172]
kh2po4：10克
[0173]
nacl：250克
[0174]
kcl：10克
[0175]
tween 20：50ml
[0176]
去离子水定容至1000ml。
[0177]
1.8、终止液：2m h2so4[0178]
浓硫酸(95-98％)：22.2ml
[0179]
去离子水：177.3ml
[0180]
配时将浓硫酸缓慢滴入去离子水定容至中，边加边摇匀。
[0181]
2、预包被板的制备
[0182]
将单克隆抗体(1)溶于包被缓冲液中，配制成预包被液，在酶标包被板(购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，洗涤，每孔加100μl封闭液4℃封闭16小时，甩掉封闭液，晾干后装入铝箔袋中抽真空密封，并置于4℃保存。
[0183]
3、结合抗体和酶标记物配制
[0184]
结合抗体(多克隆抗体(2))和酶标记物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg抗体，购自北京中杉金桥公司)用抗体稀释液稀释至使用浓度，其使用浓度由方阵滴定实验确定。
[0185]
4、磷酸化α-突触核蛋白校准品、质控品配制
[0186]
用样品稀释液稀释重组磷酸化α-突触核蛋白，配制磷酸化α-突触核蛋白校准品(25～1000pg/ml)及高、低2个浓度质控品。
[0187]
5、elisa试剂盒组成
[0188]
试剂盒主要由预包被板(48或96人份)、磷酸化α-突触核蛋白校准品1套、磷酸化α-突触核蛋白质控品(高、低两个浓度)、结合抗体(10ml)、酶标记物(10ml)、显色液a(5ml)、显色液b(5ml)、浓缩洗涤液(20ml)及终止液(5ml)组成。
[0189]
实施例8：磷酸化α-突触核蛋白-荧光层析测定试剂盒制备
[0190]
1、包被结合垫
[0191]
1.1、荧光微球标记单克隆抗体(1)
[0192]
1.1.1、荧光微球的活化：
[0193]
(1)取500μl、含量1(w/v)％的荧光微球(购自bangs laboratories，lnc)水分散液，加入初洗缓冲液(50mm的mes水溶液，ph6.5)至1ml，在4℃下，以16000rpm离心20分钟，去上清，将沉淀物分散到1ml的初洗缓冲液中，超声波(240w)处理2分钟；
[0194]
(2)重复以上过程两次；
[0195]
(3)加入375μl(微球量的3/4)按1:3混合的10mg/ml的碳二亚胺溶液和10mg/ml的n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的混合液，振荡15分钟，从而活化所述荧光微球。
[0196]
1.1.2、用活化好的荧光微球标记单克隆抗体(1)：
[0197]
(1)将沉淀物分散到1ml偶联缓冲液(50m m的mes水溶液，ph6.0)中，超声波(240w)处理2分钟；
[0198]
(2)重复以上过程两次；
[0199]
(3)获得分散有荧光微球的缓冲液500μl；
[0200]
(4)按照15mg抗体/g活化好的荧光微球的比例，向其中加入单克隆抗体(1)，在常温下振荡2小时；
[0201]
(5)加入1ml封闭缓冲液(0.5(w/v)％bsa-0.05m乙醇胺)，继续振荡1小时，之后在16000rpm下离心20分钟，重复离心3次，将沉淀物分散到500μl终洗缓冲液(0.5(w/v)％bsa-0.1(v/v)％吐温-20mmtris溶液)中，超声波(240w)处理2分钟，用上述终洗缓冲液定容至500μl。
[0202]
1.2、包被结合垫
[0203]
将上述制备的标记有荧光微球的单克隆抗体(1)用微球稀释液(0.5(w/v)％bsa-2(w/v)％s9—15％蔗糖-0.5％pvp-40000-0.5％peg20000-20mm tris溶液)按微球量：稀释液为1:240稀释，获得工作液，然后用微量移液器(购自dragon公司)按1200μl/30cm的量均匀喷涂在结合垫上，之后用37℃烘箱烘干，在45％湿度下保存备用。
[0204]
2、反应膜的制备
[0205]
将单克隆抗体(2)和羊抗鼠igg单克隆抗体(购自arista公司)用1％(w/v)peg20000-5％(v/v)甲醇-3％(w/v)蔗糖10mm pbs(ph8.4)缓冲液分别稀释至0.5mg/ml，将喷金机(购自杭州峰杭公司)的检测线和质控线间隔参数设置为8mm，将包被量分别设置为1.0μl/cm，用喷金机在硝酸纤维素膜上划上单克隆抗体(2)和羊抗鼠igg单克隆抗体，用37℃烘箱烘干，在45％湿度下保存备用。
[0206]
3、试纸的组装和切割
[0207]
在底板上依次相互搭接粘贴样品垫、结合垫、nc反应膜和吸水滤纸，得到试纸板，将其切割成宽度为4mm的试纸条。
[0208]
4、磷酸化α-突触核蛋白荧光免疫检测卡的制备
[0209]
将上述切割好的试纸固定在塑料底卡上，试纸表面用面卡压紧，面卡在试纸条的样品垫和反应膜的位置上开有加样孔和观察窗。检测卡组装好后装入铝箔袋中，加入干燥剂封口保存，室温干燥条件下可以保存一年以上。
[0210]
5、磷酸化α-突触核蛋白-荧光层析测定试剂盒(20t)的组成
[0211]
磷酸化α-突触核蛋白荧光免疫检测卡20个
[0212]
实施例9：实施例4制备的化学发光免疫测定(clia)试剂盒对磷酸化α-突触核蛋白的测定及性能验证
[0213]
1、唾液样本采集：
[0214]
(1)收集前受试者平静10分钟，收集前5分钟，用净水漱口1分钟以上。
[0215]
(2)受试者低头，张口，让唾液自然流入无菌管，收集唾液2ml；
[0216]
(3)将收集的唾液转移至2ml离心管，置于冰上，加入多种蛋白酶抑制剂(0.1μl/ml唾液)，以防止蛋白降解；
[0217]
(4)唾液2600g，4℃离心15分钟，再15000g，4℃离心15分钟，两次离心均取上清液。
[0218]
(5)-80℃冰箱保存。
[0219]
2、化学发光免疫测定(clia)试剂盒测定磷酸化α-突触核蛋白浓度，具体步骤为：
[0220]
(1)在试验前需将所有试剂放至室温，全自动发光仪开机预热至少30分钟；
[0221]
(2)扫描试剂盒条码，全自动发光仪自动根据试剂盒信息选择不同的内置测定程序；
[0222]
(3)试剂、样本装载：按照全自动发光仪测定程序的操作指引，完成磁分离试剂、酶标记抗体、发光底物液的装载，将校准品/质控品/样本混匀后用定量吸管转移至每条试剂条样品孔孔位中；
[0223]
(4)启动自动测定程序：测定流程以及相关参数已被预先定义在仪器操作软件中，反应及测试时间设定为15分钟。
[0224]
(5)结果输出：全自动发光仪借助由校准品两点定标调整内置主曲线得到的工作曲线，自动计算每一个样本的磷酸化α-突触核蛋白浓度。
[0225]
3、实施例4试剂盒性能验证
[0226]
3.1、线性范围验证
[0227]
取接近试剂盒线性范围上限的样本用校准品稀释液进行系列稀释，每个稀释浓度的样本重复测定2次，计算其浓度的平均值(yi)。以稀释比例(xi)为自变量，以对应的浓度平均值(yi)为因变量进行直线拟合。计算线性相关系数(r)。
[0228]
测试结果如下表1：
[0229]
表1线性范围测试结果及计算单位：pg/ml
[0230][0231][0232]
测试结果表明，实施例4试剂盒在10～2000pg/ml范围内，线性相关系数可达0.992。
[0233]
3.2、最低检测限
[0234]
使用实施例4制备的试剂盒重复检测零浓度参考品20次，计算20次检测浓度的平均值(m)和标准差(sd)，再计算得出m+2sd，即为最低检测限。
[0235]
测试结果表明，最低检测限为7.8pg/ml，说明试剂盒有较高的灵敏度。
[0236]
3.3、精密度
[0237]
精密度的验证在高、低两个浓度水平的样本上进行，用实施例4试剂盒对每个浓度的样本均重复检测10次。两个浓度分别为80pg/ml和1000pg/ml。
[0238]
分别计算每个浓度样本10次测量结果的平均值和标准差sd，根据得出变异系数cv，评价试剂盒的精密度。
[0239]
测试结果如下表2：
[0240]
表2精密度测试结果
[0241]
[0242]
测试结果表明，实施例4制备的试剂盒对高、低两个浓度的样本测试cv％均小于10％，可知试剂盒具有较高的精密度。
[0243]
3.4、准确度
[0244]
试剂盒准确度采用了回收试验进行评价。
[0245]
将高浓度样品a加入到低浓度的样品b中，所加入样品a与样品b之间的体积比例为1：9，检测样本b及混合样本的浓度，根据下述公式计算回收率。
[0246][0247]
式中：r—回收率；
[0248]
v—加入样品a体积；
[0249]
v0－样品b的体积；
[0250]
c－样品b加入样品a后的检测浓度；
[0251]
c0—样品b的检测浓度；
[0252]
cs—样品a的浓度。
[0253]
经计算，回收率为93.45％，说明试剂盒准确度较高。
[0254]
验证结论：
[0255]
实施例4制备的试剂盒验证结果表明：试剂盒线性范围宽，可以不用稀释直接测量浓度达2000pg/ml的样品，灵敏度高(最低检测限为7.8pg/ml)，准确度高(回收率为93.45％)，精密度好(高、低浓度cv％分别为5.17％和5.39％)，且整个反应时间短，15分钟可出结果，大大提高了检测效率。
[0256]
实施例10：实施例7制备的酶联免疫吸附(elisa)试剂盒对磷酸化α-突触核蛋白的测定及试剂盒性能验证
[0257]
1、样本采集：同实施例9。
[0258]
2、酶联免疫吸附(elisa)试剂盒测定磷酸化α-突触核蛋白浓度，具体步骤为：
[0259]
(1)洗涤液的配制：
[0260]
25倍浓缩洗涤液用去离子水按1：25稀释；
[0261]
(2)取出实施例7制备的试剂盒平衡至室温，准备好样本和校准品、质控品，临床样本用样本稀释液按1：20稀释；
[0262]
(3)微孔板每孔先加入50μl稀释好的待测样本/校准品/质控品，再加入50μl的结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，用封口膜将微孔板封好，37℃温育30分钟；
[0263]
(4)取出反应板，弃去板中液体，每孔加200－300μl洗涤液洗板5次，拍干；
[0264]
(5)每孔加入两滴或100ul酶标记物，用封口膜将板封好，37℃温育30分钟；
[0265]
(6)取出反应板，弃去板中液体，每孔加200－300μl洗涤液洗板5次，拍干；
[0266]
(7)每孔加入显色剂a、b溶液各50μl，充分混匀，置37℃温育15分钟；
[0267]
(8)每孔尽快加入终止液1滴(50μl)轻拍混匀；
[0268]
(9)用酶标仪(以450/630nm双波长测定)测定各孔od.值；
[0269]
(10)绘制校准曲线，根据校准曲线计算样本中磷酸化α-突触核蛋白浓度。
[0270]
3、试剂盒性能验证
[0271]
3.1、线性范围验证
[0272]
验证方法同实施例9。
[0273]
测试结果如下表3：
[0274]
表3线性范围测试结果及计算单位：pg/ml
[0275][0276][0277]
测试结果表明，实施例7制备的试剂盒在25～1000pg/ml范围内，线性相关系数可达0.998。
[0278]
3.2、最低检测限
[0279]
验证方法同实施例9。
[0280]
测试结果表明，最低检测限为16.3pg/ml，说明试剂盒有较高的灵敏度。
[0281]
3.3、精密度
[0282]
验证方法同应用实施例9。用于精密度验证的两个浓度分别为80pg/ml和500pg/ml。
[0283]
测试结果如下表4：
[0284]
表4精密度测试结果
[0285][0286]
测试结果表明，实施例7制备的试剂盒对高、低两个浓度的样本测试cv％均小于10％，可知试剂盒具有较高的精密度。
[0287]
3.4、准确度
[0288]
验证方法同应用实施例9。
[0289]
经计算，回收率为92.8％，说明试剂盒准确度较高。
[0290]
验证结论：
[0291]
实施例7制备的试剂盒验证结果表明：试剂盒在25～1000pg/ml范围内线性较好，灵敏度较高(最低检测限为16.3pg/ml)，回收率为92.8％，准确度高，精密度好(高、低浓度cv％均小于10％)，无需复杂设备，可用于批量检测，1.5小时可同时出80个以上测试结果，检测效率较高。
[0292]
实施例11：实施例8制备的荧光免疫层析试剂盒对磷酸化α-突触核蛋白的测定及试剂盒性能验证
[0293]
1、样本采集：同实施例9。
[0294]
2、荧光免疫层析试剂盒测定磷酸化α-突触核蛋白浓度，具体步骤为：
[0295]
(1)测试前将试剂恢复到室温(20
±
5℃)，测试在室温下进行；
[0296]
(2)开启荧光分析仪，将仪器调试至等待检测状态；
[0297]
(3)将1：4稀释后的校准品/质控品/样本各100μl加入到每个检测卡加样口，反应15min；
[0298]
(4)反应结束，将检测卡插入荧光分析仪进行扫描测试，根据导入分析仪的内置校准曲线，计算每一个样本的磷酸化α-突触核蛋白浓度。
[0299]
3、试剂盒性能验证
[0300]
3.1、线性范围验证
[0301]
测试方法同实施例9。
[0302]
测试结果如下表5：
[0303]
表5线性范围测试结果及计算单位：pg/ml
[0304][0305][0306]
测试结果表明，实施例8试剂盒在25～1000pg/ml范围内，线性相关系数可达0.997。
[0307]
3.2、最低检测限
[0308]
测试方法同实施例9。
[0309]
测试结果表明，最低检测限为20.5pg/ml。
[0310]
3.2、精密度
[0311]
测试方法同应用实施例9。用于精密度验证的两个浓度分别为80pg/ml和500pg/ml。测试结果如下表6：
[0312]
表6精密度测试结果
[0313]
[0314][0315]
测试结果表明，实施例8制备的试剂盒对高、低两个浓度的样本测试cv％均小于10％，可知试剂盒具有较高的精密度。
[0316]
3.4、准确度
[0317]
验证方法同应用实施例9。
[0318]
经计算，回收率为91.5％，符合回收率【90％～110％】要求。
[0319]
验证结论：
[0320]
实施例8制备的试剂盒验证结果表明：试剂盒在25～1000pg/ml范围内线性较好，灵敏度为20.5pg/ml，回收率为91.5％，准确度符合要求，精密度较好(高、低浓度cv％均小于10％)，可用于床边诊断，操作简易，随到随测，15分钟可出结果，检测快速。
[0321]
测试对比例：
[0322]
α-突触核蛋白(磷酸化s129)抗体(ab51253)和α-突触核蛋白抗体(ab138501)(购自abcam公司)按实施例4的方法制备化学发光试剂盒(对比试剂盒)，与实施例4的试剂盒进行分析性能对比测试。
[0323]
各项性能对比结果如下表7：
[0324]
表7对比试剂盒与实施例4试剂盒性能比对结果
[0325][0326]
各项分析性能比对，实施例4制备的试剂盒的各项指标更好。
[0327]
实施例12：磷酸化α-突触核蛋白测定试剂盒用于帕金森病辅助诊断
[0328]
1、研究对象
[0329]
帕金森病组：帕金森病患者32例，其中男性15例，女性17例，年龄(65.4
±
15.7)岁。患者具有典型特征，符合中国帕金森病的诊断标准(2016版)，存在运动迟缓又有下列症状之一：静止性震颤(4-6hz)/肌强直。
[0330]
健康对照组：健康对照组30例，其中男性15例，女性15例，年龄(64.6
±
16.8)岁，无精神疾病、神经性疾病及躯体疾病。
[0331]
两组年龄、性别比较，差异无统计学意义，研究对象对本研究均知情同意。
[0332]
2、实验方法
[0333]
2.1、用本发明实施例4制备的磷酸化α-突触核蛋白试剂盒测试对照组和帕金森病患者样本。
[0334]
2.2、受试者工作曲线(roc曲线)：根据患者及对照人群磷酸化α-突触核蛋白水平制作roc曲线分析唾液磷酸化α-突触核蛋白对帕金森病辅助诊断的价值。
[0335]
3、结果
[0336]
如图1所示，帕金森病组的唾液磷酸化α-突触核蛋白水平(78.76
±
22.21pg/ml)明显高于健康对照组((59.86
±
12.56pg/ml))。
[0337]
绘制帕金森病诊断的受试者工作曲线(如图2)，诊断的roc曲线下面积auc为0.78(95％ci＝0.66-0.90)，p《0.01。表明磷酸化α-突触核蛋白对帕金森病辅助诊断有着较好价值。

技术特征：
1.一种p-α-syn特异性抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基序列为如下两者之一：tyr-arg-glu-met-pro-ser(po3h2)-glu-glu-gly(1)或tyr-glu-gly-ile-leu-glu-asp-met-pro-val-asp-pro-asp-asn-glu-ala(2)。2.一种p-α-syn特异性抗体，其是通过使权利要求1所述的p-α-syn特异性抗原表位肽(1)偶联载体蛋白后免疫动物制备得到的单克隆抗体。3.一种p-α-syn特异性抗体，其是通过使权利要求1所述的p-α-syn特异性抗原表位肽(2)偶联载体蛋白后免疫动物制备得到的单克隆或多克隆抗体。4.如权利要求2或3所述的p-α-syn特异性抗体，其特征在于，所述p-α-syn特异性抗体是由p-α-syn特异性抗原表位肽偶联载体蛋白后免疫兔或鼠制备得到。5.一种试剂盒，用于磷酸化α-突触核蛋白测定、帕金森病的检测或诊断，包括：权利2和3所述的p-α-syn特异性抗体，优选地还包括固相载体、标记物和p-α-syn校准品。6.根据权利要求5所述试剂盒，其中所述试剂盒为酶联免疫吸附测定试剂盒、化学发光测定试剂盒、荧光免疫层析测定盒或胶体金免疫测定试剂盒中任一种。7.根据权利要求5所述试剂盒，其中所述固相载体选自微孔反应板、磁性微球或硝酸纤维素膜中的任一种；所述标记物选自辣根过氧化物酶hrp、碱性磷酸酶ap、发光物质、荧光物质、染料或胶体金。8.根据权利要求5所述试剂盒，其中所述试剂盒为化学发光测定试剂盒，所述固相载体为磁性微珠。9.根据权利要求8所述试剂盒，其中所述磁性微珠与权利要求2所述的p-α-syn特异性抗体直接或者间接相连形成磁分离试剂；所述磁分离试剂为包被权利要求2所述的p-α-syn特异性抗体的免疫磁珠或者为将链霉亲和素与权利要求2所述的p-α-syn特异性抗体相连的磁珠；且，权利要求3所述的p-α-syn特异性抗体为酶标记抗体。10.如权利要求5-9任一项所述试剂盒在制备检测、诊断帕金森病的产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种P-α-Syn特异性抗原表位肽，其中所述P-α-Syn特异性抗原表位肽的氨基酸序列为下列两个序列之一：Tyr-Arg-Glu-Met-Pro-Ser(PO3H2)-Glu-Glu-Gly(1)；或Tyr-Glu-Gly-Ile-Leu-Glu-Asp-Met-Pro-Val-Asp-Pro-Asp-Asn-Glu-Ala(2)。本发明还公开了P-α-Syn特异性抗体。本发明进一步公开了α-突触核蛋白测定试剂盒，包括：固相载体、P-α-Syn特异性抗体、标记物和P-α-Syn校准品。本发明还公开了本发明提供的试剂盒在制备诊断帕金森病产品中的应用。本发明制备的试剂盒需具有良好的诊断敏感性、特异性和重复性，符合临床应用需求。应用需求。应用需求。


技术研发人员：朱建安 朱仕杰
受保护的技术使用者：深圳市安群生物工程有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/23