一种热带海参人工繁育的方法

1.本发明属于水产养殖技术领域，更具体地，涉及一种热带海参人工繁育的方法。


背景技术：

2.热带海参主要生活在热带和亚热带海域，具有不同于北方仿刺参的特殊生活习性。很多种类的热带海参富含多糖和皂苷等天然活性物质，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗肿瘤等功效，这大大增加了其潜在的经济价值。热带海参还在海底生态系统中发挥着重要的功能，它们可以通过摄食和排泄等生理活动降低沉积物有机质含量，增加沉积物和水界面的营养盐通量和溶解氧交换速率，另外，将热带海参与鱼虾等其他养殖动物进行混养，可以有效地调控养殖环境，提高养殖对象的生长率和存活率，因此，热带海参可以作为生物滤器用于构建复合生态养殖系统。
3.随着人类消费水平的提高，全球海参捕捞产量在过去几十年快速增加，在过度捕捞，环境污染以及气候变化等诸多压力下，近年自然海域海参资源迅速下降，甚至部分海域的海参种群已经濒临灭绝。研究表明，对海参进行人工繁育和增殖放流是弥补日益枯竭的野生种群的有效解决办法。
4.目前，国内外对海参资源进行恢复的重要途径之一就是增殖放流，增殖放流需要稳定的苗种供应。相对于仿刺参以及糙海参等经济种类，大部分种类的热带海参人工繁育技术尚不成熟，如目前，国内外尚未掌握图文白尼参、梅花参、棕环海参以及米氏海参等热带海参的人工催产方法。在海参的人工繁育过程中，水质、饵料、敌害以及育苗过程中的管理方法等都会影响浮游幼体的生长发育与存活。很多种类的热带海参，如玉足海参的浮游幼体期为仿刺参和糙海参的2倍以上，如此漫长的过程中稍有不慎就会导致苗种发育迟缓甚至大规模死亡。另外，海参育苗如果由经验丰富的技术人员进行管理，则成功率相较于经验较少的技术人员会高很多，究其原因主要在于后者对于水质控制、饵料培养和搭配以及敌害控制等关键过程照本宣科，缺乏相应的实践经验。
5.现有的海参育苗技术只有仿刺参和糙海参相对成熟，而其他种类的热带海参人工繁育技术尚处于起步阶段。众所周知，每种海参都有自己独特的生物学特征，其他海参种类的人工繁育如果全盘仿照仿刺参、糙海参等种类的育苗手册进行管理，其结果往往并不理想。因此，热带海参人工繁育过程的关键环节，包括配子获取、水质调控、单胞饵料藻培养、敌害防控以及幼体培育等都必须进行规范化管理。从实践角度来说，在保证育苗效果的前提条件下要尽量简化步骤，这样可以少走弯路并大幅度减少育苗技术人员的工作量，有效地降低风险，提高育苗的成功率。
6.众所周知，利用人工催产获得受精卵进行海参人工繁育效果最佳。一般来说，人工催产的方法有阴干、流水刺激、温度刺激以及药物刺激等方法，然而，实际操作过程中，我们发现一些热带海参种类性腺虽已经成熟，但在室内条件下，无论采用何种传统的手段均无法使其自然排放精卵，很多难以进行人工催产的海参种类，如图文白尼参和梅花参等，在自然界中已经濒临灭绝，其种群数量已经不足以支持其自然繁育，因此，必须采取有效手段对
其进行抢救性繁育与增殖。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种热带海参人工繁育的方法。通过该方法可以为濒临灭绝且无法进行人工催产的热带海参种群的延续及资源恢复提供技术保证。
8.本发明的一种热带海参人工繁育的方法，包括以下步骤：
9.a、水质控制：取用天然海水，处理至其污染物含量低于第二类海水水质标准；
10.b、海参亲本采集：采集性腺成熟的热带海参；
11.c、配子获取：清空海参亲本肠道后，取出性腺剪碎或压碎使卵子或精子流出，分别激活卵子和精子；
12.d、受精和孵化：将卵子和精子混合并进行洗卵，收集受精卵进行孵化，控制孵化密度，持续充气使受精卵悬浮，待受精卵发育至小耳状幼体能够开口摄食时进行分池处理；
13.e、浮游幼体培育：在室内封闭环境中培育浮游幼体，控制密度，保持充气，使幼体一直处于悬浮状态；每天换水并投喂角毛藻和面包酵母、定期除去池底死亡幼体和残饵及粪便；
14.f、幼体附着及培育：当30％以上的浮游幼体发育至樽型幼体阶段时开始投放附着基，投放后每天换水并投喂角毛藻和面包酵母以及稚参配合饵料，稚参配合饵料投喂量随着苗种的生长而增加，角毛藻和面包酵母逐渐减少，当浮游幼体全部附着后，停止投喂角毛藻和面包酵母，持续培养获得大规格热带海参苗种；
15.g、热带海参的中间养成：当热带海参苗种长至10-20mm，收集并转移至室外网箱进行养殖，网箱提前搭建，以自然附着的底栖硅藻作为饵料，中间养成期间可额外投喂人工配合饵料提高稚参生长速度，持续培育获得大规格海参。
16.优选地，所述的步骤c的剪碎为将雌性性腺剪成《5mm的小段。
17.优选地，所述的步骤c的压碎为将雄性性腺压碎。
18.优选地，所述的步骤c的取出性腺为将亲本暂养以清空其肠道后，从尾部切开一小口，将性腺从开口处取出，过程中尽量不破坏体壁和其他脏器，从而减少对亲参的伤害。
19.优选地，所述的步骤c的激活卵子和精子为将卵子浸泡在步骤a的海水中30-60min、将精子浸泡在步骤a的海水中5-15min。卵子激活成功的标准是外形变圆，生发泡破裂。
20.优选地，所述的热带海参为玉足海参、棕环海参或米氏海参。
21.优选地，所述的角毛藻和面包酵母为角毛藻搭配面包酵母制备饵料，其中角毛藻密度不低于200万个/ml，面包酵母利用200目筛绢干净海水中搓碎配成0.1g/l的悬浊液，然后将角毛藻液和面包酵母悬浊液按照体积比3:1的比例混合；所述的角毛藻为指数增长期的牟氏角毛藻；所述的稚参配合饵料为仿刺参稚参配合饵料。
22.优选地，所述的牟氏角毛藻通过以下方法制备：采用f/2培养基对牟氏角毛藻进行单独培养，采用三级培养，一级保种在恒温车间的5l灭菌锥形瓶中，二级扩种采用15l透明塑料桶培养，三级培养利用200-400l塑料桶完成；其中一、二级培养f/2培养基所用的海水是经煮沸后冷却至室温使用；三级培养则在200-400l塑料桶中进行，海水加20ppm消毒粉过夜，然后用10ppm硫代硫酸钠中和后使用，角毛藻培养均在室内进行，利用20-50瓦的全光谱
日光灯，持续提供10000-30000lx的光照，晚上三级培养所用的塑料桶用透明亚克力板做盖进行全程保护。
23.优选地，上述热带海参人工繁育的方法具体为：
24.a、水质控制：取用天然海水，在使用前经过两级过滤处理或/和紫外杀菌消毒处理，具体为：两级过滤中第一级为普通的砂滤，用于除去天然海水中的大颗粒物，第二级为利用孔径不超过5微米的过滤袋过滤，用于进一步除去微小颗粒物；为除去海水中的病原菌，在任何一级过滤处理前/后将海水进行紫外杀菌消毒处理，处理后海水盐度范围为29-33ppt，温度范围为26-31℃，由此得到处理后的合格海水；
25.b、海参亲本采集：在热带海参性腺成熟的季节，于自然海区采集野生的热带海参作为亲体；
26.c、配子获取：将亲本暂养以清空其肠道后，从尾部切开一小口，将性腺从开口处取出，过程中尽量不破坏体壁和其他脏器，从而减少对亲参的伤害；
27.卵子收集方法：选择性腺发育良好的雌性亲参，解剖获得性腺，将性腺剪为《5mm的小段，让卵子自然流出，然后阴干1-2h后，利用200目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液经过300目筛绢网浓缩，去除小的碎组织块，随后放置于海水中浸泡30-60min以激活卵子，卵子激活成功的标准是外形变圆，生发泡破裂；
28.精子收集方法：选择性腺发育良好的雄性亲参，解剖获得性腺，压碎后经过400目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液放置于干净海水中静置5-15min以激活精子，镜检并选取活性高的精子使用；
29.d、受精和孵化：将卵子收集于5l的塑料量杯中，加入新鲜海水，添加精子；搅拌，静置，去除上清液，重复3次以去除多余的精子及不良受精卵等杂质；之后将收集到的受精卵加入孵化池中，孵化池中受精卵密度为3-5个/ml，培育期间持续充气使受精卵均匀悬浮；受精卵在温度28-31℃，盐度29-33ppt条件下，日换水量1/4-1/2，培育2天待受精卵发育至小耳状幼体能够开口摄食时进行分池，分池后幼体密度不超过1个/ml；
30.e、浮游幼体培育：在室内封闭环境中培育浮游幼体，控制密度，并在整个培育过程中保持适度充气，使幼体一直处于悬浮状态；
31.海参浮游幼体培育以中耳幼体后期为界，分为两个阶段：第一个阶段为小耳幼体发育至中耳幼体后期之前，每天换水1/3，清晨和下午换水后各投喂角毛藻和面包酵母一次，每次投喂量为5l/m3水体，全天投喂量为10l/m3水体；第二阶段为中耳幼体后期之后，包括大耳幼体至樽型幼体阶段，每天换水1/2，清晨和下午换水后投喂角毛藻和面包酵母一次，每次投喂量为10l/m3水体，全天投喂量为20l/m3水体；换水时用筛绢网过滤，以避免海参浮游幼体跑出，每3天利用虹吸法吸一次池底，以除去池底死亡幼体和残余的饵料及粪便；
32.f、幼体附着及培育：当30％以上的浮游幼体发育至樽型幼体阶段时开始投放附着基，附着基为附着底栖硅藻的聚乙烯波纹板，每立方米水体投放10-15套附着基，投放后每天换水1/2，清晨和下午换水后继续投喂角毛藻和面包酵母，投喂量随着水体中浮游幼体密度的降低而减少；另外每天早晚各投喂1次5ppm的稚参配合饵料，稚参配合饵料使用前利用200目筛绢在干净海水中搓碎配成悬浊液；
33.当浮游幼体全部附着后，停止投喂角毛藻和面包酵母，转而以投喂稚参配合饵料为主，投饵量随着苗种的生长而增加，当苗种体长达到2mm以上时，每周通过虹吸法清除池
底残饵和粪便一次，每天早晚各换水一次，每次换水1/2，换水后均进行投喂，每次投喂量增至20ppm，持续培养获得大规格热带海参苗种；
34.g、热带海参的中间养成：当热带海参苗种长至10-20mm，转移至海上网箱中进行中间养成，网箱为长1m，宽1m，高1m的尼龙网网箱，网眼大小为2mm，网箱需要提前一周布置，以附着底栖硅藻作为饵料；每周检查网箱并清除敌害生物，如果养殖密度过大可额外投饵，直至持续培育至可进行底播养殖的大规格海参。
35.优选地，当海参幼体培育水体爆发敌害生物，投加2-3ppm的敌百虫予以杀灭，投加敌百虫2小时后彻底换水；为了抑制病菌滋生，育苗期间每隔3天投加一次2-3ppm的抗菌药物。
36.本发明还提供上述的热带海参人工繁育的方法在繁育热带海参中的应用。
37.优选地，所述的热带海参为玉足海参、棕环海参或米氏海参。
38.本发明的水质控制，为育苗所取用的天然海水在使用前必须经过两级过滤处理或/和紫外杀菌消毒处理。本发明的病敌害防控方法一是通过过滤或/和紫外杀菌消毒清除虫卵和病菌，明育苗用水增加了微孔过滤袋过滤这个环节，可以进一步除去海水中的虫卵等微小颗粒物，从源头上杜绝敌害生物的爆发，二是通过控制单胞藻培养来避免从饵料中引入敌害，三是通过向苗种培育系统中投加药物来杀灭敌害和控制病菌滋生。
39.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
40.(1)本发明相较于已有的传统热带海参人工催产方法如阴干法、流水刺激、热刺激法等来说，解剖法需要的亲参数量很少，并且每次都能获得配子以及受精卵，而其他方法需要亲参的数量较大，并且不一定能每次都能成功催产，因此利用解剖方式进行人工繁育成功率更高。本发明具有操作性强，易于推广，可用于大规模生产热带海参苗种，特别适合于不易催产的种类。本方法为热带海参资源恢复和常规育种及多倍体育种等提供了基础。
41.(2)本发明所用的取性腺方法不会破坏亲体的体壁和脏器等关键结构，取性腺后亲体仍保持着生长活力。本发明取性腺过程中创口较小，海参受损较轻，因此恢复较快，不影响第二年继续作为亲参进行人工繁育。
42.(3)本发明的单胞藻饵料培养完全在室内条件下进行，并且利用全光谱植物生长灯提供光源，加盖无色透明的亚克力板防止飞虫和其他污染物进入培养系统。该方法相较于传统的饵料藻培养方法，不受自然光照的影响，单胞藻可以24小时不间歇地生长，生长速度至少比传统单胞藻的培养方法快1倍。并且可以免受天气、温度、污染物以及飞虫等的影响，可以为海参幼体稳定高效地提供鲜活饵料。
43.(4)本发明打破了热带海参无法通过解剖方式进行人工繁育的观念，首次通过解剖法繁育出玉足海参、棕环海参、米氏海参等几种热带海参种，该方法可以为濒临灭绝且无法进行人工催产的热带海参种群的延续及资源恢复提供了技术保证。
44.(5)利用该方法进行热带海参人工繁育步骤简单且容易操作，通过水质控制、亲本采集、配子获取、受精和孵化、幼体培育等流程，可以有效地克服苗种培育过程中的无法催产/催产效果不佳、产出不稳定以及饵料投喂不科学等一系列问题，培育获得大量热带海参子代，提高了热带海参苗种的人工繁育成功率。
45.(6)本发明具有操作简便、实用性强、易于大规模推广等优点，且利用该方法不会破坏亲体的关键结构，为热带海参的常规数量遗传育种及染色体操纵育种等提供了可能，
也为该类海参资源恢复奠定了理论与实践基础，在热带海参人工繁育和增养殖领域具有十分广阔的应用空间。
附图说明
46.图1为过滤海水用的微孔过滤袋。
47.图2为牟氏角毛藻的一、二、三级培养，其中一级在5l灭菌锥形瓶中(a)，二级用15l透明塑料桶培养(b)，三级培养系统加有机玻璃盖用于防止飞虫污染(c)。
48.图3为解剖获得的玉足海参雌性性腺(a)与雄性性腺(b)。
49.图4为剪成小段的玉足海参雌性性腺。
50.图5为未发育成熟的玉足海参卵(a)与发育成熟的玉足海参卵(b)。
51.图6为解剖法获得的玉足海参的小耳幼体(a)、中耳幼体后期(b)、大耳幼体(c)以及樽型幼体(d)。
52.图7为玉足海参参苗体长到10-20mm。
53.图8为解剖获得的棕环海参雌性性腺(a)与雄性性腺(b)。
54.图9为解剖获得的米氏海参雌性性腺(a)与雄性性腺(b)。
55.图10为剪成小段的棕环海参雌性性腺。
56.图11为剪成小段的米氏海参雌性性腺。
57.图12为解剖法获得的棕环海参的小耳幼体(a)、中耳幼体后期(b)、大耳幼体(c)以及樽型幼体(d)。
58.图13为解剖法获得的米氏海参的小耳幼体(a)、中耳幼体后期(b)、大耳幼体(c)以及樽型幼体(d)。
59.图14为棕环海参参苗体长达到10-20mm。
60.图15为米氏海参参苗体长达到10-20mm。
具体实施方式
61.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的方法和设备为本技术领域常用方法和设备。
62.实施例1：玉足海参人工繁育
63.2022年7月30日开始，利用本发明的方法，在深圳中国科学院大亚湾海洋生物综合实验站进行了玉足海参的人工繁育实验。相关过程如下：
64.(1)水质控制：
65.育苗所用的天然海水取自实验站附近海域，经监测，各种污染物含量均低于第二类海水水质标准。将抽取的海水经砂滤以后再用5微米的过滤袋进行过滤(图1)。由于当地海水病菌等污染物含量较少，因此未进行紫外杀菌消毒处理。本实验过程中处理后海水盐度范围为29-33ppt，温度范围为28-31℃，由此得到适合浮游幼体养殖的海水。
66.(2)单胞藻饵料培养：
67.采用f/2培养基进行牟氏角毛藻培养，采用三级培养。其中：一级保种在恒温车间的5l灭菌锥形瓶中(图2a)，二级扩种采用15l透明塑料桶培养(图2b)，三级培养利用200-400l白色塑料桶进行(图2c)。一、二级培养f/2培养基所用的海水是经煮沸后冷却至室温使
用；三级培养则通过用海水加20ppm消毒粉过夜，然后用10ppm硫代硫酸钠中和后使用。为避免室外培养所面临的污染、风吹雨淋、光线不稳定以及高温等危害，牟氏角毛藻培养均在室内进行：利用全光谱日光灯(20-50瓦，10000-30000lx)持续提供光照，晚上三级培养所用的塑料桶用亚克力板做盖进行全程保护。如此培养可以加快微藻生长速度。根据接种密度，一般2-3d内牟氏角毛藻就可以达到指数增长期。这种培养方法牟氏角毛藻不依赖自然光照，可以全天候不停地快速生长，能够避免受到室外培养风吹雨淋、高温等危害，也可以避免原生动物等敌害，能稳定地为海参幼体提供鲜活单胞藻饵料，将其直接投喂也不会引入病/敌害。
68.(3)受精卵获得：
69.在热带海参性腺成熟的季节，于自然海区采集野生的热带海参作为亲体。玉足海参亲参采自大亚湾海域，暂养3天适应室内环境并清空肠道后，采用本发明所述的方法获得玉足海参雌性性腺(图3a)和雄性性腺(图3b)：从尾部切开一小口，将性腺从开口处取出，过程中尽量不破坏体壁和其他脏器，从而减少对亲参的伤害。
70.将雌性性腺剪为《5mm的小段(图4)，让卵子自然流出，流出的大部分卵子尚未激活，生发泡依旧存在(图5a)。阴干2h使生发泡破裂，经过200目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液经过300目筛绢网浓缩，去除小的碎组织块，随后放置于干净海水中浸泡30-60min以激活卵子，卵子激活成功的标准是外形变圆，生发泡破裂(图5b)。
71.选择性腺发育良好的雄性亲参，解剖获得性腺，压碎后经过400目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液放置于干净海水中静置5-15min以激活精子，镜检并选取活性高的精子使用。
72.将卵子浓缩后收集于5l的塑料量杯中，加入新鲜海水，添加精子；搅拌，静置，去除上清液，此过程重复3次以去除多余的精子及不良受精卵等杂质；之后将收集到的受精卵加入数个1m3孵化池中，孵化池中受精卵密度为3-5个/ml，培育期间持续充气使受精卵不至于沉底，受精卵在温度28-31℃，盐度29-33ppt条件下，每天换水1/3左右，培育2天待受精卵发育至小耳状幼体能够开口摄食时则进行分池，分池后幼体的密度为1个/ml。
73.(4)浮游幼体培育：
74.玉足海参浮游幼体在光照强度不超过1000lx的室内封闭环境中进行培育，温度28-31℃，盐度29-33ppt，整个培育过程中保持适度充气，使幼体一直处于悬浮状态。
75.玉足海参浮游幼体培育以中耳幼体后期为界，分为两个阶段。第一个阶段为小耳幼体开口摄食(图6a)至中耳幼体后期(图6b)，每天换水1/3，清晨和下午换水后各投喂牟氏角毛藻和面包酵母混合液一次，每次投喂量为5l/m3水体，全天投喂量为10l/m3水体；第二阶段为中耳幼体后期之后，包括大耳幼体(图6c)至樽型幼体(图6d)阶段，每天换水1/2，清晨和下午换水后投喂牟氏角毛藻和面包酵母混合液一次，每次投喂量为10l/m3水体，全天投喂量为20l/m3水体；换水时根据幼体的发育情况选用合适规格的筛绢网过滤，以避免浮游幼体跑出，每3天利用虹吸法吸一次池底，以除去池底死亡幼体和残余的饵料及粪便；浮游幼体培育过程中每3天测定一次成活率、体长以及水质。当海参幼体培育水体爆发桡足类和蚊幼等敌害生物，投加2-3ppm的敌百虫予以杀灭，投加敌百虫2小时后彻底换水；为了抑制病菌滋生，育苗期间每隔3天投加一次2-3ppm的青霉素等抗菌药物。
76.牟氏角毛藻和面包酵母混合液：将处于指数增长期的牟氏角毛藻搭配面包酵母制
备饵料，其中牟氏角毛藻密度不低于200万个/ml，面包酵母利用200目筛绢干净海水中搓碎配成0.1g/l的悬浊液，然后将角毛藻液和面包酵母悬浊液按照体积比3:1的比例混合后作为饵料进行投喂。
77.(5)幼体附着及培育：
78.当30％以上的海参浮游幼体发育至樽型幼体阶段时开始投放附着基，附着基为附着底栖硅藻的聚乙烯波纹板，每立方米水体投放10-15套附着基(波纹板规格为31cm
×
39cm；20片/套)，投放后每天换水1/2，清晨和下午换水后继续投喂牟氏角毛藻和面包酵母混合液，投喂量随着水体中浮游幼体密度的降低而减少。换水时根据幼体的发育情况选用合适规格的筛绢网过滤，每3天利用虹吸法吸一次池底，以除去池底死亡幼体和残余的饵料及粪便。另外每天早晚各投喂1次5ppm的市售仿刺参稚参配合饵料，仿刺参稚参配合饵料使用前均用利用200目筛绢在处理好的海水中搓碎配成悬浊液。当幼体全部附着后(以育苗水体中无浮游幼体为准)，停止投加牟氏角毛藻和面包酵母混合液，转而以投喂仿刺参稚参配合饵料为主，投饵量随着苗种的生长而增加，持续培养获得热带海参苗种。当苗种体长达到2mm以上时，每周通过虹吸法清除池底残饵和粪便一次。每天早晚各换水一次，每次换水1/2，换水后均进行投喂，每次投喂量增至20ppm，具体视苗种附着量而定。当海参幼体培育水体爆发敌害生物，处理方法如步骤(4)。
79.(6)热带海参的中间养成：
80.当参苗体长达到10-20mm(图7)，就可以转移至室外海上网箱中进行中间养成。中间养成网箱为长1m，宽1m，高1m的尼龙网网箱，网眼大小为2mm。网箱需要提前一周布置，以自然附着底栖硅藻作为饵料。网箱每周都需要进行检查，如发现敌害生物，应立即予以清除。中间养成期间可额外投喂人工配合饵料提高海参生长速度，持续培育获得大规格海参。
81.对比解剖法繁育玉足海参与阴干法(cn102090363a)繁育玉足海参幼体发育速度(表1)，实验过程中发现两种催产方法繁育的玉足海参幼体发育速度并无太大差异。解剖法繁育的玉足海参受精卵约36小时后孵化成功至小耳幼体(图6a)，受精后约5天，幼体逐渐变大，长出新的体臂，发育到中耳状幼体(图6b)，受精后10-14天，幼体发育到大耳状幼体时期(图6c)，浮游阶段幼体体型达到最大，且长出在海参幼体变态发育过程起着非常重要的作用的球状体。受精后14-20天左右，大耳幼体后期幼体体内和体外开始发生显著变化，体型急剧收缩变小，幼体发育成樽形幼体(图6d)，逐渐失去浮游能力，幼体也由浮泳状态转入附着状态。受精后90天，当参苗体长达到10-20mm(图7)以上，转移至室外网箱中进行中间养成。
82.表1玉足海参从受精卵到稚参发育时间表
83.[0084][0085]
实施例2：棕环海参和米氏海参人工繁育
[0086]
2022年7月30日开始，利用本发明的方法，在深圳中国科学院大亚湾海洋生物综合实验站进行了棕环海参、米氏海参的人工繁育实验。目前，这两种海参目前均尚未成功地进行过人工催产和繁育，相关过程如下(两种海参的繁育方法相同，只是不同种类的海参分开处理，繁育过程中的水质控制和单胞藻饵料培养如实施例1)：
[0087]
(1)受精卵获得：
[0088]
两种热带海参亲参采自大亚湾海域，暂养3天适应室内环境并清空肠道后，采用解剖法获得棕环海参雌性性腺(图8a)和雄性性腺(图8b)，米氏海参雌性性腺(图9a)和雄性性腺(图9b)：从尾部切开一小口，将性腺从开口处取出，过程中尽量不破坏体壁和其他脏器，从而减少对亲参的伤害。
[0089]
将雌性性腺剪为《5mm的小段(图10、图11)，让卵子自然流出，流出的大部分卵子尚未激活，生发泡依旧存在。阴干2h使生发泡破裂，经过200目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液经过300目筛绢网浓缩，去除小的碎组织块，随后放置于干净海水中浸泡30-60min以激活卵子，卵子激活成功的标准是外形变圆，生发泡破裂。
[0090]
选择性腺发育良好的雄性亲参，解剖获得性腺，压碎后经过400目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液放置于干净海水中静置5-15min以激活精子，镜检并选取活性高精子使用。
[0091]
将卵子浓缩后收集于5l的塑料量杯中，加入新鲜海水，添加精子；搅拌，静置，去除上清液，此过程重复3次以去除多余的精子及不良受精卵等杂质；之后将收集到的受精卵加入数个1m3孵化池中，孵化池中受精卵密度为3-5个/ml，培育期间持续充气使受精卵不至于沉底，精卵在温度28-31℃，盐度29-33ppt条件下，每天换水1/3左右，培育2天待受精卵发育至小耳状幼体能够开口摄食时进行分池，分池后幼体的密度为1个/ml。
[0092]
(2)浮游幼体培育：
[0093]
海参浮游幼体在光照强度不超过1000lx的室内封闭环境中进行培育，温度28-31℃，盐度29-33ppt，整个培育过程中保持适度充气，使幼体一直处于悬浮状态。
[0094]
海参浮游幼体培育以中耳幼体后期为界，分为两个阶段。第一个阶段为小耳幼体发育至中耳幼体后期之前，每天换水1/3，清晨和下午换水后各投喂牟氏角毛藻和面包酵母混合液(如实施例1所述)一次，每次投喂量为5l/m3水体，全天投喂量为10l/m3水体；第二阶段为中耳幼体后期之后，包括大耳幼体至樽型幼体阶段，每天换水1/2，清晨和下午换水后投喂牟氏角毛藻和面包酵母混合液一次，每次投喂量为10l/m3水体，全天投喂量为20l/m3水体；换水时根据幼体的发育情况选用合适规格的筛绢网过滤，以避免海参浮游幼体跑出，每3天利用虹吸法吸一次池底，以除去池底死亡幼体和残余的饵料及粪便；浮游幼体培育过程中每3天测定一次成活率、体长以及水质。当海参幼体培育水体爆发桡足类和蚊幼等敌害生物，投加2-3ppm的敌百虫予以杀灭，投加敌百虫2小时后彻底换水；为了抑制病菌滋生，育苗期间每隔3天投加一次2-3ppm的青霉素等抗菌药物。
[0095]
(3)幼体附着及培育：
[0096]
当30％以上的海参浮游幼体发育至樽型幼体阶段时开始投放附着基，附着基为附着底栖硅藻的聚乙烯波纹板，每立方米水体投放10-15套附着基(波纹板规格为31cm
×
39cm；20片/套)，投放后每天换水1/2，清晨和下午换水后继续投喂牟氏角毛藻和面包酵母混合液，投喂量随着水体中浮游幼体密度的降低而减少。换水时根据幼体的发育情况选用合适规格的筛绢网过滤，每3天利用虹吸法吸一次池底，以除去池底死亡幼体和残余的饵料及粪便。另外每天早晚各投喂1次5ppm的市售仿刺参稚参配合饵料，稚参配合饵料使用前均用利用200目筛绢在处理好的海水中搓碎配成悬浊液。当幼体全部附着后(以育苗水体中无浮游幼体为准)，停止投加牟氏角毛藻和面包酵母混合液，转而以投喂稚参配合饵料为主，投饵量随着苗种的生长而增加，持续培养获得热带海参苗种。当苗种体长达到2mm以上时，每周通过虹吸法清除池底残饵和粪便一次。每天早晚各换水一次，每次换水1/2，换水后均进行投喂，每次投喂量增至20ppm，具体视苗种附着量而定。当海参幼体培育水体爆发敌害生物，处理方法如步骤(2)。
[0097]
(4)热带海参的中间养成：
[0098]
当参苗体长达到10-20mm以上，就可以转移至室外海上网箱中进行中间养成。中间养成网箱为长1m，宽1m，高1m的尼龙网网箱，网眼大小为2mm。网箱需要提前一周布置，以附着一定量的底栖硅藻。网箱每周都需要进行检查，如发现敌害生物，应立即予以清除。如果养殖密度过大可额外投人工配合饵料，直至持续培育至可进行底播养殖的大规格海参。
[0099]
对比解剖法繁育棕环海参与米氏海参幼体发育速度(表2)，实验过程中发现两种海参幼体发育速度相差无几。解剖法繁育的棕环海参受精卵约44小时后孵化成功至小耳幼体(图12a)，米氏海参约42小时孵化成功至小耳幼体(图13a)。受精后约5天，幼体逐渐变大，长出新的体臂，两者均发育到中耳状幼体(图12b，图13b)。受精后10-14天，幼体发育到大耳状幼体时期(图12c，图13c)，浮游阶段幼体体型达到最大，且长出在海参幼体变态发育过程起着非常重要的作用的球状体。受精后15天左右，大耳幼体后期幼体体内和体外开始发生显著变化，体型急剧收缩变小，幼体发育成樽形幼体(图12d，图13d)，逐渐失去浮游能力，幼体也由浮泳状态转入附着状态。受精后90天，当参苗体长达到10-20mm(图14，图15)以上，转移至室外网箱中进行中间养成。
[0100]
表2棕环海参、米氏海参从受精卵到稚参发育时间表
[0101][0102][0103]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种热带海参人工繁育的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、水质控制：取用天然海水，处理至其污染物含量低于第二类海水水质标准；b、海参亲本采集：采集性腺成熟的热带海参；c、配子获取：清空海参亲本肠道后，取出性腺剪碎或压碎使卵子或精子流出，分别激活卵子和精子；d、受精和孵化：将卵子和精子混合并进行洗卵，收集受精卵进行孵化，控制孵化密度，持续充气使受精卵悬浮，待受精卵发育至小耳状幼体能够开口摄食时进行分池处理；e、浮游幼体培育：在室内封闭环境中培育浮游幼体，控制密度，保持充气，使幼体一直处于悬浮状态；每天换水并投喂角毛藻和面包酵母、定期除去池底死亡幼体和残饵及粪便；f、幼体附着及培育：当30％以上的浮游幼体发育至樽型幼体阶段时开始投放附着基，投放后每天换水并投喂角毛藻和面包酵母以及稚参配合饵料，稚参配合饵料投喂量随着苗种的生长而增加，角毛藻和面包酵母逐渐减少，当浮游幼体全部附着后，停止投喂角毛藻和面包酵母，持续培养获得大规格热带海参苗种；g、热带海参的中间养成：当热带海参苗种长至10-20mm，收集并转移至室外网箱进行养殖，网箱提前搭建，以自然附着的底栖硅藻作为饵料，中间养成期间可额外投喂人工配合饵料提高稚参生长速度，持续培育获得大规格海参。2.根据权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法，其特征在于，所述的步骤c的剪碎为将雌性性腺剪成<5mm的小段。3.根据权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法，其特征在于，所述的步骤c的压碎为将雄性性腺压碎。4.根据权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法，其特征在于，所述的步骤c的取出性腺为将亲本暂养以清空其肠道后，从尾部切开一小口，将性腺从开口处取出，过程中尽量不破坏体壁和其他脏器，从而减少对亲参的伤害。5.根据权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法，其特征在于，所述的步骤c的激活卵子和精子为将卵子浸泡在权利要求1所述的步骤a的海水中30-60min、将精子浸泡在权利要求1所述的步骤a的海水中5-15min。6.根据权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法，其特征在于，所述的热带海参为玉足海参、棕环海参或米氏海参。7.根据权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法，其特征在于，所述的角毛藻和面包酵母为角毛藻搭配面包酵母制备饵料，其中角毛藻密度不低于200万个/ml，面包酵母利用200目筛绢干净海水中搓碎配成0.1g/l的悬浊液，然后将角毛藻液和面包酵母悬浊液按照体积比3:1的比例混合；所述的角毛藻为指数增长期的牟氏角毛藻；所述的稚参配合饵料为仿刺参稚参配合饵料。8.根据权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法，其特征在于，具体为：a、水质控制：取用天然海水，在使用前经过两级过滤处理或/和紫外杀菌消毒处理，具体为：两级过滤中第一级为普通的砂滤，用于除去天然海水中的大颗粒物，第二级为利用孔径不超过5微米的过滤袋过滤，用于进一步除去微小颗粒物；为除去海水中的病原菌，在任何一级过滤处理前/后将海水进行紫外杀菌消毒处理，处理后海水盐度范围为29-33ppt，温度范围为26-31℃，由此得到处理后的合格海水；
b、海参亲本采集：在热带海参性腺成熟的季节，于自然海区采集野生的热带海参作为亲体；c、配子获取：将亲本暂养以清空其肠道后，从尾部切开一小口，将性腺从开口处取出，过程中尽量不破坏体壁和其他脏器，从而减少对亲参的伤害；卵子收集方法：选择性腺发育良好的雌性亲参，解剖获得性腺，将性腺剪为<5mm的小段，让卵子自然流出，然后阴干1-2h后，利用200目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液经过300目筛绢网浓缩，去除小的碎组织块，随后放置于权利要求1所述的海水中浸泡30-60min以激活卵子，卵子激活成功的标准是外形变圆，生发泡破裂；精子收集方法：选择性腺发育良好的雄性亲参，解剖获得性腺，压碎后经过400目筛绢网过滤，去除大的组织块，将滤液放置于权利要求1所述的海水中静置5-15min以激活精子，镜检并选取活性高的精子使用；d、受精和孵化：将卵子收集于5l的塑料量杯中，加入新鲜海水，添加精子；搅拌，静置，去除上清液，重复3次以去除多余的精子及不良受精卵等杂质；之后将收集到的受精卵加入孵化池中，孵化池中受精卵密度为3-5个/ml，培育期间持续充气使受精卵均匀悬浮；受精卵在温度28-31℃，盐度29-33ppt条件下，日换水量1/4-1/2，培育2天待受精卵发育至小耳状幼体能够开口摄食时进行分池，分池后幼体密度不超过1个/ml；e、浮游幼体培育：在室内封闭环境中培育浮游幼体，控制密度，并在整个培育过程中保持适度充气，使幼体一直处于悬浮状态；海参浮游幼体培育以中耳幼体后期为界，分为两个阶段：第一个阶段为小耳幼体发育至中耳幼体后期之前，每天换水1/3，清晨和下午换水后各投喂角毛藻和面包酵母一次，每次投喂量为5l/m3水体，全天投喂量为10l/m3水体；第二阶段为中耳幼体后期之后，包括大耳幼体至樽型幼体阶段，每天换水1/2，清晨和下午换水后投喂角毛藻和面包酵母一次，每次投喂量为10l/m3水体，全天投喂量为20l/m3水体；换水时用筛绢网过滤，以避免海参浮游幼体跑出，每3天利用虹吸法吸一次池底，以除去池底死亡幼体和残余的饵料及粪便；f、幼体附着及培育：当30％以上的浮游幼体发育至樽型幼体阶段时开始投放附着基，附着基为附着底栖硅藻的聚乙烯波纹板，每立方米水体投放10-15套附着基，投放后每天换水1/2，清晨和下午换水后继续投喂角毛藻和面包酵母，投喂量随着水体中浮游幼体密度的降低而减少；另外每天早晚各投喂1次5ppm的稚参配合饵料，稚参配合饵料使用前利用200目筛绢在干净海水中搓碎配成悬浊液；当浮游幼体全部附着后，停止投喂角毛藻和面包酵母，转而以投喂稚参配合饵料为主，投饵量随着苗种的生长而增加，当苗种体长达到2mm以上时，每周通过虹吸法清除池底残饵和粪便一次，每天早晚各换水一次，每次换水1/2，换水后均进行投喂，每次投喂量增至20ppm，持续培养获得大规格热带海参苗种；g、热带海参的中间养成：当热带海参苗种长至10-20mm，转移至海上网箱中进行中间养成，网箱为长1m，宽1m，高1m的尼龙网网箱，网眼大小为2mm，网箱需要提前一周布置，以附着底栖硅藻作为饵料；每周检查网箱并清除敌害生物，如果养殖密度过大可额外投饵，直至持续培育至可进行底播养殖的大规格海参。9.权利要求1所述的热带海参人工繁育的方法在繁育热带海参中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的热带海参为玉足海参、棕环海参或
米氏海参。

技术总结
本发明公开了一种热带海参人工繁育的方法。包括海参亲本采集、配子获取、受精和孵化、浮游幼体培育、幼体附着及培育、以及热带海参的中间养成。首次通过解剖获得精卵的方式培育出玉足海参、棕环海参和米氏海参苗种。为濒临灭绝且无法进行人工催产的热带海参种群的延续及资源恢复提供了技术保证，利用该方法进行热带海参人工繁育步骤简单且容易操作，可以有效地克服苗种培育过程中的无法催产/催产效果不佳、产出不稳定以及饵料投喂不科学等一系列问题，提高了热带海参苗种的人工繁育成功率，且利用该方法不会破坏亲体的体壁和其他脏器等关键结构，在热带海参人工繁育和增养殖领域具有十分广阔的应用空间。具有十分广阔的应用空间。具有十分广阔的应用空间。


技术研发人员：于宗赫 洪泽森 吴鸿 岑轶锟 黄肇雷
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/23