生物组织参照切片、生物标志物的检测方法及应用与流程

1.本发明涉及化学检测领域，特别涉及一种生物组织参照切片及其应用，利用该组织切片的生物标志物的检测方法及其试剂盒和检测系统。


背景技术：

2.各类肿瘤的发生和发展过程都有一定的代谢产物产生，肿瘤代谢组的变化大多是由于基因突变造成的，因此针对肿瘤代谢产物和基因突变的检测可以有效地预判肿瘤发展过程并协助肿瘤分期，对进一步采取有效治疗手段、改善预后具有指导意义，但是现有检测方法操作复杂、检测周期长，无法快速响应临床需求。基因突变常见检测手段主要有基因测序(sanger)、免疫组织化学法(ihc)，定量聚合酶链反应(qpcr)等，这些方法通常劳动密集、样品等预处理复杂，需要熟练掌握核酸提取、pcr操作等复杂精巧的实验技能；另外，这些方法耗时长，通常完成单次实验时长在4小时以上，尤其是临床上多采用的ihc和sanger方法出具最终报告要1天左右。对肿瘤代谢产物的定性和定量检测有多种方法，如利用气质或液质联用系统(gc/lc-ms)、磁共振光谱(mrs)、解析电喷雾离子色谱(desi-ms)、快速蒸发电离质谱(rei-ms)等手段检测。这些色谱或质谱检测方法结果准确可靠，但是同样需要复杂且耗时的前处理过程和样品组分分离过程。
3.而且，上述方法都是针对肿瘤患者的血清样本或者肿瘤组织的细胞破碎样本进行检测，无法实现肿瘤组织的原位检测。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了生物组织参照切片及其用途，以及检测生物组织中生物标志物的方法、试剂盒和检测系统，利用该生物组织参照切片和方法可实现生物标志物的原位定量检测，检测结果准确、检测周期短、样品预处理操作简单，临床应用价值高。
5.需要声明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
6.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)是一种软电离生物质谱，其原理是用激光照射基质与样品分子形成的共结晶，基质从激光中吸收能量并传递给生物分子，使生物分子解吸并离子化，从而实现电离的过程。maldi-tof-ms由于其特有的软电离方式离子源，特别适用于检测蛋白、多肽、脂质等生物大分子，目前在生命科学、医学等领域应用越来越广泛。其中，maldi-tof-ms成像图是将当次检测样本中信号强度最高的扫描点的生物分子的丰度赋值100％，其他扫描点根据其检测信号强度的高低进行不同丰度赋值，最终在maldi-tof-ms成像图中，不同空间生物分子丰度显示不同的颜色。
7.发明人尝试利用maldi-tof-ms对非小细胞肺癌(nsclc)的肿瘤标志物琥珀酸进行检测发现：a)对非小细胞肺癌组织切片样本的琥珀酸分子进行扫描得到的成像图，只能反应琥珀酸分子含量的相对高低，不能体现样本中琥珀酸分子的具体含量或浓度；b)同时，基于maldi-tof-ms成像图原理，不同批次样本maldi-tof-ms成像图琥珀酸丰度赋值100％的
扫描点的信号强度高低不同，导致不同次或不同样本的成像图，其数据无可比性。因此，无法通过maldi-tof-ms实现nsclc组织切片样本中琥珀酸的原位定量检测。
8.进一步地，发明人创造性地在maldi-tof-ms检测过程中，设置了含有琥珀酸标准品的肺组织切片，既是琥珀酸含量对照，又是琥珀酸在肺组织中空间分布的浓度对照。在具体的试验中，发明人创造性地将琥珀酸的标准品溶液与健康的肺组织切片接触，并发现琥珀酸可进一步分布至切片组织中，进而得到了含有琥珀酸标准品的肺组织切片。发明人通过控制标准品的量及其与组织切片的接触区域，可在一个肺组织切片中形成多个分布有琥珀酸的区域，这些区域空间内琥珀酸的总含量及其在单位体积肺组织中的含量确定。
9.进一步的试验结果表明，通过在maldi-tof-ms质谱检测中设置上述含有标准品的生物组织切片作为对照，可实现生物组织中生物标志物的原位定量检测；同时质谱检测样本预处理操作简单、耗时短。
10.在本发明的一个方面，本发明提出了一种生物组织参照切片。所述参照切片包含：标准品，所述标准品分布于所述生物组织切片的至少部分区域，所述标准品含有生物标志物，所述生物标志物用于鉴定所述生物组织的生理状态。本发明的生物组织参照切片可作为阳性对照，用于生物标志物的检测，为生物组织的生理生化状态的预判提供参考。
11.在本发明的另一个方面，本发明提出了上述生物组织参照切片在检测待测生物组织中所述生物标志物中的应用。上述生物组织参照切片可进一步用于检测待测生物组织中所述生物标志物的含量，所述检测可以是定性的，也可以是定量的，还可以是原位检测。本发明的应用为生物组织生物标志物的检测提供了多种可选方案，提高了检测方法的选择度。
12.在本发明的再一方面，本发明提出了一种生物组织中生物标志物的检测方法。本发明的检测方法可实现生物组织中标志物的检测，尤其是生物组织生物标志物的原位定量检测，并且检测结果准确、检测周期短，检测结果可为生物组织的生理生化状态的预判提供参考，尤其为肿瘤的发生发展阶段的预测提供有效参考并协助肿瘤浸润程度、肿瘤分期、肿瘤转移程度的预判等，有助于进一步采取有效治疗手段、改善预后，具有良好的临床价值。
13.在本发明的再一方面，本发明提出了一种试剂盒。本发明的试剂盒用于生物组织生物标志物的检测，可降低操作复杂性，进一步缩短检测时长，利于本发明的生物组织切片和生物标志物的检测方法在化学检测领域的广泛应用。
14.在本发明的最后一方面，本发明提出了一种检测系统。本发明的检测系统可实现生物组织中生物标志物检测的全流程控制。
15.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
16.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
17.图1为本发明实施例3中琥珀酸[m-h
+
]m/z 117.09和琥珀酸-13
c4[m-h
+
]m/z 121.06的质谱峰图；
[0018]
图2为本发明实施例3中含琥珀酸标准品的肺组织切片样本的质谱成像图；
[0019]
图3为本发明实施例3中含琥珀酸标准品的肺组织切片样本的9个浓度梯度标准品的质谱峰的叠加图；
[0020]
图4为本发明实施例3中琥珀酸标准品的质谱峰强度相对标准品稀释浓度(1，5，10，20，50，100，200，400，800pmol/μl)的标准曲线图；
[0021]
图5为本发明实施例3中琥珀酸标准品的质谱峰强度相对琥珀酸标准品分布区域内单位体积肺组织中琥珀酸含量的线性回归曲线图；
[0022]
图6为本发明实施例5中i～ⅱ期非小细胞肺癌组织样本的质谱成像图；
[0023]
图7为本发明实施例5中iii期非小细胞肺癌组织样本的质谱成像图；
[0024]
图8为本发明实施例5中不同肿瘤分期的q值分布箱形图；
[0025]
图9为本发明实施例5中q值列表和tnm结果的roc分析结果图。
具体实施方式
[0026]
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0027]
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0028]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0029]
生物组织参照切片
[0030]
本发明提供一种生物组织参照切片。所述参照切片包含：标准品，所述标准品分布于所述生物组织切片的至少部分区域，所述标准品含有生物标志物，所述生物标志物用于鉴定所述生物组织的生理状态。由此，本发明的生物组织参照切片可作为阳性对照，用于生物标志物的检测，为生物组织的生理生化状态的预判提供参考。
[0031]
需要说明的是，本技术所述的“生物组织的生理状态”是指所述生物组织健康或病理状态，如是来源于健康个体或是癌症组织。
[0032]
根据本技术的实施例，所述生物标志物需要选择与生物组织的生理状态相关的标志物，如选择琥珀酸。
[0033]
在本文中，所述生物组织可以是上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织的任一种。
[0034]
根据本发明的实施例，所述生物组织来源于健康个体。
[0035]
根据本发明的实施例，生物组织中所述生物标志物的含量为零。
[0036]
由此，消除生物标志物在生物组织中的正常表达或生物组织本身对检测结果的影响。
[0037]
根据本发明的实施例，所述标准品分布于所述生物组织参照切片预定数量的不同区域，所述预定数量的不同区域不重叠。由此，不同区域的标准品可独立地作为阳性对照。
[0038]
任选地，分布于不同区域内的所述标准品的含量不同。由此，形成标准品含量不同的系列区域，进而得到的生物组织参照切片既可以作为生物标志物的含量高低的对照，又可以作为生物标志物在组织中空间分布多少的对照，生物组织的生理生化状态的预判提供更准确的参考，尤其为肿瘤的发生发展阶段的准确预测提供有效参考并协助肿瘤浸润程度、肿瘤分期、肿瘤转移程度的预判，有助于进一步采取有效治疗手段、改善预后。
[0039]
根据本发明的实施例，所述切片是冰冻切片或石蜡切片。由此，可进一步制备检测用组织样本，比如maldi-tof-ms检测样本。
[0040]
根据本发明的实施例，所述切片是冰冻切片。由此得到的切片可用于肿瘤的快速病理组织诊断。
[0041]
根据本发明的实施例，所述生物标志物是琥珀酸，所述生物组织来源于肺组织。由此可得到以琥珀酸为生物标志物的组织切片，进一步用于非小细胞肺癌的疾病的临床病理诊断。
[0042]
应用
[0043]
本发明提供上述生物组织切片在检测生物标志物中的应用。由此，本发明为生物标志物的检测提供了多种可选方案。
[0044]
根据本发明的实施例，所述检测是原位定量检测。由此，为临床样本的原位定量分析和病理诊断提供更准确的依据。
[0045]
检测方法
[0046]
本发明提供一种检测生物组织中生物标志物的方法。所述方法利用maldi-tof-ms质谱分别对待测生物组织切片和上述生物组织参照切片进行检测，获得待测生物组织切片和生物组织参照切片的质谱峰图和质谱成像图；基于质谱峰图和质谱成像图，确定所述待测生物组织切片中的生物标志物的含量。本发明的方法，通过在maldi-tof-ms检测过程中设置生物组织参照切片，实现了生物组织中生物标志物的原位定量，进一步为生物组织的生理生化状态的预判提供参考，尤其为肿瘤的发生发展阶段的预测提供有效参考并协助肿瘤浸润程度、肿瘤分期、肿瘤转移程度的预判，有助于进一步采取有效治疗手段、改善预后。
[0047]
根据本发明的实施例，基于质谱峰图和质谱成像图，确定所述待测生物组织切片中的生物标志物的含量是通过如下方式实现的：
[0048]
(1)基于生物组织参照切片的质谱峰图，获得生物组织参照切片预定区域中标准品的质谱峰强度；
[0049]
(2)基于所述生物组织参照切片中预定区域中标准品的质谱峰强度以及标准品的第一浓度，确定第一标准曲线，所述第一浓度为标准品加入到所述生物组织参照切片预定区域前的浓度；
[0050]
(3)基于所述生物组织参照切片中预定区域的厚度和面积，确定所述生物组织参照切片中预定区域的体积；
[0051]
(4)基于所述生物组织参照切片预定区域中标准品的含量以及所述预定区域的体积获得所述预定区域单位体积中所述标准品的含量；
[0052]
(5)基于所述生物组织参照切片中预定区域中标准品的质谱峰强度以及所述预定区域单位体积中所述标准品的含量，确定第二标准曲线；
[0053]
(6)基于待测生物组织切片的质谱成像图，选取感兴趣区域roi，获得roi的面积；
[0054]
(7)基于待测生物组织切片样本的质谱峰图，获得roi的质谱峰强度；
[0055]
(8)基于所述roi的质谱峰强度以及所述第二标准曲线，确定roi中生物标志物在待测生物组织切片样本相同预定区域中单位体积中所述生物组织中的含量，和/或roi中生物标志物的总含量。
[0056]
根据本发明的实施例，还包括如下步骤：
[0057]
(9)基于待测生物组织切片样本的质谱成像图，选择预定多个roi，获得预定多个roi中每个roi中生物标志物在单位体积生物组织中的含量和面积的乘积；
[0058]
(10)基于所述预定多个roi中每个roi中生物标志物在单位体积生物组织中的含量和面积的乘积，获得预定多个roi的乘积之和；
[0059]
根据本发明的实施例，还包括如下步骤：
[0060]
基于所述预定多个roi的乘积之和与待测生物组织切片样本的预定多个roi面积之和的比值，确定生物标志物在单位体积生物组织中的相对含量。
[0061]
生物标志物在组织样本中的分布并不均匀，通过上述方法可以确定多个感兴趣区域的标志物的总含量及其在整块肿瘤组织中的相对浓度，即在单位体积生物组织中的相对含量。
[0062]
根据本发明的实施例，所述质谱峰图和质谱成像图通过所述生物标志物的内标质谱峰质量校准后得到。由此，获得准确的质谱数据。
[0063]
根据本发明的实施例，所述内标是所述生物标志物的同位素标志物。
[0064]
在本文中，所述同位素可以是生物标志物中的任一原子的同位素，示例性地，可以引入生物标志物中的同位素包括不限于氢、碳、氮、氧、硫，即2h，3h、
13
c、
14
c、
15
n、
17
o、
18
o、
35
s。
[0065]
根据本发明的实施例，所述同位素是
13
c。由此，获得质谱峰分离度较佳的质谱峰图。
[0066]
根据本发明的实施例，所述组织切片样本通过如下方式得到：
[0067]
a)将基质溶液与所述生物标志物的内标溶液混合后涂覆至可导电载玻片表面；
[0068]
b)将健康的生物组织或所述生物标志物的含量为零的生物组织切片后，转移至步骤a)所得的载玻片，间隔滴加梯度稀释的所述生物标志物的标准品；和/或
[0069]
将待测生物组织切片后转移至步骤a)所得的载玻片；
[0070]
c)在步骤b)的载玻片上涂覆基质溶液。
[0071]
通过上述方法得到经电离化处理的样本，可进一步用于maldi-tof-ms检测。
[0072]
根据本发明的实施例，所述可导电载玻片是氧化烟锡可导电载玻片。
[0073]
根据本发明的实施例，所述基质溶液是1,5-二氨基壬萘。
[0074]
根据本发明的实施例，所述基质溶液是将1,5-二氨基壬萘以10mg/ml的浓度溶解于acn和tfa的混合液中。
[0075]
根据本发明的实施例，按体积比计，所述混合液中acn与tfa的比值为(6∶4)～(4∶6)。
[0076]
根据本发明的实施例，按体积比计，所述基质溶液与所述内标溶液按(1∶5)～(1∶20)的比例混合。
[0077]
根据本发明的实施例，所述基质溶液与所述内标溶液按1∶10的比例混合。
[0078]
根据本发明的实施例，重复所述步骤a)和/或步骤c)至少1次。
[0079]
根据本发明的实施例，重复步骤a)1～5次。
[0080]
根据本发明的实施例，重复步骤c)10～30次。
[0081]
在本文中，不同的重复操作间隔一定的时长，可以根据具体的实验设备及实验环境做出适应性调整，在此不做限定。
[0082]
根据本发明的实施例，所述涂覆操作是通过基质喷涂仪来实现基质溶液和/或基质溶液与所述内标溶液的混合液的喷涂。由此，得到一致性较好的电离化处理的样本，利于快速批量高质量地处理maldi-tof-ms检测样本。
[0083]
根据本发明的实施例，所述基质喷涂仪的喷涂流速是0.1～0.3ml/min。
[0084]
通过上述实验条件的优化，得到电离度良好的样本，利于maldi-tof-ms检测和获得高质量质谱扫描数据。
[0085]
根据本发明的实施例，所述喷涂在惰性气体环境下进行。
[0086]
根据本发明的实施例，所述惰性气体任选自氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气、氡气的至少之一。
[0087]
根据本发明的实施例，所述惰性气体选自氮气。
[0088]
通过控制样本喷涂所处空间的气体环境，尽可能地使用于maldi-tof-ms检测的样本的生物组织生理状态和生物标志的分子状态与样本处理前一致。
[0089]
根据本发明的实施例，所述生物组织是肿瘤组织，所述生物标志物是肿瘤标志物。
[0090]
根据本发明的实施例，所述肿瘤是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈部癌的至少之一。基于相同或相近的技术构思，本发明的方法可以用于其他肿瘤组织中生物标志物的原位定量检测，尤其是恶性肿瘤标志物的检测。
[0091]
根据本发明的实施例，所述肿瘤是非小细胞肺癌，所述肿瘤组织标志物是琥珀酸，所述内标是琥珀酸-13
c4。由此，为非小细胞肺癌的临床病理诊断提供琥珀酸含量水平的数据，为非小细胞肺癌发生发展阶段的预测提供有效参考，进一步协助肿瘤浸润程度、肿瘤分期、肿瘤转移程度的预判，帮助采取有效治疗手段、改善预后。
[0092]
试剂盒
[0093]
本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒含有上述生物组织参照切片，或所述试剂盒的工作原理基于上述方法。本发明的试剂盒可降低生物标志物检测的复杂性，进一步缩短检测时长，利于本发明的生物组织切片和生物标志物的检测方法在化学检测领域的广泛应用。
[0094]
根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括说明书。由此，方便检测人员快速掌握检测原理、检测步骤、操作注意事项等，提高检测效率。
[0095]
检测系统
[0096]
本发明提供一种检测系统，所述系统包括上述生物组织参照切片，或所述系统包括上述试剂盒，或所述系统的运行基于上述方法。由此实现生物组织中生物标志物检测的全流程控制。
[0097]
根据本发明的实施例，所述检测系统包括maldi-tof-ms样本可电离化处理模块、maldi-tof-ms数据采集模块、maldi-tof-ms数据分析模块。进而提供重现性好、易推广的生
物标志物检测系统，利于本发明检测方法的机械化、自动化，利于maldi-tof-ms技术在肿瘤标志物组织原位定量检测中的应用。
[0098]
术语及定义
[0099]
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
[0100]
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
[0101]
在本文中，术语“基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱”等同于“maldi-tof-ms”，等同于“matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry”，是一种软电离生物质谱，其原理是用激光照射基质与样品分子形成的共结晶，基质从激光中吸收能量并传递给生物分子，使生物分子解吸并离子化，从而实现电离的过程。maldi-tof-ms的数据采集过程，首先将样品和基质的混合溶液点到样品板上，在空气(或真空)中干燥结晶，再将样品板送入真空样品仓，脉冲激光将基质和样品离子化以后，产生的分子离子在加速电压的作用下开始加速，此时不同质荷比的离子会加速到不同的速度，然后进入到飞行管，由于飞行管式高真空无场区，离子在这里进行匀速运动，因而距离一定，不同质荷比的离子(具有不同速度)到达检测器的时间(飞行时间)是不同的，所要可以根据飞行时间和质荷比的关系来确定分子离子的质荷比，最后数字控制系统会将信号输出得到质谱的谱图。当使用maldi离子源的激光对生物切片进行二维逐点扫描时，每个扫描点的不同分子量分子将会被质谱仪检测，将某一分子量的生物分子根据检测的信号强度做二维热图，即可得到具有空间分布特征的maldi-tof-ms成像图。该成像图将当次检测样本中信号强度最高的扫描点的生物分子的丰度赋值100％，其他扫描点根据其检测信号强度的高低进行不同丰度赋值，最终在maldi-tof-ms成像图中，不同空间生物分子丰度显示不同的颜色。maldi-tof-ms由于其特有的软电离方式离子源，特别适用于检测蛋白、多肽、脂质等生物大分子。maldi-tof-ms具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，目前在生命科学、医学等领域应用越来越广泛。
[0102]
在本文中，术语“基质溶液”等同于“基质”，是maldi-tof-ms质谱分析用基质溶液。
[0103]
在本文中，术语“生物标志物”是以特异性分子、遗传变异、蛋白表达和基因等以细胞为基础的标志物的形式存在，是一种重要的生化指标，它们能够被有效检测并准确反映生命体中各种分子、细胞、组织、系统等发生或将要发生的变化，指示、衡量和评估不同的生命活动过程，同时监测疾病治疗干预后的药物应答效果。
[0104]
在本文中，术语“肿瘤生物标志物”等同于“肿瘤标志物”，是反映肿瘤发生、发展和预后的一系列物质，在临床上广泛应用于肿瘤的早期诊断、治疗监测和预后评估。肿瘤标志物的实例包括但不限于癌胚蛋白，如癌胚抗原、甲胎蛋白等；酶，如神经元特异性烯醇化酶、碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原等；肿瘤相关抗原，如糖类抗原ca19-9，ca125，ca72-4等；激素，如降钙素、人绒毛促性腺激素等；肿瘤基因类标志物，如ras基因蛋白，my c基因蛋白等；其他肿瘤标志物，多胺，唾液酸，抗eb病毒相关抗原的抗体等。
[0105]
在本文中，术语“癌症”和“癌”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖不受调控的生理病状，是指恶性肿瘤。癌症的实例包括但不限于黑色素瘤、癌瘤、淋巴瘤
(例如霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。癌症的更具体的实例包括b细胞相关癌症，包括例如高级、中级以及低级淋巴瘤(包括b细胞淋巴瘤，例如像粘膜相关淋巴组织b细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、以及霍奇金氏淋巴瘤和t细胞淋巴瘤)和白血病(包括继发性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(cll)(如b细胞白血病(cd5+b淋巴细胞))、骨髓性白血病(如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病)、淋巴细胞性白血病(如急性淋巴母细胞性白血病(all))和骨髓发育不良)、以及其它血液系统癌症和/或b细胞或t细胞相关癌症。还包括另外造血细胞的癌症，所述细胞包括多形核白细胞(如嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、嗜中性细胞)以及单核细胞、树突细胞、血小板、红细胞和天然杀伤细胞。还包括选自以下的癌性b细胞增生性病症：淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、侵袭性nhl、复发性侵袭性nhl、复发性无痛性nhl、难治性nhl、难治性无痛性nhl、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(hcl)、急性淋巴细胞性白血病(all)以及套细胞淋巴瘤。b细胞癌症的起源包括如下：边缘区b细胞淋巴瘤起源于边缘区中的记忆b细胞，滤泡性淋巴瘤和弥漫性大b细胞淋巴瘤起源于生发中心的明区(light zone)中的中心细胞，慢性淋巴细胞性白血病和小淋巴细胞性白血病起源于b1细胞(cd
5+
)，套细胞淋巴瘤起源于套膜区中的天然b细胞并且伯基特氏淋巴瘤起源于生发中心的暗区(dark zone)中的中心胚细胞。在本文中被称为“造血细胞组织”的包括造血细胞的组织包括胸腺和骨髓以及周围淋巴组织，如脾、淋巴结、与粘膜相关的淋巴组织(如肠管相关淋巴组织、扁桃腺、派亚氏淋巴丛(peyer’s patches)和阑尾)以及与其它粘膜相关的淋巴组织，例如支气管内衬(bronchial lining)。这类癌症的其它特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病以及其它淋巴细胞增生性病症，以及各种类型的头颈部癌。
[0106]
在本文中，术语“非小细胞肺癌”是等同于“nsclc”，是肺癌的一种。肺癌分为非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)，其中nsclc占85％，其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，因此约75％的患者发现时已是中晚期，5年生存率很低，预后与肿瘤分期(tnm)和治疗效果相关。有研究发现nsclc中，琥珀酸脱氢酶基因突变能够导致它的反应底物琥珀酸流出线粒体并发生积聚，癌细胞通过向微环境中释放的琥珀酸，活化琥珀酸受体sucnr1并通过pi3k/akt和hif-1α信号传导途径，将巨噬细胞极化为肿瘤相关巨噬细胞(tam)，从而促进肿瘤生长与转移。对健康者和nsclc患者的血清琥珀酸进行测量，发现nsclc患者的琥珀酸浓度显著高于健康者，具有较高的鉴别能力，可以作为非小细胞肺癌的标志物。
[0107]
在本文中，术语“同位素标志物”是指与本文中所述生物标志物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入生物标志物中的同位素包括不限于氢、碳、氮、氧、硫，即2h，3h、
13
c、
14
c、
15
n、
17
o、
18
o、
35
s。
[0108]
在本文中，术语“标准品”指生物标志物的标准品，是用于生物组织中生物标志物的含量或效价测定的标准物质。
[0109]
在本文中，术语“生物组织切片”是通过使用专门的设备(组织切片机)，制备出的
可重现的、定义良好的厚度、能基本保持生物组织活力的组织切片，从固体生物组织中制备得到。
[0110]
在本文中，术语“区域”是指边界确定的空间。
[0111]
在本文中，术语“重叠”是指区域与区域间部分或完全重叠，用来描述区域边界不确定。
[0112]
在本文中，术语“原位检测”是利用某些物质(如抗体、酶、核酸探针、凝集素等)或某些技术(如同位素标记、质谱扫描等)将某一分子从细胞或组织内的众多生物分子中挑选出来，然后通过特异性酶反应显色或荧光显示等测定此分子在细胞和/或组织原有位置上的分布范围和凝集程度，以判断此分子在细胞和/或组织内的生理效应和病理意义。
[0113]
在本文中，术语“roc分析”等同于“roc曲线”、等同于“受试者工作特征曲线”、等同于“感受性曲线”，是反映敏感性与特异性之间关系的曲线，主要是用于x对y的预测准确率情况，应用于医学领域以判断某种因素对于某种疾病的诊断是否有诊断价值。坐标x轴为1
–
特异性，也称为假阳性率(误报率)，x轴越接近零准确率越高；纵坐标y轴称为敏感度，也称为真阳性率(敏感度)，y轴越大代表准确率越好。根据曲线位置，把整个图划分成了两部分，曲线下方部分的面积被称为auc(area under curve)，用来表示预测准确性，auc值越高，也就是曲线下方面积越大，说明预测准确率越高。曲线越接近左上角(x越小，y越大)，预测准确率越高。
[0114]
在本文中，术语“包埋剂oct”等同于“optimal cutting temperature compound”，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。
[0115]
在本文中，术语“1,5-二氨基壬萘”等同于“1,5-dan”，等同于“1,5-naphthalenediamine”，可作为maldi-tof-ms质谱检测基质溶液的成分之一。
[0116]
在本文中，术语“氧化烟锡可导电载玻片”等同于“ito可导电载玻片”，结合上下文语境，等同于“氧化烟锡可导电薄片”等同于“氧化烟锡可导电膜”。
[0117]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0118]
在下列实施例中，所述生物组织来自nsclc患者的癌组织，临床获得并通过影像学、基因测序和ihc方法确定肿瘤分期tnm。
[0119]
实施例1
[0120]
在该实施例中，按照下列方法制备含琥珀酸标准品的肺组织切片：
[0121]
选取琥珀酸标准品(分子量118.088，sigma-aldrich)，用pbs缓冲液配置稀释度为1，5，10，20，50，100，200，400，800pmol/μl的标准溶液。
[0122]
取健康的人肺组织，按如下方法冷冻切片：将冰冻切片机(德国徕卡公司，leica cm1860)操作室温度设为-20℃，组织样本固定和冷冻后，置于包埋剂oct中包埋，然后切片，切片厚度设置为10μm。
[0123]
将肺组织切片转移至载玻片上，滴加分别滴加0.2μl经梯度稀释的琥珀酸标准品溶液，每个浓度的标准品溶液间隔5mm；真空干燥即得。
[0124]
本实施例的含琥珀酸标准品的肺组织切片可作为琥珀酸标准品在肺组织中的对照，用于检测临床肺组织样本中琥珀酸标志物的含量。
[0125]
实施例2
[0126]
在该实施例中，按照下列方法制备maldi-tof-ms检测用含琥珀酸标准品的肺组织切片样本：
[0127]
选取琥珀酸标准品(分子量118.088，sigma-aldrich)，用生理盐水配置稀释度为1，5，10，20，50，100，200，400，800pmol/μl的标准溶液。
[0128]
将1,5-二氨基壬萘(1,5-dan)以10mg/ml的浓度溶解于acn/tfa(0.2％)(v:v 6:4)，作为基质溶液；选用经
13
c标记的琥珀酸，即琥珀酸-13
c4(分子量122.06，sigma-aldrich)作为琥珀酸的内标，用基质溶液定标，定标浓度为500pmol/μl；然后按1∶10的体积比将定标后的内标溶液与基质溶液再次混合，得到混合内标的基质溶液。
[0129]
取健康的人肺组织，按如下方法冷冻切片：将冰冻切片机(德国徕卡公司，leica cm1860)操作室温度设为-20℃，组织样本固定和冷冻后，置于包埋剂oct中包埋，然后切片，切片厚度设置为10μm。
[0130]
应用基质喷涂仪(美国htx公司，tmsp-m3)对整个ito可导电载玻片(规格75
×
25mm)进行基质溶液喷涂，即第一次喷涂。第一次喷涂操作，喷涂仪参数设置如下：基质溶液流速0.2ml/min，喷涂次数：5passes，间隔时间4s，n2压力10psi。
[0131]
将健康的人肺组织切片转移至喷涂了基质溶液的ito可导电载玻片上，再分别滴加0.2μl经梯度稀释的琥珀酸标准品溶液，每个浓度的标准品溶液间隔5mm；真空中干燥20min。再次对整个ito可导电载玻片喷涂混合内标的基质溶液，即第二次喷涂，得到备maldi-tof-ms检测用含琥珀酸标准品的肺组织切片。第二次喷涂操作，喷涂仪参数设置如下：基质溶液流速0.2ml/min，喷涂次数：15passes，间隔时间4s，n2压力10psi。
[0132]
一般情况下，完成上述样本的制备，需要约30～40min。
[0133]
本实施例的含琥珀酸标准品的肺组织切片可作为琥珀酸标准品在组织中的对照，用于检测nsclc癌组织中琥珀酸标志物的含量。比如通过maldi-tof-ms的方法，参照实施例3的方法，将本实施例的组织切片作为标准品对照，原位定量检测nsclc癌组织中琥珀酸标志物的含量。
[0134]
实施例3
[0135]
参考实施例2，按照下列方法制备maldi-tof-ms检测用nsclc癌组织切片：与实施例2不同之处在于，将nsclc癌组织切片转移至经第一次喷涂处理的ito可导电载玻片上，真空干燥20min，然后进行第二次喷涂。第一次喷涂采用的喷涂液同实施例2的混合内标的基质溶液，第二次喷涂采用的喷涂液同实施例2的不含内标的基质溶液。其他处理步骤同实施例2。一般情况下，从样本切片到喷涂处理结束，操作时间约30～40min。
[0136]
待实施例2的含琥珀酸标准品的肺组织切片样本和本实施例nsclc癌组织切片样本的ito可导电载玻片完全自然干燥并出现结晶后，将ito可导电载玻片载入maldi-tof-ms(融智生物科技有限公司，quantof ii型)，应用质谱成像模式进行扫描。质谱参数设置：扫描频率200hz，负离子模式，空间分辨率50μm，扫描速率5mm/s，激光能量3μj，信噪比3。一个3～6cm2样本的扫描时间为5min左右。
[0137]
选取位于琥珀酸内标，即琥珀酸-13
c4[m-h
+
]m/z 121.06附近的质谱峰进行质量校
准、数据归一化，然后选取琥珀酸[m-h
+
]m/z 117.09的质谱峰(见图1)，获得整个样本的质谱影像(见图2，不同浓度标准品区域随浓度变化呈现不同颜色)和不同浓度标准品区域的质谱峰图(见图3，质谱峰强度和区域内标准品浓度成高度相关性)。图像生成时间为6～10min左右。
[0138]
基于不同浓度标准品区域的质谱峰图，建立琥珀酸标准品的质谱峰强度相对标准品稀释浓度(1，5，10，20，50，100，200，400，800pmol/μl)的标准曲线(见图4)。如图4所示，标准曲线在1～800pmol/μl之间具有良好的线性，r2为0.9905，lloq为1pmol/μl(信噪比s/n为3)，ulol为800pmol/μl。
[0139]
进一步地，在1～800pmol/μl检测范围内，基于含琥珀酸标准品的肺组织切片样本的切片厚度(10μm)和分布有琥珀酸标准品的区域面积(如图2所示，0.2μl琥珀酸标准品滴到正常肺组织切片上会形成一个直径1mm2的圆形，面积约为0.785mm2，)，根据表1的数据，建立琥珀酸标准品的质谱峰强度(ii)相对琥珀酸标准品分布区域内单位体积肺组织中琥珀酸含量(di)的线性回归曲线(见图5)，得到di和ii的线性回归方程：di＝kii+b(k和b为常数)。本实施例中，di和ii的线性回归方程如图5所示。
[0140]
表1琥珀酸标准品稀释浓度mi对应其分布区域内单位体积肺组织中琥珀酸含量di[0141][0142]
备注：琥珀酸标准品分布区域内单位体积肺组织中琥珀酸含量di(μg/mm3)＝标准品稀释浓度mi(pmol/μl)
×
118.09(pg/pmol)
×
0.2(μl)
÷
0.785(mm2)
×
10-3
÷
0.01(mm)。
[0143]
进一步地，在临床实践中，根据受检者肺组织样本获得的maldi-tof-ms质谱峰图，按上述di和ii的线性回归方程得到nsclc癌组织切片样本中琥珀酸的含量。
[0144]
进一步地，还可获得nsclc癌组织切片样本的maldi-tof-ms质谱成像图，该质谱成像图可原位显示样本中琥珀酸含量，在临床上可帮助判断tnm或肿瘤的转移程度。
[0145]
进一步地，根据质谱成像图的颜色分布，还可以选取感兴趣区域roi，获得roi的面积；基于待测nsclc癌组织切片样本的质谱峰图，获得roi的质谱峰强度，确定roi中琥珀酸在单位体积nsclc癌组织中的含量，和/或roi中琥珀酸的总含量。
[0146]
临床检测大数据显示nsclc癌组织样本中琥珀酸的浓度范围为15～1000μg/mm3，maldi-tof-ms仪器成线性的浓度范围为3～2400μg/mm3。因此，上述方法用于定量nsclc癌组织样本中琥珀酸酸的含量，线性良好，结果准确；上述方法可原位显示nsclc癌组织样本中琥珀酸的含量，实现nsclc癌组织琥珀酸的原位定量，有实际的临床应用价值。
[0147]
基于相同或相近的方法和原理，本发明的方法可以用于其他生物组织生物标志物的含量或浓度的检测，和/或原位定量，尤其利用maldi-tof-ms质谱技术，进行肿瘤组织肿瘤标志物的检测。
[0148]
本发明的检测方法与常见的气质或液质联用系统(gc/lc-ms)、磁共振光谱(mrs)、解析电喷雾离子色谱(desi-ms)、快速蒸发电离质谱(rei-ms)等检测手段相比，待检测样本预处理简单、机械化自动化程度高，单次样本从切片到喷涂处理结束操作时间约30～
40min，一个3～6cm2样本的maldi-tof-ms扫描时间约5min。同时，从新鲜实验样本到最后得到标志物定量和成像结果，整个实验在0.5～1h内可以完成，可进一步满足临床上对患者样本检测结果出具最终报告的时限需求。样本数据还可以实现多次采集，大大节省样本资源。
[0149]
实施例4
[0150]
进一步地，生物标志物在一块组织样本中的分布并不均匀，临床上需要确定标志物在整块肿瘤组织中的相对含量。具体地，可以通过如下方式确定：
[0151]
根据nsclc癌组织切片样本的maldi-tof-ms质谱成像图的颜色分布，选取图形中的感兴趣区域(roi)若干，借助计算机软件得到每个roi的面积值si，感兴趣区域峰强度平均值ii，进一步根据实施例3的方法确定每个roi中琥珀酸在单位体积nsclc癌组织中的含量，累加每个roi中琥珀酸在单位体积nsclc癌组织中的含量和面积的乘积，然后除以切片样本的总面积，得到琥珀酸在nsclc癌组织中相对含量，即琥珀酸在单位nsclc癌组织中的相对含量q。
[0152]
琥珀酸在nsclc癌组织中的相对含量q(μg/mm3)＝(∑di(μg/mm3)
×
roi面积si(mm2))
÷
组织切片总面积s(mm2)
[0153]
q测定值的范围在1.0～800.0μg/mm3。
[0154]
实施例5
[0155]
选取非小细胞肺癌组织样本116例，事先用ihc和sanger方法确认了nsclc的病理类型，其中tnm分期ⅰ～ⅱ期的50例，肿瘤未扩散到淋巴结，iii期以上66例，肿瘤周边淋巴结侵犯或远端转移。参考实施例3～5的方法，对每个样本进行maldi-tof-ms质谱扫描并获得质谱峰图和质谱成像图(部分成像图见图6、图7)，根据质谱峰图确定每个样本的q值。
[0156]
q值数据描述(见表2)：ⅰ～ⅱ期，q平均值172.98，最小值20.24，最大值293.29，iii期，q平均值471.77，最小值256.32，最大值684.90，单位μg/mm3。不同肿瘤分期的q值分布见箱形图(见图8)。
[0157]
根据q值列表和tnm的结果进行roc分析(见图9)。通过youden’s index分析，截断点为295.17μg/mm3，敏感度90.9％，特异性100％。
[0158]
以上数据提示，本发明的生物组织标志物的检测方法准确率高，用于临床肿瘤样本生物标志物检测，结果准确可信；检测结果进一步作为肿瘤浸润程度、肿瘤分期的依据，用于预判肿瘤转移的程度。
[0159]
表2 116例非小细胞肺癌不同肿瘤分期q值数据描述
[0160][0161]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种生物组织参照切片，其特征在于，包含：标准品，所述标准品分布于所述生物组织切片的至少部分区域，所述标准品含有生物标志物，所述生物标志物用于鉴定所述生物组织的生理状态。2.根据权利要求1所述的切片，其特征在于，所述生物组织来源于健康个体；任选地，生物组织中所述生物标志物的含量为零；任选地，所述标准品分布于所述生物组织参照切片预定数量的不同区域，所述预定数量的不同区域不重叠；任选地，分布于不同区域内的所述标准品的含量不同；任选地，所述切片是冰冻切片或石蜡切片；任选地，所述切片是冰冻切片；任选地，所述生物标志物是琥珀酸，所述生物组织来源于肺组织。3.权利要求1～2任一所述的生物组织参照切片在检测待测生物组织中所述生物标志物中的应用；任选地，所述检测是原位定量检测。4.一种检测生物组织中生物标志物的方法，其特征在于，利用maldi-tof-ms质谱分别对待测生物组织切片和权利要求1～2任一所述的生物组织参照切片进行检测，获得待测生物组织切片和生物组织参照切片的质谱峰图和质谱成像图；基于质谱峰图和质谱成像图，确定所述待测生物组织切片中的生物标志物的含量。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，基于质谱峰图和质谱成像图，确定所述待测生物组织切片中的生物标志物的含量是通过如下方式实现的：(1)基于生物组织参照切片的质谱峰图，获得生物组织参照切片预定区域中标准品的质谱峰强度；(2)基于所述生物组织参照切片中预定区域中标准品的质谱峰强度以及标准品的第一浓度，确定第一标准曲线，所述第一浓度为标准品加入到所述生物组织参照切片预定区域前的浓度；(3)基于所述生物组织参照切片中预定区域的厚度和面积，确定所述生物组织参照切片中预定区域的体积；(4)基于所述生物组织参照切片预定区域中标准品的含量以及所述预定区域的体积获得所述预定区域单位体积中所述标准品的含量；(5)基于所述生物组织参照切片中预定区域中标准品的质谱峰强度以及所述预定区域单位体积中所述标准品的含量，确定第二标准曲线；(6)基于待测生物组织切片的质谱成像图，选取感兴趣区域roi，获得roi的面积；(7)基于待测生物组织切片样本的质谱峰图，获得roi的质谱峰强度；(8)基于所述roi的质谱峰强度以及所述第二标准曲线，确定roi中生物标志物在待测生物组织切片样本相同预定区域中单位体积所述生物组织中的含量，和/或roi中生物标志物的总含量；任选地，还包括如下步骤：(9)基于待测生物组织切片样本的质谱成像图，选择预定多个roi，获得预定多个roi中
每个roi中生物标志物在单位体积生物组织中的含量和面积的乘积；(10)基于所述预定多个roi中每个roi中生物标志物在单位体积生物组织中的含量和面积的乘积，获得预定多个roi的乘积之和；进一步地，还包括如下步骤：基于所述预定多个roi的乘积之和与待测生物组织切片样本的预定多个roi面积之和的比值，确定生物标志物在单位体积生物组织中的相对含量。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述质谱峰图和质谱成像图通过所述生物标志物的内标质谱峰质量校准后得到；任选地，所述内标是所述生物标志物的同位素标志物；任选地，所述同位素是
13
c；进一步地，所述组织切片样本通过如下方式得到：a)将基质溶液与所述生物标志物的内标溶液混合后涂覆至可导电载玻片表面；b)将健康的生物组织或所述生物标志物的含量为零的生物组织切片后，转移至步骤a)所得的载玻片，间隔滴加梯度稀释的所述生物标志物的标准品；和/或将待测生物组织切片后转移至步骤a)所得的载玻片；c)在步骤b)的载玻片上涂覆基质溶液；任选地，所述可导电载玻片是氧化烟锡可导电载玻片；任选地，所述基质溶液是1,5-二氨基壬萘；任选地，所述基质溶液是将1,5-二氨基壬萘以10mg/ml的浓度溶解于acn和tfa的混合液中；任选地，按体积比计，所述混合液中acn与tfa的比值为(6∶4)～(4∶6)；任选地，按体积比计，所述基质溶液与所述内标溶液按(1∶5)～(1∶20)的比例混合；任选地，所述基质溶液与所述内标溶液按1∶10的比例混合；任选地，重复所述步骤a)和/或步骤c)至少1次；任选地，重复步骤a)1～5次；任选地，重复步骤c)10～30次；任选地，所述涂覆操作是通过基质喷涂仪实现基质溶液和/或基质溶液与所述内标溶液的混合液的喷涂；任选地，所述基质喷涂仪的喷涂流速是0.1～0.3ml/min；任选地，所述喷涂在惰性气体环境下进行；任选地，所述惰性气体任选自氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气、氡气的至少之一；任选地，所述惰性气体选自氮气。7.根据权利要求4～6任一所述的方法，其特征在于，所述生物组织是肿瘤组织，所述生物标志物是肿瘤标志物；任选地，所述肿瘤是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈部癌的至少之一；任选地，所述肿瘤是非小细胞肺癌，所述肿瘤组织标志物是琥珀酸，所述内标是琥珀
酸-13
c4。8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～2任一所述的生物组织参照切片，或所述试剂盒的工作原理基于权利要求4～7任一所述的方法；任选地，所述试剂盒还包括说明书。9.一种检测系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1～2任一所述的生物组织参照切片，或权利要求8所述的试剂盒，或所述系统的运行基于权利要求4～7任一所述的方法；任选地，所述检测系统包括maldi-tof-ms样本可电离化处理模块、maldi-tof-ms数据采集模块、maldi-tof-ms数据分析模块。

技术总结
本发明提供生物组织参照切片及其用途，以及检测生物组织中生物标志物的方法、试剂盒和检测系统。所述参照切片包含：标准品，所述标准品分布于所述生物组织切片的至少部分区域，所述标准品含有生物标志物，所述生物标志物用于鉴定所述生物组织的生理状态。所述方法利用MALDI-TOF-MS质谱分别对待测生物组织切片和上述生物组织参照切片进行检测，获得待测生物组织切片和生物组织参照切片的质谱峰图和质谱成像图；基于质谱峰图和质谱成像图，确定所述待测生物组织切片中的生物标志物的含量。利用本发明的生物组织参照切片和方法可实现生物标志物的原位定量检测，检测结果准确、检测周期短、样品预处理操作简单，临床应用价值高。临床应用价值高。临床应用价值高。


技术研发人员：张晨曦 佟雪梅
受保护的技术使用者：融智生物科技（青岛）有限公司
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/23