一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签及其纯化方法

1.本发明涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，还涉及链霉亲和素的纯化方法。


背景技术：

2.大肠杆菌易于处理、培养成本低、倍增时间短和表达水平高，其可溶表达的活性与天然表达性质相似，因此是表达链霉亲和素最常用的宿主，但是可溶表达产量低，回收率低，而大量表达时往往以包涵体的形式存在。
3.目前主要是通过亚氨基生物素琼脂糖亲和纯化方式获得蛋白，该方法成本高、操作繁琐且并不适用于某些突变体的纯化。常规硫酸铵沉淀法能获得大部分的链霉亲和素。但是纯度低。因此寻找一种普适性的、简便的纯化方式不仅可以降低生产成本，也可以提高链霉亲和素的纯度，对生产有一定的实际意义。
4.his tag的分子量小，不影响目的蛋白构象，并且镍柱使用简便，成本低廉，耐用性好，是目前纯化蛋白的首选标签，最常用的是6～8his tag。但是6～8his tag不适用对四聚体蛋白的纯化。因此，亟需优化his tag以获得适合于链霉亲和素的标签。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签；本发明的目的之二在于提供亲和标签在纯化链霉亲和素中的应用；本发明的目的之三在于提供一种链霉亲和素的纯化方法，该方法选择2～3个his作为纯化标签，具有普适性的、方法简便。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，所述纯化标签是由2～3个his组成。
8.2、所述亲和标签在纯化链霉亲和素中的应用。
9.3、一种纯化链霉亲和素的方法，构建表达n端融合2～3个his的链霉亲和素的重组表达载体，重组表达后使用镍柱纯化。
10.本发明优选的，所述重组表达载体为人工合成或将编码n端融合2～3个his的链霉亲和素的核苷酸序列连入表达载体中，获得重组表达载体。
11.本发明优选的，所述重组表达是将重组表达载体转入表达宿主后诱导表达。
12.本发明优选的，所述诱导表达是将活化的重组表达宿主扩大培养后加入0.5μm iptg诱导培养2h。
13.本发明优选的，所述镍柱纯化的方法是将诱导培养后的培养物收集菌体，超声破碎，收集包涵体，然后用变性剂溶解包涵体后，离心去除沉淀，上清用加入复性液复性，然后加入平衡的ni-ted beads柱中，接着用含5mm咪唑的1
×
pbs缓冲液冲洗杂蛋白，再用含250mm咪唑的50mm tris-hcl洗脱目的蛋白，收集洗脱液得到纯化后的链霉亲和素。
14.本发明优选的，所述变性液为8m urea；所述复性液为1
×
pbs+10％甘油。
15.本发明优选的，所述复性液加入体积相当于变性液体积的10～30倍。
16.本发明优选的，所述ni-ted beads柱的平衡方法是先用水冲洗ni-ted beads，然后用1
×
pbs缓冲液平衡。
17.本发明的有益效果在于：本发明公开了一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，该标签由由2～3个his组成的序列，具有不影响蛋白的表达，纯化后目的蛋白的纯度高，仍然能够高特异性的富集生物素化标记的蛋白(野生型)或twinstrep标签目的蛋白(突变型)，用于链霉亲和素纯化的具有成本低，操作简单等优点。
附图说明
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
19.图1为2his和6his csav(wt)小量表达对比图；
20.图2为2his和无标签csav(wt)小量表达对比图；
21.图3为2his和3his-csav(wt)小量表达对比图；
22.图4为硫酸铵沉淀法纯化(t：包涵体总蛋白，rt：复性后常温下跑胶检测，boiled：复性后金属浴95℃加热5min后跑胶检测；10fold、20fold、30fold：变性蛋白分别在变性液10倍、20倍、30倍的体积中复性后，70％硫酸铵沉淀，离心后用pbs重悬沉淀后的上清蛋白)；
23.图5为2his-csav(wt)和6his-csav(wt)洗脱率对比图(a：2his-csav(wt)的洗脱效率；b：3his-csav(wt)的洗脱效率；c：6his-csav(wt)的洗脱效率)；
24.图6为2his-csav交联固定图(图a为2his-csav(mt)，图b为2his-csav(wt)，m：蛋白marker；load：交联前2his-csav蛋白；ft：与nhs-activated-sepharose交联后的穿出；beads：交联上2his-csav蛋白的beads)；
25.图7为2his-csav(mut)富集能力测试图(m：蛋白marker；load：twinstrep-egfp裂解液；ft：穿出液；e1，e2：洗脱液)；
26.图8为2his-csav(wt)与生物素结合能力测试图(m：蛋白marker；load：biotin-bsa裂解液；ft：穿出液；elution：beads上所结合蛋白)。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
28.实施例1、融合蛋白构建方法
29.由公司合成piisa-2his-csav(wt)，piisa-6his-csav(wt)、piisa-2his-csav(mut)，piisa-2his-csav(wt)，具体序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。piisa-2his-csav(wt)为表达含2个his标签的链霉亲和素的重组载体，seq id no.1中第202位至第594位为编码带2个his标签的链霉亲和素核苷酸序列；piisa-6his-csav(wt)为表达含6个his标签的链霉亲和素的重组载体，seq id no.2中第202位至第606位为编码带6个his标签的链霉亲和素核苷酸序列；piisa-2his-csav(mut)为表达含2个his的链霉亲和素突变蛋白的重组载体，seq id no.3中第202位至第594位为编码带2个his标签的链霉亲和素突变蛋白的核苷酸序列；piisa-2his-csav(wt)为表达含3个his的链
霉亲和素蛋白的重组载体，seq id no.4中第202位至第597位为编码带2个his标签的链霉亲和素突变蛋白的核苷酸序列。
30.实施例2、小量表达
31.1)取1μl抽提的含上述设计的质粒加入至100μl的bl21 codon plus(de3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再在冰上静置2min，涂布于含100μg/ml的氨苄抗性的平板上，37℃恒温过夜培养。
32.2)挑取10个单菌落至含有200μl lb培养基的ep管中培养，37℃，220rpm培养至待菌液浑浊后，取100μl留样，另吸取100μl再转接至含有900μl新鲜的lb培养基中培养，检测菌液od600约为0.8时，留一个样作为诱前，其余的样加入0.5mm iptg，37℃培养2h后，离心弃去培养基，用40μl pbs重悬菌体，加入10μl的5
×
sds混匀后95℃加热15min，用sds-page胶检测蛋白表达情况，结果如图1～3所示。结果在小量表达中发现2his-csav(wt)与无标签csav(wt)对比，不影响蛋白的表达；3his-csav(wt)与2his-csav(wt)对比表达量无明显差异，但是6his-csav(wt)的表达量较2his-csav(wt)明显减少。
33.实施例3、硫酸铵沉淀法纯化
34.1)选择无标签csav(wt)表达较高的菌种，将之前所留的样转接至100ml lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养12～14h，将菌液转接至1l含100μg/ml的氨苄抗性lb培养基的培养瓶中，在37℃恒温大摇床上培养至od600至0.8～1.2时，加入iptg至终浓度0.5mm/l，在37℃诱导3～5h。
35.2)培养结束后于大容量低温离心机内4℃、3500rpm离心20min收集所有大肠杆菌，倒净所有上清，重悬于40ml 1
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pbs(ph8.0)中；
36.3)在重悬菌液中加入适量溶菌酶，4℃反应15min；
37.4)以40％的功率，超声3s，停止7s，超声20min超声破碎溶菌酶处理后的菌液；
38.5)超声完成后，将裂解液转移至离心管，4℃，12000g，离心30min，去除上清，收集沉淀；
39.6)用包涵体洗涤缓冲液对包涵体进行充分的研磨洗涤，洗涤后12000g，离心30min弃废液，重复两次，收集白色的洗净的沉淀；
40.7)用40～50ml的变性剂在4℃过夜溶解包涵体至澄清，4℃，12000g，离心30min，去除沉淀，收集上清用于复性；
41.8)取500μl变性液(8m urea)缓慢地分别滴加至5ml，10ml，15ml的复性液(1
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冰冷的pbs)中，同时用磁力搅拌器缓慢搅拌促进复性，得到复性液；
42.9)70％硫酸铵沉淀，根据硫酸铵沉淀表向复性好的复性液中加入相应质量的硫酸铵固体，在冰上静置析出沉淀，4℃，12000g，离心30min收集沉淀，用500μl的1
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pbs重悬沉淀，再4℃，12000g，离心30min去除不溶沉淀，得到重悬后上清。
43.如图4所示，csav(wt)的纯度较低。
44.实施例4、镍柱纯化
45.1)用3～5倍柱体积的去离子水冲洗ni-ted beads，然后用1
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pbs缓冲液平衡ni-ted beads；
46.2)平衡好柱子后加入上述条件制备的复性液，收集穿出后再重复上样一次；
47.3)用含5mm咪唑的1
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pbs缓冲液冲洗杂蛋白，一般冲洗200ml体积；
48.4)用含250mm咪唑的50mm tris-hcl洗脱目的蛋白，elution1和elution2各收集10ml。
49.如图5所示，复性后的上清仍存在的少量单体，但是几乎都以不挂柱的形式而流穿，最后的纯度相比于直接使用硫酸铵沉淀有很大的提高。同时发现在相似浓度load挂相同体积的镍柱并使用相同浓度的咪唑洗脱条件下，2his-csav(wt)和3his-csav(wt)的elution浓度高于6his-csav(wt)，即2his-csav(wt)和2his-csav(wt)的洗脱效率(图5，a和b)优于6his-csav(wt)(图5，c)。
50.实施例5、2his-csav交联固定
51.1)将纯化后的2his-csav蛋白在2l的200mm nahco3、500mm nacl缓冲液中透析，每隔2h更换透析液一次，总计更换透析液两次；
52.2)测定链霉亲和素在280nm波长的紫外吸收值，根据每毫克蛋白的吸收值计算透析的蛋白浓度和蛋白总质量；
53.3)按每毫升nhs beads交联固定12mg 2his-csav取相应体积的nhs beads；
54.4)beads反应完成后，用5倍beads体积的冰冷的1mm hcl溶液活化nhs beads，穿柱后吸干溶液；
55.5)加入蛋白，用四维旋转混合仪在4℃过夜旋转交联；
56.6)交联结束后收集穿出，用100mm tris-hcl(ph8.5)缓冲液冲洗beads，再用5倍beads体积的100mm tris-hcl(ph8.5)缓冲液在4℃封闭10h以上，封闭beads上未反应的nhs基团；
57.7)封闭结束后，流出封闭液，用5倍beads体积的50mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl、1mm edta缓冲液冲洗beads一次，将交联完成好的beads保存于1倍beads体积的50mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl、1mm edta、0.03％nan3缓冲液中，于4℃保存。
58.如图6所示，结果显示2his-csav mt蛋白(图a)和2his-csav wt蛋白(图b)能很好的固定在琼脂糖凝胶上。
59.实施例6、2his-csav(mut)对twinstrep-egfp的富集
60.按照实施例2～5的方法制备并纯化得到含2个his标签的链霉亲和素突变体(简称2his-csav(mut))，然后用于富集twinstrep-egfp：
61.1)取20μl 2his-csav(mut)beads置于微量pull down柱中，用200μl 20mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl、1mm pmsf平衡beads，4℃、3000rpm离心，弃废液；
62.2)取适量twinstrep-egfp裂解液(实验室保存)加入至2his-csav(mt)beads中，置于4℃在四维旋转混匀装置上轻柔孵育1h；
63.3)孵育完成后，4℃、3000rpm离心，弃废液；
64.4)加入500μl 20mm tris-hcl(ph 8.0)、150mm nacl、1mm edta、0.5％ triton-x100缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复3次；
65.5)再加入500μl 20mm tris-hcl(ph 7.4)、150mm nacl、1mm edta缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复两次；
66.6)用60μl 20mm tris-hcl(ph 7.4)、150mm nacl、50mm biotin缓冲液洗脱beads上的蛋白重复3次洗脱目的蛋白，4℃、3000rpm离心，重复两次；
67.7)留取pull down过程中各时期的蛋白样进行sds-page胶或westren bolt检测；
68.如图7所示，2his-csav(mut)很好的富集twinstrep目的蛋白的能力且有高特异性。
69.实施例7、2his-csav(wt)对生物素结合能力测试
70.1)取20μl 2his-csav(wt)beads置于微量pull down柱中，用200μl 20mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl、1mm pmsf平衡beads，4℃、3000rpm离心，弃废液；
71.2)取适量biotin-bsa裂解液(实验室保存)加入至2his-csav(wt)beads中，置于4℃在四维旋转混匀装置上轻柔孵育1h；
72.3)孵育完成后，4℃、3000rpm离心，弃废液；
73.4)加入500μl 20mm tris-hcl(ph 8.0)、150mm nacl、1mm edta、0.5％ triton-x100缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复3次；
74.5)再加入500μl 20mm tris-hcl(ph 7.4)、150mm nacl、1mm edta缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复两次；
75.6)向beads中加入60μl 20mm tris-hcl(ph 7.4)、150mm nacl缓冲液，95℃加热5min，进行sds-page胶检测。
76.如图8所示，2his-csav(wt)很好的富集biotin化的目的蛋白的能力且有高特异性。
77.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，其特征在于：所述纯化标签是由2～3个his组成。2.权利要求1所述亲和标签在纯化链霉亲和素中的应用。3.一种链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：构建表达n端融合2～3个his的链霉亲和素的重组表达载体，重组表达后使用镍柱纯化。4.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述重组表达载体为人工合成或将编码n端融合2～3个his的链霉亲和素核苷酸序列连入表达载体中，获得重组表达载体。5.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述重组表达是将重组表达载体转入表达宿主后诱导表达。6.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述诱导表达是将活化的重组表达宿主扩大培养后加入0.5μm iptg诱导培养2h。7.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述镍柱纯化的方法是将诱导培养后的培养物收集菌体，超声破碎，收集包涵体，然后用变性剂溶解包涵体后，离心去除沉淀，上清用加入复性液复性，然后加入平衡的ni-ted beads柱中，接着用含5mm咪唑的1
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pbs缓冲液冲洗杂蛋白，再用含250mm咪唑的50mm tris-hcl洗脱目的蛋白，收集洗脱液得到纯化后的链霉亲和素。8.根据权利要求7所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述变性液为8m urea；所述复性液为1
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pbs+10％甘油。9.根据权利要求7所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述复性液加入体积相当于变性液体积的10～30倍。10.根据权利要求7所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述ni-ted beads柱的平衡方法是先用水冲洗ni-ted beads，然后用1
×
pbs缓冲液平衡。

技术总结
本发明公开了一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签及其纯化方法，该标签是由2～3个His组成的序列组成，用该标签时不影响蛋白的表达以及活性，能够直接使用镍柱纯化，并且纯化的蛋白纯度高，还具有成本低、操作简单等优点，对链霉亲和素的纯化具有重要意义。链霉亲和素的纯化具有重要意义。链霉亲和素的纯化具有重要意义。


技术研发人员：李洪涛 杨婧 何红梅 邓娇 林明辉
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/24