SARS-CoV-2DNA和蛋白疫苗的免疫和保护的制作方法

sars-cov-2dna和蛋白疫苗的免疫和保护
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年11月24日提交的pct专利申请pct/cn2020/131098的优先权，其内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及抗sars-cov-2病毒感染的疫苗，并且，尤其涉及抗sars-cov-2病毒感染的疫苗组合，其包含dna疫苗和抗原肽疫苗。


背景技术：

4.covid-19大流行已在全球造成超过3000万例病例，其中包括120万例死亡(1)。虽然公共卫生措施(例如保持社交距离)在控制局部疫情方面发挥了重要作用，但covid-19大流行继续向另外的人群(包括生活在偏远和欠发达地区的人群)传播只会扩大未来的威胁(2-6)。此外，即使在最初的疫情消退后，许多国家仍在发生新传播浪潮(7,8)。更明确的大规模公共卫生措施(如疫苗)是实现全面全球控制的唯一希望(9-12)。
5.目前，已有至少十几种covid-19疫苗已进入iii期临床研究，以在广泛公众使用之前确定其功效(13)。一些领先的候选者正在使用新的疫苗平台，例如病毒载体(14-18)或mrna(19-23)方法。过去，没有使用这些方法的人预防性疫苗正式获得有效性临床研究许可。另一种主要类型的covid-19疫苗是灭活疫苗方法(24-28)，这与过去使用此类疫苗观察到的可能的不良事件有关(29,30)。在灭活之前需要产生大量sars-cov-2活病毒，也存在与之相关的生物安全问题。基于过去的经验，总体来说，病毒载体、核酸或灭活疫苗被认为不具有高免疫原性。同时，据报道sars-cov-2感染可能不会导致高水平的免疫应答，并且一些康复的患者可能再次感染同一病毒(31-33)。因此，非常需要开发具有高免疫原性且诱发的免疫持久存在的covid-19疫苗。


技术实现要素：

6.在一方面，本公开提供了一种用于受试者抗sars-cov-2病毒感染的dna疫苗，其包含编码sars-cov-2病毒多肽的多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列经密码子优化以在受试者中表达。
7.在一些实施方案中，该多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。
8.在一些实施方案中，该多肽包含刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。
9.在一些实施方案中，该受试者是人类。
10.在一些实施方案中，该dna疫苗是由质粒psw3891构建的质粒。
11.在一些实施方案中，该多核苷酸序列包含seq id no:3或4的序列。
12.在另一方面，本公开提供了一种用于预防或治疗受试者的sars-cov-2病毒感染的方法，其包括向受试者施用有效量的dna疫苗，其中该dna疫苗包含编码sars-cov-2病毒的
多肽的多核苷酸序列，并且该多核苷酸序列经密码子优化以在受试者中表达。
13.在一些实施方案中，该多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。
14.在一些实施方案中，该多肽包含刺突蛋白的rbd。
15.在一些实施方案中，该受试者是人类。
16.在一些实施方案中，该dna疫苗是由质粒psw3891构建的质粒。
17.在一些实施方案中，该多核苷酸序列包含seq id no:3或4的序列。
18.在另一方面，本公开提供了一种用于受试者抗sars-cov-2病毒感染的疫苗组合，其包含：
19.1)dna疫苗，其包含编码sars-cov-2病毒的多肽的多核苷酸序列；和
20.2)抗原肽疫苗，其中该抗原肽是sars-cov-2病毒的抗原肽。
21.在一些实施方案中，该多核苷酸序列经密码子优化以在受试者中表达。
22.在一些实施方案中，该多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。
23.在一些实施方案中，该多肽包含刺突蛋白的rbd。
24.在一些实施方案中，该受试者是人类。
25.在一些实施方案中，该dna疫苗是由质粒psw3891构建的质粒。
26.在一些实施方案中，该多核苷酸序列包含seq id no:3或4的序列。
27.在一些实施方案中，该抗原肽至少包含sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。
28.在一些实施方案中，该抗原肽包含刺突蛋白的rbd。
29.在一些实施方案中，该抗原肽是刺突蛋白的s1亚基。
30.在一些实施方案中，该抗原肽包含seq id no:7的氨基酸序列或与seq id no:7具有80％或更多序列同一性的功能变体。
31.在一些实施方案中，dna疫苗和抗原肽疫苗与药学上可接受的溶媒在疫苗制剂中共同配制或各自配制成单独的疫苗制剂。
32.在一些实施方案中，dna疫苗和抗原肽疫苗被配制成适合通过肌内注射共同递送的疫苗制剂。
33.在另一方面，本公开提供了一种用于预防或治疗受试者的sars-cov-2病毒感染的方法，其包括向受试者施用有效量的dna疫苗和有效量的抗原肽疫苗，其中该dna疫苗包含编码sars-cov-2病毒多肽的多核苷酸序列；并且其中该抗原肽是sars-cov-2病毒的抗原肽。
34.在一些实施方案中，该多核苷酸序列经密码子优化以在受试者中表达。
35.在一些实施方案中，该多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。
36.在一些实施方案中，该多肽包含刺突蛋白的rbd。
37.在一些实施方案中，该受试者是人类。
38.在一些实施方案中，该dna疫苗是由质粒psw3891构建的质粒。
39.在一些实施方案中，该多核苷酸序列包含如seq id no:3或4所示的序列。
40.在一些实施方案中，该抗原肽至少包含sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。
41.在一些实施方案中，该抗原肽包含刺突蛋白的rbd。
42.在一些实施方案中，该抗原肽是刺突蛋白的s1亚基。
43.在一些实施方案中，该抗原肽包含seq id no:7的氨基酸序列或与seq id no:7具有80％或更多序列同一性的功能变体。
44.在一些实施方案中，dna疫苗和抗原肽疫苗与药学上可接受的溶媒在疫苗制剂中共同配制或各自配制成单独的疫苗制剂。
45.在一些实施方案中，向受试者共同施用dna疫苗和抗原肽疫苗。
46.在一些实施方案中，向受试者共同施用dna疫苗和抗原肽疫苗至少3次。
47.在一些实施方案中，dna疫苗和抗原肽疫苗通过肌内注射施用。
48.在另一方面，本公开提供了一种疫苗试剂盒，其包含容器、该容器内的上述dna疫苗或疫苗组合，以及在该容器上或与该容器相关的标签，该标签指示该dna疫苗或该疫苗组合用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染。
49.在另一方面，本发明提供了上述dna疫苗或疫苗组合在制备用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染的药物中的用途。
50.在另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染的药物，其包含上述dna疫苗或疫苗组合。
51.编码s蛋白的dna疫苗和包含s1亚基的抗原疫苗的组合能够赋予抗sars-cov-2病毒感染的全面保护。
附图说明
52.图1(a)sars-cov-2刺突蛋白dna和蛋白疫苗的设计。除了野生型s基因插入物(wt)，还产生两个版本的经密码子优化(opt)s dna疫苗：全长s插入物(fl)以及不带跨膜和细胞内组分的截短s插入物(dtm)。对于重组s1蛋白的表达，组织型纤溶酶原激活物(tpa)信号肽取代天然s蛋白信号肽(sp)。(b)western印迹分析以检查s dna疫苗和重组s1蛋白疫苗的表达。用s-fl-opt或s-dtm-opt dna质粒瞬时转染293t细胞，并在72小时后收获培养上清液(sup)或细胞裂解物(裂解物)。重组s1蛋白由expi293细胞产生并通过histrap hp纯化。s1特异性兔多克隆血清l295-iv用作检测抗体。
53.图2密码子优化和野生型s表达dna疫苗的探索性免疫原性研究。个体小鼠(a-b，每组n＝6)或猴(c-f，每组n＝4)接受三次dna免疫，如箭头所示，使用基因枪递送方法。模拟(mock)组接受空dna疫苗载体作为阴性对照。elisa效价显示为每组的平均od(a，c)或第42天峰值水平下的终点滴定效价(d)。显示在第42天峰值水平下来自每只动物的中和抗体应答(nab)(c)或t细胞应答(e和f)。
54.图3nzw兔的相对免疫原性研究。在第0、2和8周，通过肌内针接种对动物进行3次免疫。在单独的经密码子优化的dna和dna初免-蛋白加强方法(a和b)之间或在单独的dna、单独的蛋白、dna初免-蛋白加强以及dna和蛋白的共同递送方法(c和d)之间测量峰值水平(末次免疫后2周)s特异性igg效价(a和c)和nab应答(b和d)。
55.图4非人灵长类动物免疫原性和保护研究。在第0、2和8周，通过肌内针接种对动物进行3次免疫。测量峰值水平(末次免疫后2周)s特异性igg效价(a)、nab应答(b)和s特异性ifn-g(c)以及特异性il-4(d)应答。
56.图5激发后在各种nhp组织中检测到的病毒rna载量。用图4中描述的各种疫苗方法免疫的猴通过气管途径用sars-cov-2活病毒激发，7天后处死动物并测量病毒载量(拷贝/ug)。
57.图6关键器官组织样品(包括肺(a)和气管(b))的组织学分析。模拟、单独的蛋白、单独的dna、或共同递送dna和蛋白疫苗。
58.图7带有s-dtm-opt插入片段的pcw1093质粒图谱。pcmv ie：cmv立即早期启动子，序列位置：103-690；内含子a：cmv内含子a片段，序列位置：825-1650；s：sars-cov2 s蛋白全长编码基因，序列位置：1678-5499；bgh polya：牛生长激素基因多聚腺苷酸化信号，序列位置：5634-5858；pmb1 ori：pmb1质粒复制子，序列位置：6736-7464；kanr：氨基糖苷类磷酸转移酶基因，序列位置：7566-8381。
具体实施方式
59.除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。与本文所述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料均可以用于实践本发明。提供以下定义是为了便于理解本文使用的某些术语，并不意味着限制本公开的范围。
60.冠词“a”和“an”在本文中用于指代该冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。例如，“(an)要素”意指一个要素或多于一个要素。
61.如本文所用，“dna疫苗”是指包含编码蛋白抗原的dna序列的dna分子，并且在施用于受试者(例如人)后，导致受试者对抗原产生体液(和细胞介导的)免疫。通常，编码蛋白抗原的dna序列可操作地连接至表达控制序列，例如启动子，或转录因子结合位点阵列。表达控制序列指导dna序列的转录。dna疫苗可以包括裸dna疫苗，例如质粒疫苗，以及作为病毒颗粒递送的基于病毒载体的dna疫苗。与传统疫苗相比，dna疫苗具有优势，包括易于产生、稳定性和在室温下运输。
62.如本文所用，“抗原肽疫苗”是指将刺激宿主的免疫系统以产生体液和/或细胞抗原特异性应答的蛋白抗原。抗原肽含有一个或更多个表位(线性的、构象的或两者)。通常，表位将包含约7至15个氨基酸，例如9、10、12或15个氨基酸。可以通过本领域已知的各种方法获得抗原肽。
63.术语“表达”是指由编码序列编码的产物的生物产生。在大多数情况下，编码序列被转录形成信使rna(mrna)。然后将信使rna被翻译成具有相关生物活性的多肽产物。此外，表达过程可以涉及对转录的rna产物的进一步加工步骤，例如剪接以去除内含子，和/或多肽产物的翻译后加工。
[0064]“密码子优化”或“经密码子优化以表达”是指通过用感兴趣的受试者的基因中更频繁或最频繁使用的密码子取代天然序列的至少一个、多于一个或显著数量的密码子来改变dna序列以增强在目标受试者(例如人)的细胞中的表达。
[0065]
蛋白的“保守部分”是指在自然界中可能具有高序列多样性的蛋白(例如病毒蛋白)中保守的蛋白片段。保守部分不需要在蛋白的天然存在序列的多样性中具有100％序列同一性，但天然存在的序列中的序列变异性很低，例如小于10％或5％。
[0066]
氨基酸序列的“功能变体”是指表现出与与之比较的氨基酸序列相同或类似的一种或更多种功能特性的任何变体，例如，它是功能等同物。就抗原肽而言，一种特定功能是
当施用于哺乳动物受试者时能够引发抗病毒的中和抗体的产生。在一些实施方案中，当使用本领域技术人员认可的标准检测进行测量时，此类功能变体可以具有至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％或更多的如seq id no:7中所示的序列的抗原肽活性。功能变体可以包括相对于本文所述序列具有改变或突变(例如，至少约一个、两个或四个，和/或通常小于15、10、5或3个)的肽(例如，保守或非必需氨基酸取代)，其对肽功能没有实质影响。可以例如通过评价突变是否具有保守性来预测特定替换是否是将被容忍，即不会对生物学特性产生不利影响。
[0067]“疫苗组合”是指dna疫苗和抗原肽疫苗的组合，它们被施用于同一受试者以引发免疫应答。在一些实施方案中，dna疫苗和抗原肽疫苗与药学上可接受的溶媒共同配制在单一疫苗制剂中。在其他实施方案中，dna疫苗和抗原肽疫苗与药学上可接受的溶媒各自配制成单独的疫苗制剂。
[0068]
在dna疫苗和抗原肽疫苗是单独的疫苗制剂的实施方案中，dna疫苗和抗原肽疫苗可以同时(即共同施用)或序贯施用于受试者。
[0069]
如本文所用，“同时施用”、“共同施用”或“共同递送”意指将dna疫苗和抗原肽疫苗同时或基本上同时施用于同一受试者。例如，首先施用dna疫苗，然后在1小时、1天或2天内施用抗原肽疫苗。在这些情况下，抗原肽疫苗通常在首次施用的dna疫苗能够在受试者体内诱导有效免疫应答之前施用。因此，这种施用方案不同于“初免-加强”方法。相反，“序贯施用”意指在不同时间施用两种疫苗，其中对第一种疫苗的应答通过包含与第一种疫苗相同或不同抗原的第二种疫苗加强。
[0070]
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括可能导致对受试者的疾病(或病症)的症状或病理学产生任何有益或期望的效果，甚至是对正在接受治疗的疾病的一种或更多种可测量标志物的最低限度的减少。“治疗”可以任选地涉及延缓疾病的进展。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或其相关症状。
[0071]
如本文所用，术语“预防(prevention或preventing)”涉及采取必要的措施以预防受试者发生疾病或降低受试者发生疾病的可能性。这并不意味着疾病将不发生。
[0072]
如本文所用，术语“受试者”是指被施用本发明的疫苗的生物体。优选地，受试者是鸟类或哺乳动物，例如人类、灵长类动物、家畜或啮齿动物。
[0073]
本发明的疫苗可以作为纯化合物使用，或者可以与药学上可接受的载体一起配制以形成疫苗制剂。药学上可接受的载体是本领域熟知的并且包括，例如，水溶液，例如水或生理缓冲盐水或其他溶剂。在优选的实施方案中，当此类药物组合物用于人施用时，例如用于肠胃外施用时，水溶液是无热原的，或基本上无热原的。
[0074]
本发明的疫苗的施用途径可以是肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹腔、动脉内、病灶内、关节内、外用、口服、直肠、鼻内或任何其他合适的途径。
[0075]
用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染的本发明的疫苗的“有效量”可以根据受试者(例如，患者)的疾病状态、年龄、性别和体重而变化。在特定实施方案中设想的待施用的精确量可以由医师根据受试者的状况来确定。
[0076]
在目前的研究中，我们开发了新型亚单位covid-19疫苗，包括同时共同递送的s全长dna质粒和s1重组蛋白。与单独使用dna或蛋白组分相比，这种设计在引发更高免疫应答(包括保护性抗体和t细胞应答)方面最为有效。更重要的是，这种新型covid-19疫苗设计能
够在nhp模型(例如恒河猴)中引发抗sars-cov-2激发的全面保护，这在先前的类似nhp模型中的covid-19疫苗研究中很难实现。。
[0077]
本发明的一些实施方案至少部分基于出乎意料的发现，即编码s蛋白的野生型dna序列不引发s特异性抗体应答，而编码相同蛋白(或其截短的可溶性形式)的经密码子优化的dna序列能够引发显著的s特异性抗体应答。本发明的一些实施方案至少部分基于出乎意料的发现，即在nhp模型研究中，编码s蛋白的dna疫苗和包含s1亚基的抗原疫苗的组合能够提供对sars-cov-2病毒感染的全面保护。
[0078]
dna疫苗的构建和产生
[0079]
野生型(s-fl-wt)和经密码子优化的sars-cov-2刺突蛋白(seq id no:1)全长基因序列(s-fl-opt)基于wuhan-hu-1(genbank:mn908947)商业合成。使用寡聚体w1404-taccgagctcggatccgccaccat(seq id no:12)和w1406-gatatctgcagaattctcaaggccacttgatgtactgctcg(seq id no:13)从全长opt序列产生可溶性s胞外域插入序列(s-dtm-opt)。通过in-fusion克隆技术(takara bio，china)将所有三个插入片段(s-fl-wt(seq id no:2)、s-fl-opt(seq id no:3)和s-dtm-opt(seq id no:4))单独亚克隆至哺乳动物表达质粒pcdna3.1+的bamhi和ecori之间。使用无内毒素质粒maxi试剂盒(qiagen，usa)从大肠杆菌中纯化这些表达s的dna疫苗质粒(takara bio，china)。所有质粒序列均通过sanger dna测序确认。
[0080]
如先前所报道(34)，通过将s-fl-opt插入片段亚克隆至可用于人的dna疫苗载体psw3891中产生dna疫苗pcw1093。使用寡聚体w1477-tccatgggtcttttctgcagtcaccgtccaagcttgcaatcgccaccatgttcgtgt tcct(seq id no:5)和w1479-gggattgcgaggatccttatcatgtgtagtggagcttcacg(seq id no:6)从s-fl-opt模板扩增插入片段，并在psti和bamhi位点融合至线性化的psw3891中。将pcw1093质粒(图7，seq id no:11)转化至感受态大肠杆菌(thermo fisher scientific，usa)中，挑取单个克隆并扩增以产生最终的主种子批次(msl)和工作种子批次(wsl)。用于非人灵长类动物激发研究的pcw1093 dna质粒在现行良好生产规范(current good manufacturing practices,cgmp)法规要求的条件下生产。来自wsl的细菌被逐渐扩增至发酵罐，并且pcw1093 dna质粒通过碱裂解从最终的发酵细菌颗粒中释放。通过过滤、层析和超滤进一步纯化超螺旋质粒dna。检测超螺旋质粒dna并用盐溶液缓冲以用于免疫用途。
[0081]
s1蛋白的产生和使用
[0082]
将密码子优化的编码s1蛋白(seq id no:7)的基因序列亚克隆至哺乳动物表达载体中，用于体外产生重组s1蛋白用于研究应用，并在s1蛋白的c-末端添加his标签用于纯化目的。用表达s1的质粒转染expi293细胞(invitrogen，us)，在第5天收获细胞培养物的上清液，并通过histrap hp柱纯化s1蛋白。在用于免疫和elisa研究目的之前，通过sds-page和western印迹分析验证其质量。用于免疫时，s1蛋白以1:3.5(w/w)的比例用氢氧化铝(brenntag biosector,frederikssund,denmark)吸附。
[0083]
western印迹分析
[0084]
如先前所报道(35)，使用pei作为转染剂，检测表达s的dna疫苗在瞬时转染的293t细胞中的体外表达。转染后72小时，使用对sars-cov-2病毒s蛋白特异的兔多克隆血清l295-iv作为检测抗体，对培养上清液或细胞裂解物进行western印迹分析。类似地，使用相
同兔多克隆血清通过western印迹检测从expi293细胞产生中纯化的重组s1蛋白。
[0085]
动物免疫
[0086]
探索性动物研究
[0087]
在小鼠和非人灵长类动物中进行探索性动物dna免疫研究，以比较不同的表达s的dna疫苗构建体(s-fl-wt、s-fl-opt和s-dtm-opt)的相对免疫原性。在第0、2和4周对6-8周龄c57bl/6n小鼠或3-4岁恒河猴进行三次免疫，每次用helio gene gun(bio-rad,usa)递送5μg dna。在研究开始前或每次免疫后14天收集血清样品。
[0088]
在新西兰白(nzw)兔中进行另外的探索性研究。通过针肌内注射(im)用dna疫苗(s-fl-opt)对兔进行三次(第0、2和6周)免疫，每次用200μg dna疫苗，或在第0周和第2周接受两次im dna免疫(s-fl-opt或s-dtm-opt)，随后在第6周im注射一次50μg重组s1蛋白疫苗。在研究开始前或第3次免疫后14天收集血清样品。
[0089]
最佳疫苗接种设计研究
[0090]
在nzw兔中进一步研究不同疫苗接种设计(单独的s-fl-opt dna、单独的s1蛋白或共同递送s-fl-opt dna+s1蛋白疫苗)的相对免疫原性。所有动物在第0周、第2周和第6周以固定剂量接受三次肌内(im)针免疫：200μg dna疫苗和50μg蛋白疫苗，单独或联合递送。在研究开始前或第3次免疫后14天收集血清样品。
[0091]
非人灵长类动物(nhp)免疫原性和保护研究
[0092]
在第0、2和8周用以下疫苗接种方案中的一种对随机分配的3-4岁恒河猴组进行三次免疫：每次使用dna疫苗pcw1093(每次2mg)、重组s1蛋白(每次100μg)或共同递送dna疫苗pcw1093(2mg)和s1蛋白(100μg)，均通过肌内针注射递送。对照动物接受盐水注射。在研究开始前和每次免疫后7天收集外周血，用于常规血液生化检测和sars-cov-2特异性免疫应答。
[0093]
在第三次免疫后4周进行激发研究，在麻醉下通过气管内途径直接接种5
×
106tcid50的sars-cov-2病毒。在激发后0、2、4、6和7天收集喉咙和肛门拭子，用于确定病毒载量。在激发后7天，对所有动物实施安乐死，检测不同组织中的病毒载量，并进行病理学检查。
[0094]
病毒和细胞系
[0095]
sars-cov-2毒株bp16由云南省昆明市的covid-19患者的痰液中分离，并在vero细胞中扩增。提取病毒基因组并进行纳米孔测序(nextomics bioscience，wuhan)。与wuhan-hu-1比对，bp16完整基因组含有两个突变c8782t和t28144c。前者是沉默突变，后者导致orf8(l84s)的氨基酸差异。bp16用于中和和激发测定。vero细胞用于产生和滴定sars-cov-2储备液。vero细胞在添加10％胎牛血清(fbs,gibco)、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dulbecco改良的eagle培养基(dmem,corning)中维持，并在37℃、5％ co2下孵育。通过微剂量致细胞病变效率(cpe)测定确定sars-cov-2病毒效价。将连续10倍稀释的含病毒样品与2
×
104个vero细胞混合，然后置于96孔培养板中。于37℃下在5％ co2培养箱中培养5天后，在显微镜下检查细胞cpe的存在情况。sars-cov-2的效价通过50％组织培养感染剂量(tcid50)测定解析。
[0096]
elisa
[0097]
将96孔elisa板(corning，usa)用100μl包被缓冲液(15mm na2co3和35mm nahco3，
kit(takara)对病毒grna进行逆转录和扩增。病毒载量计算为每ml或每mg组织的病毒rna拷贝，检测灵敏度为100拷贝。扩增的靶标是sars-cov2 n(核衣壳)基因。靶标的引物和探针是：
[0106]
n-f:5
’‑
ggggaacttctcctgctagaat-3’(seq id no:8)；n-r:5
’‑
cagacattttgctctcaagctg-3’(seq id no:9)；n-p:5
’‑
vic-ttgctgcttgacagatt-bhq1-3’(seq id no:10)。
[0107]
为了通过rt-pcr定量病毒载量，使用从已知拷贝数的重组质粒pcdna3.1-ncov n体外转录的rna连续10倍稀释生成ct值与病毒rna拷贝数的标准曲线。每个样品的病毒载量用ct值和标准曲线转换。由lightcycler 480软件进行统计分析。
[0108]
组织病理学分析
[0109]
收集的组织切片(3mm厚)用4％甲醛固定1周。将固定的组织进一步脱水，然后切成2-3μm厚的切片，并在温水(40℃)中平贴在载玻片上。载玻片在60℃下进一步干燥脱蜡，并用苏木精染色3-5min，用盐酸水溶液分化，氨水溶液显蓝，脱水后用伊红染色5min。最后用中性凝胶封片。
[0110]
统计分析
[0111]
使用graphpad prism 8.4.2(graphpad software)对病毒学和免疫学数据进行分析。使用双侧mann-whitney检验进行组间数据比较。通过双侧spearman秩相关检验评估相关性。student t检验用于比较组间抗体效价。p值小于0.05被认为是具有显著性。
[0112]
本研究基于过去20年文献中积累的大量信息进行设计，包括我们自己的工作，即单独使用dna疫苗的免疫原性是有限的(36-38)，即使包含分子佐剂，例如表达免疫增强细胞因子的质粒(39,40)。物理递送方法(例如基因枪和电穿孔)可以大大增强免疫原性，但使用物理仪器增加成本和复杂性。一个有前景的选择是将dna疫苗与另一种疫苗模式(例如重组蛋白疫苗，其与dna疫苗表达的抗原共享相同抗原)进行异源初免-加强或共同递送(41-44)。
[0113]
在本研究中我们采用了相同的概念来检测与单独使用dna或蛋白组分相比，dna和蛋白covid-19疫苗的组合是否能够大大增强保护性免疫原性。
[0114]
实施例
[0115]
实施例1
[0116]
在比较两种相似版本的候选s dna疫苗的免疫原性后，选择表达sars-cov-2的s蛋白作为关键保护性抗原的dna疫苗的优化设计。第一种是s-fl-opt，是全长s基因插入片段，其表达的氨基酸序列与sars-cov-2病毒的天然s蛋白完全相同(图1a)。唯一的变化是用经密码子优化的s基因序列(-opt)取代野生型s基因核酸序列(-wt)，方法与我们先前报道的sars和流感dna疫苗相同(45,46)。另一种sdna疫苗设计包括s-dtm-opt插入片段，其类似于经密码子优化的s-fl-opt，但s蛋白的跨膜和细胞质结构域截短(图1a)。使用这些dna质粒在293t细胞中的体外转染，然后进行western印迹分析，证实了两种dna疫苗设计的s抗原表达(图1b)。
[0117]
在多种动物模型中研究s-fl-opt和s-dtm-opt dna疫苗的相对免疫原性。首先在使用基因枪递送的balb/c小鼠中，s-fl-opt和s-dtm-opt dna疫苗均引发s特异性血清抗体应答，并且在每次用相同的dna疫苗免疫后效价均上升(图2a)。三次免疫后的峰值水平抗体
应答具有统计学差异，s-fl-opt组的效价远高于s-dtm-opt组。接受编码全长s基因的野生型基因序列(s-fl-wt)的dna疫苗或生理盐水(模拟)的小鼠没有可检出的s特异性抗体应答(图2a)。与结合抗体数据一致，来自s-fl-opt组的免疫血清具有比s-dtm-opt组更高的中和抗体(nab)效价(p《0.05)，并且在任一s-fl-wt或模拟组中均未检测到可检出的nab(图2b)。总体上，当单独检测表达s的dna疫苗时，小鼠模型中的nab水平较低。
[0118]
然后在使用基因枪递送的探索性非人灵长类动物(nhp)研究中，s-fl-opt组的血清s特异性igg效价的时间发展和峰值水平均显著高于s-dtm-opt组(p《0.05)(图2c-2d)。但是两种s表达dna疫苗中的任何一种引起的nab应答均很低或几乎无法检出(现显示数据)。另一方面，通过elispot分析测量，全长s抗原设计(s-fl-opt)能够诱导比s-dtm-opt组更高水平的ifn-γ和il-4应答(图2e和2f)。
[0119]
实施例2
[0120]
在确定最优的表达s的dna疫苗设计后，从瞬时转染的expi293细胞平行产生重组s1蛋白，以使其可用于检测dna和蛋白组合疫苗策略。s1蛋白基因的设计如图1a所示，其中用组织纤溶酶原激活剂(tpa)前导肽取代了来自sars-cov-2的s蛋白的天然信号肽序列，希望能优化分泌型s1蛋白的产生，如先前其他病毒蛋白所显示的那样(47)。包括受体结合结构域(rbd)在内的完整s1蛋白序列与原始病毒一样被保留。众所周知，全长sars-cov-2s重组蛋白的产生在技术上具有挑战性，因为它不稳定且难以获得高产量的纯化的全长重组s蛋白(48-50)。由于rbd被认为是保护性抗体应答的主要靶标，所以我们假设s1蛋白而不是全长s蛋白应该提供相同的促进作用，以聚焦于用全长s dna疫苗初免的宿主中的rbd区。本研究中使用的重组s1蛋白由基于研究实验室的生产过程部分纯化，如图1b中泳道7所示。
[0121]
在nzw兔中进行免疫原性研究，以检测dna和蛋白组合疫苗设计的免疫原性。本研究中的dna和蛋白疫苗均通过传统的针肌内注射(im)递送。单独使用s-fl-opt dna疫苗对动物进行免疫，或者在用两种s dna疫苗(s-fl-opt或s-dtm-opt)中的一种初免后用s1蛋白加强免疫。结果清楚地表明，与单独给予dna疫苗相比，蛋白加强在引发更高s特异性igg应答方面高度有效。蛋白加强能够使得用次优dna疫苗s-dtm-opt初免的动物中的抗体效价高于仅接受单独使用最佳dna疫苗s-fl-opt的动物。然而，在s1蛋白加强后，用最佳dna疫苗s-fl-opt初免的动物的效价仍然高于用次优dna疫苗s-dtm-opt初免的那些(图3a)。初免-加强组显示出易于检测的nab应答，而且同一组内动物间的差异最小。s-fl-opt初免+s1蛋白加强具有最高效价的nab(图3b)。这些数据表明，使用最佳dna疫苗设计进行初免是至关重要的，特别是对于诱导高水平nab，而蛋白加强可以进一步最大限度地提高保护性抗体应答的水平。
[0122]
实施例3
[0123]
我们接下来在nzw兔模型中检测了表达全长s的dna和s1蛋白疫苗的序贯和共同递送之间的相对免疫原性。据报道共同递送的免疫计划产生高度免疫原性(51)，并且更容易在大的人群体中实施，而无需像在序贯初免-加强设计中那样跟踪何时要施用dna或蛋白疫苗组分。接受共同递送的dna和蛋白疫苗的兔能够诱导比单独的dna组更高的s特异性igg应答，但仅比单独的蛋白组略好(图3c)。然而，非常有趣的发现是共同递送组的血清nab效价远高于单独的dna或单独的蛋白组(图3d)。这一发现支持了dna疫苗在引发对保护功能至关重要的高度构象抗体应答方面的价值(52,53)。此外，序贯dna初免-蛋白加强方法在引发s1
特异性igg抗体应答方面的免疫原性略低于共同递送(图3c)，但dna和蛋白疫苗的序贯和共同递送之间的nab应答非常类似(图3d)。
[0124]
基于上述探索性动物研究的结果，选择dna和蛋白疫苗的共同递送方法作为我们候选covid-19疫苗的主要免疫设计，并在对抗活sars-cov-2病毒激发的nhp保护研究中进行进一步检测。如在初步的兔研究中所见，s-fl-opt dna疫苗和重组s1蛋白疫苗的共同递送是免疫原性最高的设计，它比单独的dna或单独的蛋白组引发更高s特异性igg应答(两种情况下p《0.05)(图4a)。更重要的是，在三个疫苗组中共同递送组引发最高的nab活性(图4b)。在t细胞免疫应答方面，单独的dna组或共同递送组均能够引发强烈的ifn-γ和il-4应答，并且这种应答远高于在单独的蛋白疫苗组中检测到的应答(图4c和图4d)。我们的数据验证了dna疫苗能很好地引发t细胞免疫的长时间的设想(54-56)。
[0125]
这项nhp研究中的动物通过气管内途径进一步用活sars-cov-2病毒激发。s-fl-opt dna和重组s1蛋白疫苗的共同递送实现了全面保护。在这组动物的气管、肺淋巴组织和肺组织中未检出病毒(图5a-c)。对于模拟组的动物，在所有三个组织中均检测到高水平的病毒。接受单独的dna疫苗的动物的病毒检测水平低于模拟组，但仍然在三只动物的气管和两只动物的肺中检测到病毒rna(图5a-c)。处死动物肺组织的组织学分析显示，模拟猴肺样品中存在重度炎症，而任何covid-19疫苗方法均能够大大减轻炎症(图6a)。类似地，模拟组猴的粘膜表面重度受损，但任何covid-19疫苗接种组的猴均未出现(图6b)。结合抗体和t细胞应答的更佳免疫原性以及对病毒激发的全面保护，我们的数据强烈支持开发基于新型dna和蛋白组合配方的强效covid-19疫苗，其可以提供强大且持久的免疫保护。
[0126]
讨论
[0127]
需要安全且有效的sars-cov-2疫苗来结束全球covid-19大流行。多种候选疫苗已进入iii期人体功效试验，其中一些有望在不久的将来获得监管部门的批准，可能用于某些高风险人群。然而，目前对这些主要候选疫苗的真正保护功效知之甚少，更重要的是，这些候选疫苗的免疫保护能持续多长时间。谨慎的做法是开发下一代疫苗，与正在开发的第一代covid-19疫苗相比，能够引发更强的免疫应答和更好地抗sars-cov-2病毒感染。
[0128]
在这项研究中，我们分析了dna、蛋白以及dna和蛋白疫苗组合的相对免疫原性。我们证明，虽然密码子优化和优化的s基因插入片段设计可以产生免疫原性更高的表达s的dna疫苗，如先前所报道(57)，但与单独使用dna或蛋白疫苗的方法相比，dna和蛋白的组合可以显著提高整体抗s抗体应答，特别是nab应答。序贯dna初免-蛋白加强以及同时共同递送dna和蛋白组分在引发高水平保护性抗体应答方面的有效性类似，表明dna疫苗在产生抗构象敏感表位的抗体方面的价值(52,53)。对于大规模人群应用，共同递送方法可能更实用，因为每次免疫的疫苗制剂均相同，并且无需如在序贯初免和加强方案中一样担心是否要施用dna或蛋白疫苗。
[0129]
通过使用dna和蛋白疫苗的共同递送方法，我们证明了与假手术对照动物相比，它可以在所有接受这种组合疫苗制剂的猴中引发全面保护，而在所有研究的组织中没有任何可检出的病毒。如目前的其他covid-19疫苗所报道，单独的dna疫苗或单独的蛋白疫苗方法均实现了各种组织中病毒载量的降低，但在这两组中的任何免疫的猴中均没有实现全面保护。
[0130]
我们的数据扩展了先前的研究，其表明dna和蛋白组合疫苗在引发抗hiv-1或流感
的有效免疫应答方面比单独使用任何一种组分更有效(36,37,42)。如我们所报道(58-61)，dna免疫可以使用先天免疫和获得性免疫机制来诱导抗原特异性b细胞应答的发展，尤其是那些生发中心b细胞，这是在蛋白疫苗加强后抗体应答大大增加的基础。现在已知，sars-cov-2感染不能在临床症状轻微的患者中建立持久抗体应答，这表明其s抗原的潜在低免疫原性。这些发现表明，成功的covid-19疫苗需要引发比自然感染更强的反应，而持久的免疫应答(包括持久的s特异性记忆b细胞)可能至关重要。我们的方法包括dna组分，将极大地促进这一过程。更重要的是，包含dna疫苗组分可以达到两个重要目的：1)提高抗体应答的质量，例如nab的水平，因为dna疫苗能够诱导更好的抗构象表位的抗体应答(52,53)，以及2)通过与基于蛋白的疫苗相比更好地激活生发中心b细胞发育而引发高水平的抗原特异性记忆b细胞(60,61)。
[0131]
然而，也如本研究所显示的，更优化的dna疫苗的免疫原性在可能引发多高的抗体应答方面仍有限制，而蛋白疫苗的加入可以进一步提高该限制。低免疫原性是各种核酸疫苗的共同特征，包括单独使用的dna和rna疫苗。如我们在过去二十年中所了解的，增强递送、使用免疫刺激细胞因子或佐剂以及物理递送工具(基因枪或电穿孔)等策略只能部分提高基于核酸的疫苗的免疫原性(62)，还可能带来其他问题，例如安全性、成本和使用复杂性。dna和蛋白组合疫苗策略提供了独特的解决方案，可以最大限度地发挥两种疫苗模式的功效，而不引起任何另外的安全性问题(41,63)。虽然我们过去侧重于初免-加强方法，但我们目前的数据证明，在非人灵长类动物模型中，同时共同递送dna和蛋白疫苗也可以产生更高的免疫应答并增强疫苗对sars-cov-2的保护作用。如果需要高免疫应答和持久免疫来实现全球范围内对covid-19的完全控制，则dna和蛋白组合配方应被视为下一代改进型covid-19疫苗的主要候选者.
[0132]
以下列出的是本文提到的一些氨基酸序列和核酸序列。
[0133]
s蛋白的氨基酸序列(seq id no:1)
[0134]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeq
yikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt.
[0135]
s蛋白编码序列(s-fl-wt，seq id no:2)
[0136]
atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagagacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaa
cttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgacaaagttgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtatgaccagttgctgtagttgtctcaagggctgttgttcttgtggatcctgctgcaaatttgatgaagacgactctgagccagtgctcaaaggagtcaaattacattacacataa
[0137]
s蛋白编码序列(s-fl-opt,seq id no:3)
[0138]
atgttcgtgttcctggtgctcctccctctcgtgtcttctcagtgcgtgaacctgaccacacggacccagctgccacccgcttacaccaactccttcacaagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttccggtcttctgtgctccactctacccaggacctgttcct
[0139]
gccattcttctctaacgtgacatggttccacgctatccacgtgtctggcaccaacgg
[0140]
cacaaagagattcgacaaccccgtgctcccattcaacgacggcgtgtacttcgcta
[0141]
gcacagagaagtccaacatcatccggggctggatcttcggcaccacactggactct
[0142]
aagacccagtccctcctcatcgtgaacaacgccacaaacgtggtgatcaaggtgtg
[0143]
cgagttccagttctgcaacgacccattcctgggcgtgtactaccacaagaacaaca
[0144]
agtcttggatggagagcgagttccgggtgtactctagcgctaacaactgcacattc
[0145]
gagtacgtgtctcagccattcctcatggacctcgagggcaagcagggcaacttcaa
[0146]
gaacctgagggagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctactcta
[0147]
agcacaccccaatcaacctggtgagggacctgcctcagggcttctccgctctcgag
[0148]
ccactggtggacctgccaatcggcatcaacatcacccggttccagacactcctcgc
[0149]
cctccaccggtcttacctgaccccaggcgactctagcagcggctggaccgccggcg
[0150]
ccgccgcttactacgtgggctacctgcagcctaggacattcctcctgaagtacaacg
[0151]
agaacggcacaatcaccgacgctgtggactgcgccctcgacccactgagcgagac
[0152]
aaagtgcacactgaagtctttcacagtggagaagggcatctaccagacatctaact
[0153]
tcagagtgcagcctacagagtctatcgtgagattcccaaacatcacaaacctgtgc
[0154]
cctttcggcgaggtgttcaacgctacacggttcgcttctgtgtacgcttggaaccg
[0155]
gaagcggatctctaactgcgtggccgactactctgtgctgtacaactccgcctcttt
[0156]
ctccacattcaagtgctacggcgtgagcccaacaaagctgaacgacctgtgcttca
[0157]
caaacgtgtacgccgactctttcgtgatccggggcgacgaggtgaggcagatcgct
[0158]
ccaggccagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctccccgacgacttca
[0159]
caggctgcgtgatcgcttggaactctaacaacctggactctaaggtgggcggcaac
[0160]
tacaactacctgtacagactgttccggaagtctaacctgaagcctttcgagcggga
[0161]
catctctaccgagatctaccaggccggcagcaccccttgcaacggcgtggagggct
[0162]
tcaactgctacttcccactgcagtcttacggcttccagcctacaaacggcgtgggct
[0163]
accagccataccgggtggtggtgctgtccttcgagctcctccacgcccccgctaca
[0164]
gtgtgcggcccaaagaagtccacaaacctcgtgaagaacaagtgcgtgaacttca
[0165]
acttcaacggcctgacaggcacaggcgtgctcacagagtctaacaagaagttcct
[0166]
ccctttccagcagttcggccgggacatcgccgacaccaccgacgccgtgagggac
[0167]
cctcagacactcgagatcctcgacatcaccccttgctctttcggcggcgtgtctgtg
[0168]
atcacccccggcacaaacacatctaaccaggtggctgtgctgtaccaggacgtgaa
[0169]
ctgcaccgaggtgccagtggctatccacgccgaccagctcacccctacatggaggg
[0170]
tgtacagcacaggctctaacgtgttccagacgagggccggctgcctcatcggcgcc
[0171]
gagcacgtgaacaactcttacgagtgcgacatcccaatcggcgctggcatctgcgc
[0172]
ttcttaccagacccagacaaacagccctaggagagctaggtccgtggctagccagt
[0173]
ccatcatcgcttacaccatgtctctgggcgctgagaactctgtggcttactctaaca
[0174]
actctatcgctatccctacaaacttcacaatctctgtgaccaccgagatcctgccag
[0175]
tgtctatgacaaagacatccgtggactgcaccatgtacatctgcggcgacagcacc
[0176]
gagtgcagcaacctgctcctgcagtacggctctttctgcacacagctgaaccgggc
[0177]
cctcaccggcatcgccgtggagcaggacaagaacacccaggaggtgttcgctcag
[0178]
gtgaagcagatctacaagaccccccctatcaaggacttcggcggcttcaacttctc
[0179]
tcagatcctccccgaccctagcaagcctagcaagcggtctttcatcgaggacctcct
[0180]
gttcaacaaggtgacactcgctgacgctggcttcatcaagcagtacggcgactgcc
[0181]
tgggcgacatcgccgctagagacctgatctgcgctcagaagttcaacggcctcaca
[0182]
gtgctgcccccactcctgaccgacgagatgatcgctcagtacaccagcgccctcct
[0183]
cgctggcacaatcacatctggctggacattcggcgccggcgccgccctgcagatcc
[0184]
cattcgccatgcagatggcttaccggttcaacggcatcggcgtgacccagaacgtg
[0185]
ctgtacgagaaccagaagctgatcgctaaccagttcaactccgctatcggcaagat
[0186]
ccaggactccctgtctagcaccgctagcgccctgggcaagctccaggacgtggtga
[0187]
accagaacgcccaggccctgaacacactggtgaagcagctgtcttctaacttcggc
[0188]
gctatcagctctgtgctcaacgacatcctgtctagactcgacaaggtggaggccga
[0189]
ggtgcagatcgacagactgatcacaggcagactgcagtccctccagacatacgtga
[0190]
cccagcagctcatccgggccgctgagatcagagctagcgctaacctcgccgctacc
[0191]
aagatgagcgagtgcgtgctgggccagtctaagcgggtggacttctgcggcaagg
[0192]
gctaccacctcatgtctttccctcagtccgcccctcacggcgtggtgttcctccacg
[0193]
tgacatacgtgccagctcaggagaagaacttcaccaccgccccagctatctgccac
[0194]
gacggcaaggcccacttcccacgggagggcgtgttcgtgtctaacggcacccact
[0195]
ggttcgtgacacagcggaacttctacgagcctcagatcatcaccacagacaacaca
[0196]
ttcgtgtccggcaactgcgacgtggtgatcggcatcgtgaacaacacagtgtacga
[0197]
cccactgcagcccgagctcgactctttcaaggaggagctcgacaagtacttcaaga
[0198]
accacaccagccccgacgtggacctgggcgacatctctggcatcaacgcctctgtg
[0199]
gtgaacatccagaaggagatcgacagactgaacgaggtggctaagaacctgaacg
[0200]
agtccctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagcagtacatcaagtggcct
[0201]
tggtacatctggctgggcttcatcgctggcctgatcgctatcgtgatggtgacaatc
[0202]
atgctgtgctgcatgacctcttgctgctcttgcctgaagggctgctgctcttgcggc
[0203]
tcttgctgcaagttcgacgaggacgactccgagcccgtgctgaagggcgtgaagc
[0204]
tccactacacatga
[0205]
截短的s蛋白编码序列(s-dtm-opt,seq id no:4)
[0206]
atgttcgtgttcctggtgctcctccctctcgtgtcttctcagtgcgtgaacctgaccacacggacccagctgccacccgcttacaccaactccttcacaagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttccggtcttctgtgctccactctacccaggacctgttcctgccattcttctctaacgtgacatggttccacgctatccacgtgtctggcaccaacggcacaaagagattcgacaaccccgtgctcccattcaacgacggcgtgtacttcgctagcacagagaagtccaacatcatccggggctggatcttcggcaccacactggactctaagacccagtccctcctcatcgtgaacaacgccacaaacgtggtgatcaaggtgtgcgagttccagttctgcaacgacccattcctgggcgtgtactaccacaagaacaacaagtcttggatggagagcgagttccgggtgtactctagcgctaacaactgcacattcgagtacgtgtctcagccattcctcatggacctcgagggcaagcagggcaacttcaagaacctgagggagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctactctaagcacaccccaatcaacctggtgagggacctgcctcagggcttctccgctctcgagccactggtggacctgccaatcggcatcaacatcacccggttccagacactcctcgccctccaccggtcttacctgaccccaggcgactctagcagcggctggaccgccggcg
[0207]
ccgccgcttactacgtgggctacctgcagcctaggacattcctcctgaagtacaacg
[0208]
agaacggcacaatcaccgacgctgtggactgcgccctcgacccactgagcgagac
[0209]
aaagtgcacactgaagtctttcacagtggagaagggcatctaccagacatctaact
[0210]
tcagagtgcagcctacagagtctatcgtgagattcccaaacatcacaaacctgtgc
[0211]
cctttcggcgaggtgttcaacgctacacggttcgcttctgtgtacgcttggaaccg
[0212]
gaagcggatctctaactgcgtggccgactactctgtgctgtacaactccgcctcttt
[0213]
ctccacattcaagtgctacggcgtgagcccaacaaagctgaacgacctgtgcttca
[0214]
caaacgtgtacgccgactctttcgtgatccggggcgacgaggtgaggcagatcgct
[0215]
ccaggccagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctccccgacgacttca
[0216]
caggctgcgtgatcgcttggaactctaacaacctggactctaaggtgggcggcaac
[0217]
tacaactacctgtacagactgttccggaagtctaacctgaagcctttcgagcggga
[0218]
catctctaccgagatctaccaggccggcagcaccccttgcaacggcgtggagggct
[0219]
tcaactgctacttcccactgcagtcttacggcttccagcctacaaacggcgtgggct
[0220]
accagccataccgggtggtggtgctgtccttcgagctcctccacgcccccgctaca
[0221]
gtgtgcggcccaaagaagtccacaaacctcgtgaagaacaagtgcgtgaacttca
[0222]
acttcaacggcctgacaggcacaggcgtgctcacagagtctaacaagaagttcct
[0223]
ccctttccagcagttcggccgggacatcgccgacaccaccgacgccgtgagggac
[0224]
cctcagacactcgagatcctcgacatcaccccttgctctttcggcggcgtgtctgtg
[0225]
atcacccccggcacaaacacatctaaccaggtggctgtgctgtaccaggacgtgaa
[0226]
ctgcaccgaggtgccagtggctatccacgccgaccagctcacccctacatggaggg
[0227]
tgtacagcacaggctctaacgtgttccagacgagggccggctgcctcatcggcgcc
[0228]
gagcacgtgaacaactcttacgagtgcgacatcccaatcggcgctggcatctgcgc
[0229]
ttcttaccagacccagacaaacagccctaggagagctaggtccgtggctagccagt
[0230]
ccatcatcgcttacaccatgtctctgggcgctgagaactctgtggcttactctaaca
[0231]
actctatcgctatccctacaaacttcacaatctctgtgaccaccgagatcctgccag
[0232]
tgtctatgacaaagacatccgtggactgcaccatgtacatctgcggcgacagcacc
[0233]
gagtgcagcaacctgctcctgcagtacggctctttctgcacacagctgaaccgggc
[0234]
cctcaccggcatcgccgtggagcaggacaagaacacccaggaggtgttcgctcag
[0235]
gtgaagcagatctacaagaccccccctatcaaggacttcggcggcttcaacttctc
[0236]
tcagatcctccccgaccctagcaagcctagcaagcggtctttcatcgaggacctcct
[0237]
gttcaacaaggtgacactcgctgacgctggcttcatcaagcagtacggcgactgcc
[0238]
tgggcgacatcgccgctagagacctgatctgcgctcagaagttcaacggcctcaca
[0239]
gtgctgcccccactcctgaccgacgagatgatcgctcagtacaccagcgccctcct
[0240]
cgctggcacaatcacatctggctggacattcggcgccggcgccgccctgcagatcc
[0241]
cattcgccatgcagatggcttaccggttcaacggcatcggcgtgacccagaacgtg
[0242]
ctgtacgagaaccagaagctgatcgctaaccagttcaactccgctatcggcaagat
[0243]
ccaggactccctgtctagcaccgctagcgccctgggcaagctccaggacgtggtga
[0244]
accagaacgcccaggccctgaacacactggtgaagcagctgtcttctaacttcggc
[0245]
gctatcagctctgtgctcaacgacatcctgtctagactcgacaaggtggaggccga
[0246]
ggtgcagatcgacagactgatcacaggcagactgcagtccctccagacatacgtga
[0247]
cccagcagctcatccgggccgctgagatcagagctagcgctaacctcgccgctacc
[0248]
aagatgagcgagtgcgtgctgggccagtctaagcgggtggacttctgcggcaagg
[0249]
gctaccacctcatgtctttccctcagtccgcccctcacggcgtggtgttcctccacg
[0250]
tgacatacgtgccagctcaggagaagaacttcaccaccgccccagctatctgccac
[0251]
gacggcaaggcccacttcccacgggagggcgtgttcgtgtctaacggcacccact
[0252]
ggttcgtgacacagcggaacttctacgagcctcagatcatcaccacagacaacaca
[0253]
ttcgtgtccggcaactgcgacgtggtgatcggcatcgtgaacaacacagtgtacga
[0254]
cccactgcagcccgagctcgactctttcaaggaggagctcgacaagtacttcaaga
[0255]
accacaccagccccgacgtggacctgggcgacatctctggcatcaacgcctctgtg
[0256]
gtgaacatccagaaggagatcgacagactgaacgaggtggctaagaacctgaacg
[0257]
agtccctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagcagtacatcaagtggcct
[0258]
tga
[0259]
s1亚基的氨基酸序列(seq id no:7)
[0260]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitp
gtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrar.
[0261]
pcw1093全长序列(8515bp,seq id no:11)
[0262]
ctgacgtcgcggtcgacaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttgacattagttattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattgg
[0263]
aacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggca
[0264]
cacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacaccccc
[0265]
gcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccat
[0266]
tattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctct
[0267]
ttgccacaactatctctattggctatatgccaatactctgtccttcagagactgacac
[0268]
ggactctgtatttttacaggatggggtcccatttattatttacaaattcacatatacaa
[0269]
caacgccgtcccccgtgcccgcagtttttattaaacatagcgtgggatctccacgcg
[0270]
aatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttcca
[0271]
catccgagccctggtcccatgcctccagcggctcatggtcgctcggcagctccttgc
[0272]
tcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacaatgcccaccaccaccagtgtg
[0273]
ccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggagattgggc
[0274]
tcgcaccgctgacgcagatggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggc
[0275]
agctgagttgttgtattctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgtta
[0276]
acggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccacca
[0277]
gacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtc
[0278]
accgtccaagcttgcaatcgccaccatgttcgtgttcctggtgctcctccctctcgt
[0279]
gtcttctcagtgcgtgaacctgaccacacggacccagctgccacccgcttacacca
[0280]
actccttcacaagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttccggtcttctgtgctc
[0281]
cactctacccaggacctgttcctgccattcttctctaacgtgacatggttccacgcta
[0282]
tccacgtgtctggcaccaacggcacaaagagattcgacaaccccgtgctcccattc
[0283]
aacgacggcgtgtacttcgctagcacagagaagtccaacatcatccggggctggat
[0284]
cttcggcaccacactggactctaagacccagtccctcctcatcgtgaacaacgcca
[0285]
caaacgtggtgatcaaggtgtgcgagttccagttctgcaacgacccattcctgggc
[0286]
gtgtactaccacaagaacaacaagtcttggatggagagcgagttccgggtgtactc
[0287]
tagcgctaacaactgcacattcgagtacgtgtctcagccattcctcatggacctcga
[0288]
gggcaagcagggcaacttcaagaacctgagggagttcgtgttcaagaacatcgac
[0289]
ggctacttcaagatctactctaagcacaccccaatcaacctggtgagggacctgcc
[0290]
tcagggcttctccgctctcgagccactggtggacctgccaatcggcatcaacatca
[0291]
cccggttccagacactcctcgccctccaccggtcttacctgaccccaggcgactct
[0292]
agcagcggctggaccgccggcgccgccgcttactacgtgggctacctgcagcctag
[0293]
gacattcctcctgaagtacaacgagaacggcacaatcaccgacgctgtggactgcg
[0294]
ccctcgacccactgagcgagacaaagtgcacactgaagtctttcacagtggagaa
[0295]
gggcatctaccagacatctaacttcagagtgcagcctacagagtctatcgtgagatt
[0296]
cccaaacatcacaaacctgtgccctttcggcgaggtgttcaacgctacacggttcg
[0297]
cttctgtgtacgcttggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactctg
[0298]
tgctgtacaactccgcctctttctccacattcaagtgctacggcgtgagcccaacaa
[0299]
agctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgactctttcgtgatccggggc
[0300]
gacgaggtgaggcagatcgctccaggccagacaggcaagatcgccgactacaact
[0301]
acaagctccccgacgacttcacaggctgcgtgatcgcttggaactctaacaacctg
[0302]
gactctaaggtgggcggcaactacaactacctgtacagactgttccggaagtctaa
[0303]
cctgaagcctttcgagcgggacatctctaccgagatctaccaggccggcagcaccc
[0304]
cttgcaacggcgtggagggcttcaactgctacttcccactgcagtcttacggcttc
[0305]
cagcctacaaacggcgtgggctaccagccataccgggtggtggtgctgtccttcga
[0306]
gctcctccacgcccccgctacagtgtgcggcccaaagaagtccacaaacctcgtga
[0307]
agaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgacaggcacaggcgtgctcac
[0308]
agagtctaacaagaagttcctccctttccagcagttcggccgggacatcgccgaca
[0309]
ccaccgacgccgtgagggaccctcagacactcgagatcctcgacatcaccccttgc
[0310]
tctttcggcggcgtgtctgtgatcacccccggcacaaacacatctaaccaggtggc
[0311]
tgtgctgtaccaggacgtgaactgcaccgaggtgccagtggctatccacgccgacc
[0312]
agctcacccctacatggagggtgtacagcacaggctctaacgtgttccagacgagg
[0313]
gccggctgcctcatcggcgccgagcacgtgaacaactcttacgagtgcgacatccc
[0314]
aatcggcgctggcatctgcgcttcttaccagacccagacaaacagccctaggagag
[0315]
ctaggtccgtggctagccagtccatcatcgcttacaccatgtctctgggcgctgaga
[0316]
actctgtggcttactctaacaactctatcgctatccctacaaacttcacaatctctgt
[0317]
gaccaccgagatcctgccagtgtctatgacaaagacatccgtggactgcaccatgt
[0318]
acatctgcggcgacagcaccgagtgcagcaacctgctcctgcagtacggctctttc
[0319]
tgcacacagctgaaccgggccctcaccggcatcgccgtggagcaggacaagaaca
[0320]
cccaggaggtgttcgctcaggtgaagcagatctacaagaccccccctatcaaggac
[0321]
ttcggcggcttcaacttctctcagatcctccccgaccctagcaagcctagcaagcg
[0322]
gtctttcatcgaggacctcctgttcaacaaggtgacactcgctgacgctggcttcat
[0323]
caagcagtacggcgactgcctgggcgacatcgccgctagagacctgatctgcgctc
[0324]
agaagttcaacggcctcacagtgctgcccccactcctgaccgacgagatgatcgct
[0325]
cagtacaccagcgccctcctcgctggcacaatcacatctggctggacattcggcgc
[0326]
cggcgccgccctgcagatcccattcgccatgcagatggcttaccggttcaacggcat
[0327]
cggcgtgacccagaacgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgctaaccagttc
[0328]
aactccgctatcggcaagatccaggactccctgtctagcaccgctagcgccctggg
[0329]
caagctccaggacgtggtgaaccagaacgcccaggccctgaacacactggtgaag
[0330]
cagctgtcttctaacttcggcgctatcagctctgtgctcaacgacatcctgtctaga
[0331]
ctcgacaaggtggaggccgaggtgcagatcgacagactgatcacaggcagactgc
[0332]
agtccctccagacatacgtgacccagcagctcatccgggccgctgagatcagagct
[0333]
agcgctaacctcgccgctaccaagatgagcgagtgcgtgctgggccagtctaagcg
[0334]
ggtggacttctgcggcaagggctaccacctcatgtctttccctcagtccgcccctca
[0335]
cggcgtggtgttcctccacgtgacatacgtgccagctcaggagaagaacttcacca
[0336]
ccgccccagctatctgccacgacggcaaggcccacttcccacgggagggcgtgttc
[0337]
gtgtctaacggcacccactggttcgtgacacagcggaacttctacgagcctcagat
[0338]
catcaccacagacaacacattcgtgtccggcaactgcgacgtggtgatcggcatcg
[0339]
tgaacaacacagtgtacgacccactgcagcccgagctcgactctttcaaggagga
[0340]
gctcgacaagtacttcaagaaccacaccagccccgacgtggacctgggcgacatct
[0341]
ctggcatcaacgcctctgtggtgaacatccagaaggagatcgacagactgaacga
[0342]
ggtggctaagaacctgaacgagtccctgatcgacctgcaggagctgggcaagtac
[0343]
gagcagtacatcaagtggccttggtacatctggctgggcttcatcgctggcctgatc
[0344]
gctatcgtgatggtgacaatcatgctgtgctgcatgacctcttgctgctcttgcctg
[0345]
aagggctgctgctcttgcggctcttgctgcaagttcgacgaggacgactccgagcc
[0346]
cgtgctgaagggcgtgaagctccactacacatgataaggatcctcgcaatccctag
[0347]
gaggattaggcaagggcttgagctcacgctcttgtgagggacagaaatacaatcag
[0348]
gggcagtatatgaatactccatggagaaacccagatctacgtatgatcagcctcgac
[0349]
tgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgacc
[0350]
ctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcat
[0351]
tgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaaggg
[0352]
ggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggctt
[0353]
ctgaggcggaaagaaccagctggggctcgacagctcgagctaggaccgctatcag
[0354]
gacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctga
[0355]
ccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctat
[0356]
cgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaa
[0357]
gcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaagg
[0358]
ttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcgggga
[0359]
tctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttac
[0360]
aaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattcta
[0361]
gttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcgcggccgcgat
[0362]
ccgtcgagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatcc
[0363]
gctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtg
[0364]
cctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagt
[0365]
cgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagagg
[0366]
cggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggt
[0367]
cgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatcca
[0368]
cagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaagg
[0369]
ccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccct
[0370]
gacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac
[0371]
tataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccga
[0372]
ccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgcttt
[0373]
ctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgg
[0374]
gctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatc
[0375]
gtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggt
[0376]
aacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtg
[0377]
gcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagcc
[0378]
agttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctg
[0379]
gtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatct
[0380]
caagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactc
[0381]
acgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcctttta
[0382]
aattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgaca
[0383]
gtctagcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcag
[0384]
gattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcac
[0385]
cgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtc
[0386]
caacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgaga
[0387]
aatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctt
[0388]
tccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaa
[0389]
ccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgt
[0390]
taaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccag
[0391]
cgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgtt
[0392]
ttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgc
[0393]
ttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
[0394]
gtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcg
[0395]
ggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagccc
[0396]
atttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaaga
[0397]
cgtttcccgttgaatatggctcatgctagaactcttcctttttcaatattattgaagca
[0398]
tttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataa
[0399]
acaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac
[0400]
参考文献
[0401]
1.who.2020.https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019.
[0402]
2.abrams em,szefler sj.2020.covid-19and the impact of social determinants of health.lancet respir med 8:659-61
[0403]
3.wiersinga wj,rhodes a,cheng ac,peacock sj,prescott hc.2020.pathophysiology,transmission,diagnosis,and treatment of coronavirus disease 2019(covid-19):a review.jama 324:782-93
[0404]
4.chu dk,akl ea,duda s,solo k,yaacoub s,schunemann hj,authors c-surges.2020.physical distancing,face masks,and eye protection to prevent person-to-person transmission of sars-cov-2and covid-19:a systematic review and meta-analysis.lancet395:1973-87
[0405]
5.bong cl,brasher c,chikumba e,mcdougall r,mellin-olsen j,enright a.2020.the covid-19pandemic:effects on low-and middle-income countries.anesth analg 131:86-92
[0406]
6.zar hj,dawa j,fischer gb,castro-rodriguez ja.2020.challenges of covid-19in children in low-and middle-income countries.paediatr respir rev 35:70-4
[0407]
7.chauhan s.2020.comprehensive review of coronavirus disease 2019(covid-19).biomed j
[0408]
8.yang j,niu p,chen l,wang l,zhao l,huang b,ma j,hu s,wu l,wu g,huang c,bi y,tan w.2020.genetic tracing of hcov-19for the re-emerging outbreak of covid-19in beijing,china.protein cell
[0409]
9.kaur sp,gupta v.2020.covid-19 vaccine:a comprehensive status report.virus res288:198114
[0410]
10.lu s.2020.timely development of vaccines against sars-cov-2.emerg microbes infect 9:542-4
[0411]
11.bloom br,nowak gj,orenstein w.2020."when will we have a vaccine？"-understanding questions and answers about covid-19 vaccination.n engl j med
[0412]
12.heaton pm.2020.the covid-19 vaccine-development multiverse.n engl j med
[0413]
13.who.2020.https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines.
[0414]
14.zhu fc,guan xh,li yh,huang jy,jiang t,hou lh,li jx,yang bf,wang l,wang wj,wu sp,wang z,wu xh,xu jj,zhang z,jia sy,wang bs,hu y,liu jj,zhang j,qian xa,li q,pan hx,jiang hd,deng p,gou jb,wang xw,wang xh,chen w.2020.immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored covid-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older:a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 2trial.lancet 396:479-88
[0415]
15.zhu fc,li yh,guan xh,hou lh,wang wj,li jx,wu sp,wang bs,wang z,wang l,jia sy,jiang hd,wang l,jiang t,hu y,gou jb,xu sb,xu jj,wang xw,wang w,chen w.2020.safety,tolerability,and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5vectored covid-19 vaccine:a dose-escalation,open-label,non-randomised,first-in-human trial.lancet 395:1845-54
369:77-81
[0428]
28.shi y,wang n,zou qm.2020.[progress and challenge of vaccine developmentagainst 2019-novel coronavirus(2019-ncov)].zhonghua yu fang yi xue za zhi 54:614-9
[0429]
29.kapikian az,mitchell rh,chanock rm,shvedoff ra,stewart ce.1969.anepidemiologic study of altered clinical reactivity to respiratory syncytial(rs)virus infection inchildren previously vaccinated with an inactivated rs virus vaccine.am j epidemiol 89:405-21
[0430]
30.kim hw,canchola jg,brandt cd,pyles g,chanock rm,jensen k,parrottrh.1969.respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration ofantigenic inactivated vaccine.am j epidemiol 89:422-34
[0431]
31.tillett rl,sevinsky jr,hartley pd,kerwin h,crawford n,gorzalski a,laverdure c,verma sc,rossetto cc,jackson d,farrell mj,van hooser s,pandori m.2020.genomic evidence for reinfection with sars-cov-2:a case study.lancet infect dis
[0432]
32.muecksch f,wise h,batchelor b,squires m,semple e,richardson c,mcguire j,clearly s,furrie e,greig n,hay g,templeton k,lorenzi jcc,hatziioannou t,jenks s,bieniasz pd.2020.longitudinal analysis of serology and neutralizing antibody levelsin covid19 convalescents.j infect dis
[0433]
33.chan pks,lui g,hachim a,ko rlw,boon ss,li t,kavian n,luk f,chenz,yau em,chan kh,tsang ch,cheng sms,chu dkw,perera r,ho wcs,yeung acm,chow c,poon llm,valkenburg sa,hui dsc,peiris m.2020.serologic responses inhealthy adult with sars-cov-2 reinfection,hong kong,august 2020.emerg infect dis 26
[0434]
34.wang s,kennedy js,west k,montefiori dc,coley s,lawrence j,shen s,green s,rothman al,ennis fa,arthos j,pal r,markham p,lu s.2008.cross-subtypeantibody and cellular immune responses induced by a polyvalent dna prime-protein boosthiv-1 vaccine in healthy human volunteers.vaccine 26:3947-57
[0435]
35.almansour i,chen h,wang s,lu s.2013.cross reactivity of serum antibodyresponses elicited by dna vaccines expressing ha antigens from h1n1 subtype influenzavaccines in the past 30 years.hum vaccin immunother 9:2049-59
[0436]
36.vaine m,wang s,hackett a,arthos j,lu s.2010.antibody responses elicitedthrough homologous or heterologous prime-boost dna and protein vaccinations differ infunctional activity and avidity.vaccine 28:2999-3007
[0437]
37.wang s,arthos j,lawrence jm,van ryk d,mboudjeka i,shen s,chou th,montefiori dc,lu s.2005.enhanced immunogenicity of gp120 protein when combined withrecombinant dna priming to generate antibodies that neutralize the jr-fl primary isolate ofhuman immunodeficiency virus type 1.j virol 79:
7933-7
[0438]
38.tavel ja,martin je,kelly gg,enama me,shen jm,gomez pl,andrews ca,koup ra,bailer rt,stein ja,roederer m,nabel gj,graham bs.2007.safety andimmunogenicity of a gag-pol candidate hiv-1 dna vaccine administered by a needle-freedevice in hiv-1-seronegative subjects.j acquir immune defic syndr 44:601-5
[0439]
39.jacobson jm,zheng l,wilson cc,tebas p,matining rm,egan ma,eldridgej,landay al,clifford db,luetkemeyer af,tiu j,martinez al,janik j,spitz ta,hural j,mcelrath j,frahm n,team aap.2016.the safety and immunogenicity of an interleukin-12-enhanced multiantigen dna vaccine delivered by electroporation for the treatment of hiv-1infection.j acquir immune defic syndr 71:163-71
[0440]
40.kalams sa,parker s,jin x,elizaga m,metch b,wang m,hural j,lubeck m,eldridge j,cardinali m,blattner wa,sobieszczyk m,suriyanon v,kalichman a,weiner db,baden lr,network nhvt.2012.safety and immunogenicity of an hiv-1 gag dna vaccine with or without il-12 and/or il-15 plasmid cytokine adjuvant in healthy,hiv-1 uninfected adults.plos one 7:e29231
[0441]
41.lu s.2009.heterologous prime-boost vaccination.curr opin immunol 21:346-51
[0442]
42.wang s,parker c,taaffe j,solorzano a,garcia-sastre a,lu s.2008.heterologous ha dna vaccine prime
‑‑
inactivated influenza vaccine boost is more effective than using dna or inactivated vaccine alone in eliciting antibody responses against h1 or h3serotype influenza viruses.vaccine 26:3626-33
[0443]
43.ledgerwood je,wei cj,hu z,gordon ij,enama me,hendel cs,mctamney pm,pearce mb,yassine hm,boyington jc,bailer r,tumpey tm,koup ra,mascola jr,nabel gj,graham bs,team vrcs.2011.dna priming and influenza vaccine immunogenicity:two phase 1 open label randomised clinical trials.lancet infect dis 11:916-24
[0444]
44.ledgerwood je,hu z,costner p,yamshchikov g,enama me,plummer s,hendel cs,holman l,larkin b,gordon i,bailer rt,poretz dm,sarwar u,kabadi a,koup r,mascola jr,graham bs,vrc,teams vrcs.2015.phase i clinical evaluation of seasonal influenza hemagglutinin(ha)dna vaccine prime followed by trivalent influenza inactivated vaccine(iiv3)boost.contemp clin trials 44:112-8
[0445]
45.wang s,chou th,sakhatskyy pv,huang s,lawrence jm,cao h,huang x,lu s.2005.identification of two neutralizing regions on the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein produced from the mammalian expression system.j virol 79:1906-10
immunol 162:4163-70
[0456]
56.donnelly jj,friedman a,martinez d,montgomery dl,shiver jw,motzel sl,ulmer jb,liu ma.1995.preclinical efficacy of a prototype dna vaccine:enhancedprotection against antigenic drift in influenza virus.nat med 1:583-7
[0457]
57.yu j,tostanoski lh,peter l,mercado nb,mcmahan k,mahrokhian sh,nkolola jp,liu j,li z,chandrashekar a,martinez dr,loos c,atyeo c,fischinger s,burkejs,slein md,chen y,zuiani a,lelis fjn,travers m,habibi s,pessaint l,van ry a,bladek,brown r,cook a,finneyfrock b,dodson a,teow e,velasco j,zahn r,wegmann f,bondzie ea,dagotto g,gebre ms,he x,jacob-dolan c,kirilova m,kordana n,lin z,maxfield lf,nampanya f,nityanandam r,ventura jd,wan h,cai y,chen b,schmidt ag,wesemann dr,baric rs,alter g,andersen h,lewis mg,barouch dh.2020.dna vaccineprotection against sars-cov-2 in rhesus macaques.science 369:806-11
[0458]
58.suschak jj,wang s,fitzgerald ka,lu s.2016.a cgas-independentsting/irf7 pathway mediates the immunogenicity of dna vaccines.j immunol 196:310-6
[0459]
59.suschak jj,wang s,fitzgerald ka,lu s.2015.identification of aim2 as asensor for dna vaccines.j immunol 194:630-6
[0460]
60.wu h,chen y,liu h,xu ll,teuscher p,wang s,lu s,dent al.2016.follicular regulatory t cells repress cytokine production by follicular helper t cells andoptimize igg responses in mice.eur j immunol 46:1152-61
[0461]
61.hollister k,chen y,wang s,wu h,mondal a,clegg n,lu s,dent a.2014.the role of follicular helper t cells and the germinal center in hiv-1 gp120 dna prime andgp120 protein boost vaccination.hum vaccin immunother 10:1985-92
[0462]
62.ulmer jb,wahren b,liu ma.2006.gene-based vaccines:recent technical andclinical advances.trends mol med 12:216-22
[0463]
63.lu s.2011.two is better than one.lancet infect dis 11:889-91

技术特征：
1.用于在受试者中抗sars-cov-2病毒感染的dna疫苗，所述dna疫苗包含编码sars-cov-2病毒的多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以在所述受试者中表达。2.根据权利要求1所述的dna疫苗，其中所述多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含所述sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。3.根据权利要求1或权利要求2所述的dna疫苗，其中所述多肽包含所述刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。4.根据权利要求1-3中任一项所述的dna疫苗，其中所述受试者是人类。5.根据权利要求1-4中任一项所述的dna疫苗，其中所述dna疫苗是从质粒psw3891构建的质粒。6.根据权利要求1-5中任一项所述的dna疫苗，其中所述多核苷酸序列包含seq id no:3或4的序列。7.预防或治疗受试者的sars-cov-2病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的dna疫苗，其中所述dna疫苗包含编码sars-cov-2病毒的多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸序列经密码子优化以在所述受试者中表达。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含所述sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述多肽包含所述刺突蛋白的rbd。10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述dna疫苗是从质粒psw3891构建的质粒。12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸序列包含seq id no:3或4的序列。13.用于在受试者中抗sars-cov-2病毒感染的疫苗组合，所述疫苗组合包括：1)dna疫苗，其包含编码所述sars-cov-2病毒的多肽的多核苷酸序列；和2)抗原肽疫苗，其中所述抗原肽是所述sars-cov-2病毒的抗原肽。14.根据权利要求13所述的疫苗组合，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以在所述受试者中表达。15.根据权利要求13或14的疫苗组合，其中所述多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含所述sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。16.根据权利要求13-15中任一项所述的疫苗组合，其中所述多肽包含所述刺突蛋白的rbd。17.根据权利要求13-16中任一项所述的疫苗组合，其中所述受试者是人类。18.根据权利要求13-17中任一项所述的疫苗组合，其中所述dna疫苗是从质粒psw3891构建的质粒。19.根据权利要求13-18中任一项所述的疫苗组合，其中所述多核苷酸序列包含seq id no:3或4的序列。20.根据权利要求13-19中任一项所述的疫苗组合，其中所述抗原肽至少包含所述sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的疫苗组合，其中所述抗原肽包含所述刺突蛋白的rbd。22.根据权利要求13-21中任一项所述的疫苗组合，其中所述抗原肽是所述刺突蛋白的s1亚基。23.根据权利要求13-22中任一项所述的疫苗组合，其中所述抗原肽包含seq id no:7的氨基酸序列或与seq id no:7具有80％或更高序列同一性的功能变体。24.根据权利要求13-23中任一项所述的疫苗组合，其中所述dna疫苗和所述抗原肽疫苗与药学上可接受的溶媒共同配制于疫苗制剂中或各自配制成单独的疫苗制剂。25.根据权利要求13-24中任一项所述的疫苗组合，其中所述dna疫苗和所述抗原肽疫苗被配制成适合通过肌内注射共同递送的疫苗制剂。26.预防或治疗受试者的sars-cov-2病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的dna疫苗和有效量的抗原肽疫苗，其中所述dna疫苗包含编码sars-cov-2病毒多肽的多核苷酸序列；并且其中所述抗原肽是所述sars-cov-2病毒的抗原肽。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以在所述受试者中表达。28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述多肽是sars-cov-2刺突蛋白或至少包含所述sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述多肽包含所述刺突蛋白的rbd。30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。31.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述dna疫苗是从质粒psw3891构建的质粒。32.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸序列包含如seq id no:3或4中所示的序列。33.根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述抗原肽至少包含所述sars-cov-2刺突蛋白的保守部分。34.根据权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述抗原肽包含所述刺突蛋白的rbd。35.根据权利要求26-34中任一项所述的方法，其中所述抗原肽是所述刺突蛋白的s1亚基。36.根据权利要求26-35中任一项所述的方法，其中所述抗原肽包含seq id no:7的氨基酸序列。37.根据权利要求26-36中任一项所述的方法，其中所述dna疫苗和所述抗原肽疫苗与药学上可接受的溶媒共同配制于疫苗制剂中或各自配制成单独的疫苗制剂。38.根据权利要求26-37中任一项所述的方法，其中向所述dna疫苗和所述抗原肽疫苗被共同施用给所述受试者。39.根据权利要求26-38中任一项所述的方法，其中所述dna疫苗和所述抗原肽疫苗被共同施用给所述受试者至少3次。40.根据权利要求26-39中任一项所述的方法，其中所述dna疫苗和所述抗原肽疫苗通过肌内注射施用。
41.疫苗试剂盒，所述疫苗试剂盒包含容器、所述容器内的权利要求1-6中任一项所述的dna疫苗或权利要求13-25中任一项所述的疫苗组合，以及在所述容器上或与所述容器相关联的标签，所述标签指示所述dna疫苗或所述疫苗组合用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染。42.权利要求1-6中任一项所述的dna疫苗或权利要求13-25中任一项所述的疫苗组合在制备用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染的药物中的用途。43.用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染的药物，所述药物包含权利要求1-6中任一项所述的dna疫苗或权利要求13-25中任一项所述的疫苗组合。

技术总结
提供了在受试者中抗SARS-CoV-2病毒感染的DNA疫苗，其包含编码SARS-CoV-2病毒的多肽的经密码子优化的多核苷酸序列。还提供了抗SARS-CoV-2病毒感染的疫苗组合，其包含所述DNA疫苗和抗原肽疫苗。在NHP研究中，该疫苗组合能够赋予抗SARS-CoV-2病毒感染的全面保护。2病毒感染的全面保护。2病毒感染的全面保护。


技术研发人员：寸韡 卢山 李琦涵 肖红剑 毕研伟 李育中 刘晓娟 李智华
受保护的技术使用者：卢山
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2023/8/24