一种用于猴痘病毒检测的探针组合物及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及一种用于猴痘病毒检测的探针组合物及试剂盒。


背景技术：

2.猴痘（monkeypox，mp）是由猴痘病毒（mon-keypox virus，mpv）引起的一种人兽共患传染病。猴痘病毒是一种基因组长达200kb左右的dna病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，外形为回角砖形或卵圆形，大小为200~400nm，外被脂蛋白膜或封套，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内含很大的双链dna基因组。猴痘病毒的基因组为双链dna，长约197kb，基因组末端包含一个相同但方向相反的末端反向重复序列。该病毒包含190个开放阅读框，其中4个位于末端反向重复序列中；同一属的病毒还包括天花病毒、牛痘病毒等。早在1958年，人们就发现一种痘病毒在实验猕猴中可引致一种类似于人天花的疾病，这种病被称为猴痘，该病毒也因此而得名猴痘病毒。
3.猴痘的临床表现类似于天花，但天花传染性更强，致死率 更高，死亡率约 30%。临床中猴痘需要与其他出疹性疾病相鉴别，如水痘、麻疹、细菌性皮肤感染、疥疮、梅毒和药疹等，主要根据流行病学接触史、发热与皮疹出现的时间间隔、皮疹形态、皮疹分布情况、以及病原学检查进行鉴别。猴痘在“非典型水痘”和不明原因皮疹患者中的发病率分别为7.3%和6.1%，猴痘可能由于皮损的区域性多形性和向心性分布而被误诊为水痘。疾病前驱期的淋巴结肿大可能是区分猴痘与水痘或天花的重要临床特征。
4.目前猴痘的传播途径尚未完全明确，可能主要通过直接接触受感染动物的血液、体液或皮肤或黏膜创口，发生动物对人（人畜共患）传播，食用未充分煮熟的受感染动物的肉类和其他制品也是一个可能的风险因素。二次传播或人际间传播可能是由于密切接触了感染者的呼吸道分泌物、损伤的皮肤粘膜或被污染的物品而造成。通过长时间面对面的接触可以导致经呼吸道飞沫传播，因此接触活动期患者的卫生工作者、家庭成员和其他密切接触者感染猴痘风险明显增加。人与人之间的传播是有限的，有记载的最长传播链为6代，这意味着在传播链中最后一个被感染的人与最初的患者相距6个环节，目前暂无证据提示猴痘会发生大面积的人际传播。在猴痘暴发期间，未接种疫苗的密切接触者中有 0%~11%可能成为临床病例，其中家庭接触者的继发率约为8%。
5.由于猴痘只能由实验室确诊，国际上尚无一种通用的、安全快速的对天花和猴痘病毒感染的血清4学诊断方法，而生物学鉴别诊断（病毒分离培养、电镜观察等）通常需3~6天，且存在生物安全危害隐患。由于血清学诊断与临床诊断的灵敏度不高，不易鉴别诊断天花、猴痘及其他出皮疹的疾病，所以采用分子诊断（pcr或荧光定量pcr）技术来进行病毒感染的快速特异诊断方法快速发展。而现有的分子诊断大多存在灵敏度不高等缺陷。因此，本领域需求一种灵敏度高的快速诊断猴痘病毒的产品，以便应对突发的猴痘疫情。
6.实时荧光pcr的优点在于对其整个pcr测定过程的实时监控，明确了指数扩增期，使得对起始模板的定量测定变得相对容易，而且测定范围大；测定敏感性高；测定准确度和重复性好；大大降低了实验室“污染”的可能性。
7.与传统pcr相比，实时荧光pcr也有一定的局限性：由于始终是“闭管”扩增及检测，无法检测扩增子大小；目前的实时荧光pcr仪都只有有限的荧光测定通道，使得多重实时pcr收到限制；特定的实时荧光pcr仪，可能只适用于特定的荧光染料；实时荧光pcr分析中，有时会得到非特异的扩增曲线，必须加以分析甄别，否则会因此而得到假阳性。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种基于多重荧光实时定量pcr技术对猴痘病毒进行快速高效检测的探针组合物及试剂盒。
9.本发明采用如下技术方案：
10.一种用于猴痘病毒检测的探针组合物，所述组合物包括猴痘探针组合物以及内参探针组合物；
11.所述猴痘探针组合物包括猴痘检测探针以及检测引物对，所述内参探针组合物包括内参探针以及内参引物对；
12.所述猴痘检测探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述检测引物对的核苷酸序列如seq id no.2~3所示；
13.所述内参探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述内参引物对的核苷酸序列如seq id no.5~6所示。
14.进一步的，所述猴痘检测探针的5
′
端标记有报告基团fam，3
′
端标记有荧光淬灭基团bhq1。
15.进一步的，所述内参探针的5
′
端标记有报告基团vic，3
′
端标记有荧光淬灭基团bhq1。
16.进一步的，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
17.一种上述用于猴痘病毒检测的探针组合物在制备检测猴痘病毒的试剂盒中的应用。
18.一种包含上述用于猴痘病毒检测的探针组合物的试剂盒。
19.进一步的，所述试剂盒还包括premix ex taq，引物探针，ddh2o双蒸水，阳性对照品。
20.更进一步的，试剂盒中，premix ex taq为10 ul，引物探针为2 ul，ddh2o双蒸水为4 ul，体积（反应体系mix）为16 ul。
21.一种用于以非诊断目的检测猴痘病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
22.1）提取或释放待测样本的核酸；
23.2）使用上述探针组合物或如权利要求6中所述的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行多重荧光实时定量pcr分析；
24.3）获得并分析结果。
25.本发明的有益效果在于：本发明采用多重荧光实时定量pcr法，通过设计pcr引物和探针，利用taqman探针法的高度特异性，对猴痘病毒进行检测，结果表明，本发明的最低检出限为195copies/ml，检出率为95%，极大地提高检测猴痘病毒的效率。
附图说明
26.图1为使用本发明所用探针和引物对猴痘的检测结果。
27.图2为本发明在猴痘病毒195copies/ml检测量中所完成的重复性实验结果。
28.图3为选用1a引物探针对猴痘阳性质控品的扩增结果。
29.图4为选用2a引物探针对猴痘阳性质控品的扩增结果。
30.图5为使用本发明所用探针和引物对猴痘同一批次的阳性质控品的扩增结果。
31.图6为使用本发明所用探针和引物对猴痘不同一批次的阳性质控品的扩增结果。
32.图7为使用本发明的引物和探针对添加干扰素的质控品的扩增结果。
33.图8为使用本发明的引物和探针对未含目标基因质控品进行扩增的结果。
具体实施方式
34.下面通过具体实施例对本发明进行详细的说明。但本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
35.1、样本采集
36.1.1皮肤病变标本：视病变情况进行相应病变标本采集，需后期进行病毒分离的样本，收集管不含样本保存液。
37.（1）病变皮疹、痘疱表面或渗出物的拭子：使用无菌聚酯或涤纶拭子用力涂抹病变部位，以确保收集足够的病毒dna，将拭子放置无菌收集管中。
38.（2）痘疱液：用酒精棉球对皮损处进行消毒，并自然干燥。用无菌针头和注射器吸取液体，放置于1.5ml至2ml的无菌带0型橡胶圈的螺旋盖塑料管。
39.（3）皮疹或痘疱表皮、皮疹内液体拭子采集：用酒精棉球对皮损处进行消毒，并自然干燥。用一次性手术刀（或无菌26号针头）打开并移除小泡或脓疱的顶部皮肤，将小泡顶部皮肤放置于1.5至2毫升的无菌带0型橡胶圈的螺旋盖塑料管中。用无菌聚酯或涤纶拭子擦拭皮损底部，将拭子放置于无菌收集管中。
40.（4）痘痂或硬皮：用酒精棉球对皮损处进行消毒，并自然干燥。用无菌26号针头或剪刀取至少4块痂皮，每块痂皮要来自不同的身体部位。将痂皮放置于1.5ml至2ml的无菌带0型橡胶圈的螺旋盖塑料管中。
41.注意：可以将两个相同类型的病变标本收集在一个管中，最好是从身体的不同部位收集的，且外观不同。不同类型病变（如痘疱液和痘痂）不能放在同一管中。尽量每种类型标本收集两份，检测时先对其中一份进行检测，仅在第一份结果不确定时再对第二份进行检测。
42.1.2 咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子放入无菌采样液管中，尾部弃去，旋紧管盖。
43.1.3血液标本：尽量采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3~4周采集。采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用含有edta抗凝剂的真空采血管采集血液标本5ml后，室温静置30分钟，1500~2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。
44.1.4血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5ml,室温静置30分钟，1500~2000rpm离心10分钟，收集血清于无菌螺口塑料管中。
45.2、样本保存
46.标本应在收集后一小时内冷藏（2℃至8℃）或冷冻（-20℃或更低），并尽快进行检测。能在一周以内检测的标本可置于4℃保存；
47.无法检测的标本，短期可在-20℃中保存，长期应置于-70℃以下保存（收集后》60天）。全血分离血浆前冷藏（2至8℃），然后-20℃或以下保存。应设立专库或专柜单独保存标本。标本应避免反复冻融。
48.3、试剂
49.一种猴痘病毒核酸检测试剂盒中的组分包括premix ex taq，引物探针，ddh2o双蒸水，阳性对照品，其中premix ex taq为10 ul，引物探针为2 ul，ddh2o双蒸水为4 ul，体积（反应体系mix）为16 ul。
50.4、仪器
51.slan-96p实时定量pcr（上海宏石医疗科技有限公司），g18型高速离心机（北京白洋医疗器械有限公司），大龙移液器。
52.5、阳性样本制备
53.限于我国尚无猴痘病毒的毒种，本发明中，利用生物信息学方法分析已公开发表的猴痘病毒基因组序列，人工合成了含特异检测猴痘病毒靶基因的f3l片段，并插入质粒，作为猴痘病毒检测的模拟阳性模板。
54.6、引物探针的合成
55.本发明选用具有高度保守性的f3l基因编码区，引物、探针、质粒、假病毒均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。参照国内外相关文献，对已知的猴痘病毒基因组序列进行了分析比对，设计了猴痘病毒特异的核酸扩增与人的内参基因（β-actin）混合的引物及荧光标记探针。
56.猴痘引物及探针：
57.f3l-p（seq id no.1）：fam-cgtgtatcagcatccattgtcgtaga-bhq1；
58.f3l-f（seq id no.2）：tcagcatcagaatctgta；
59.f3l-r（seq id no.3）：gctctgtatgatcttcaac 。
60.内参引物及探针：
61.probe（seq id no.4）：vic-aaggtgaacgtggatgaagttggtgg-bhq1；
62.fw（seq id no.5）：gtgcacctgactcctgaggaga；
63.rv（seq id no.6）：ccttgataccaacctgcccag 。
64.建立了可对猴痘病毒进行快速诊断与检测的荧光定量实时pcr方法。
65.7、实时荧光pcr检测
66.根据本实验引物、探针的具体特性，参考相关文献并结合本实验室摸索的结果，确定本实验的扩增程序为：20μl 反应体系，一种猴痘病毒核酸检测试剂盒中的组分包括premix ex taq、引物探针、ddh2o双蒸水、阳性对照品。其中premix ex taq为10 ul，引物探针为2 ul，ddh2o双蒸水为4 ul，体积（反应体系mix）为16 ul。扩增程序为：95℃，10min；95℃，10s，60℃，30s，45 循环。
67.7.1试剂准备（试剂准备区）
68.将试剂盒各组分置冰盒上融化，充分混匀后瞬间离心。计算试剂使用份数n（n=样
本数+1管阳性对照+1管阴性对照），根据上述配置反应体系mix，加入到适当体积离心管中，充分混匀后瞬间离心，按16ul分装至pcr反应管/板，并转移至标本处理区。
69.7.2样本处理（样本处理区）
70.7.2.1核酸提取
71.采用商品化的病毒dna提取试剂盒进行样本提取。
72.7.2.2加样
73.在已加入反应体系mix的pcr反应管/板上分别加入处理好的待测样本核酸、阴性对照、阳性对照4ul，终体积20ul。盖紧管盖，瞬间低速离心后，置荧光定量pcr仪扩增。
74.7.3扩增检测（核酸扩增区）
75.根据表1进行核酸扩增程序设定。
76.表1核酸扩增程序
[0077][0078]
7.4结果与分析
[0079]
选用猴痘阳性质控品将其稀释至最低检出限（图1），对样品进行重复检测20次（图2），根据检测结果可知，猴痘的最低检出限为195copies/ml，检出率为95%。
[0080]
选用1a引物探针（即本发明的猴痘引物及探针）和2a引物探针对猴痘阳性质控品进行扩增，结果如图3和图4，扩增效果相似，在ct=27时出现起峰。说明本发明的引物探针实测效果合格。
[0081]
上述2a引物探针的引物探针序列如下：
[0082]
f3l-p-2：fam-tccgtcaatgtctacacaggcataa-bhq1；
[0083]
f3l-f-2：tctgccttatcgaatactc；
[0084]
f3l-r-2：cctgtcaccgttattaatg。
[0085]
对猴痘同一批次的阳性质控品进行扩增，结果如图5，在ct=34时出现起峰，说明本发明的引物探针在同一批次质控品具有明显检出效果。
[0086]
选取另一批次的猴痘阳性质控品进行扩增，结果如图6，能够在ct=34时起峰，说明本发明在不同批次间具有明显的检测效果。
[0087]
选取本发明的引物探针对添加干扰素的质控品进行扩增，结果如图7，只有目标曲线在ct=26处起峰，而内参基因未起。说明干扰素并未对本发明的引物探针有较大影响。
[0088]
选取本发明的引物探针对未含目标基因质控品进行扩增（图8），没有目的基因扩增出来，只有内参基因能够检测到，说明本发明的引物探针特异性较强，可精准检测猴痘基因。

技术特征：
1.一种用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述组合物包括猴痘探针组合物以及内参探针组合物；所述猴痘探针组合物包括猴痘检测探针以及检测引物对，所述内参探针组合物包括内参探针以及内参引物对；所述猴痘检测探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述检测引物对的核苷酸序列如seq id no.2~3所示；所述内参探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述内参引物对的核苷酸序列如seq id no.5~6所示。2.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述猴痘检测探针的5
′
端标记有报告基团fam，3
′
端标记有荧光淬灭基团bhq1。3.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述内参探针的5
′
端标记有报告基团vic，3
′
端标记有荧光淬灭基团bhq1。4.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。5.一种如权利要求1~4任一项所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物在制备检测猴痘病毒的试剂盒中的应用。6.一种包含如权利要求1~4任一项所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物的试剂盒。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其还包括premix ex taq、引物探针、ddh2o双蒸水以及阳性对照品。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述premix ex taq为10 ul，引物探针为2 ul，ddh2o双蒸水为4 ul。9.一种用于以非诊断目的检测猴痘病毒的方法，所述方法包括以下步骤：1）提取或释放待测样本的核酸；2）使用如权利要求1 ~ 4中任一项所述的探针组合物或如权利要求6中所述的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行多重荧光实时定量pcr分析；3）获得并分析结果。

技术总结
本发明公开了一种用于猴痘病毒检测的探针组合物，所述组合物包括猴痘探针组合物以及内参探针组合物；所述猴痘探针组合物包括猴痘检测探针以及检测引物对，所述内参探针组合物包括内参探针以及内参引物对；所述猴痘检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2~3所示；所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5~6所示。本发明同时公开了包含上述探针组合物的试剂盒。结果表明，本发明的最低检出限为195copies/ml，检出率为95%，极大地提高检测猴痘病毒的效率。痘病毒的效率。痘病毒的效率。


技术研发人员：陈江坡 胖铁良 黄仕艺 杜锦然 王冠楠 卢孟孟
受保护的技术使用者：廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/8/24