一种基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法

1.本发明属于电化学合成和dna合成技术领域，具体涉及一种基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法。


背景技术：

2.基于亚磷酰胺的化学合成法是目前dna合成的主流方式，发展至今，已有的化学法dna合成技术包括一代合成(柱式寡核苷酸化学合成法)和二代合成(喷墨打印法、光化学法和电化学法)。其中，电化学方法简单且易于小型化，有望用于集成式的dna存储系统。然而，上述合成方法都是在液相环境下进行，反应可能产生具有腐蚀性或毒性的有机液体、酸和氧化试剂等，这些会对环境或操作人员带来危害；且液体泄露可能导致用于数据存储的精密微电子设备腐蚀或短路；其次，液体操作需要额外的泵、阀门和管路等，这些部件会导致整个体系笨重无法与存储设备集成，同时由于扩散和对流，管路中不同试剂容易随时间发生混合串扰，这也导致了昂贵试剂无法回收，成本进一步增加。这些问题使得dna合成成为显着制约dna数据存储大规模实际应用的因素之一。
3.因此，有必要开发一种新的方法来取代基于液相的dna合成方法。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法。
5.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，包括下述步骤：
6.(1)制备含有不同反应物的凝胶：将凝胶分别吸附不同的反应试剂得到吸附有反应试剂的不同凝胶；
7.(2)步骤(1)得到的不同凝胶与电极反应：将吸附有反应试剂的不同凝胶分别与电极进行耦合反应、氧化反应和脱保护反应；同时分别将空白凝胶清洁电极；
8.(3)重复上述步骤(1)(2)，完成多步合成反应得到目标产物。
9.其中，步骤(1)中将单体、交联剂、光引发剂和溶剂反应制备得到凝胶，然后将凝胶分别吸附耦合试剂、氧化试剂和脱保护试剂得到不同凝胶；
10.作为优选，步骤(1)中所述单体包括n-异丙基丙烯酰胺或丙烯酰胺，交联剂包括n，n-亚甲基双丙烯酰胺或聚乙二醇二丙烯酸酯；所述凝胶单体的分子量优选为20％；
11.作为优选，步骤(1)中所述光引发剂包括2-羟基-2-甲基丙苯酮或2，2-二乙氧基苯乙酮；
12.作为优选，步骤(1)中所述溶剂包括水或二甲基亚砜中的一种或两种；
13.其中，步骤(1)中制备凝胶所用溶剂的混合比例是任意的。作为优选，所述单体n-异丙基丙烯酰胺和交联剂n，n-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为10∶1。
14.其中，步骤(1)中当溶剂为二甲基亚砜和水的混合溶液时，所述二甲基亚砜和水的
体积比为3∶1～1∶3。
15.其中，步骤(2)中所述包括玻片电极、丝网印刷电极或ito导电玻璃中的一种或几种；所述电极的形状包括圆形、正方形、长方形或者多边形；所述电极的直径或对角线长度为0.1～2毫米。
16.其中，作为优选，步骤(2)的耦合反应步骤包括：将吸附耦合试剂的凝胶置于电极表面，常温反应，同时设置空白凝胶只吸收乙腈擦拭电极表面；
17.作为优选，步骤(2)的氧化反应步骤包括：将吸附氧化试剂的凝胶置于电极表面，常温反应，空白凝胶擦拭电极表面；
18.作为优选，步骤(2)的脱保护反应步骤包括：吸附脱保护试剂的凝胶置于电极表面，施加电压，反应后，空白凝胶擦拭电极表面；微电极阵列表面进行选择性脱保护，选择需要进行下一步碱基合成的电极施加电压，反应，最后用空白凝胶擦拭。
19.其中，步骤(2)中，本发明的电化学反应中的电解液包含在阳极能够电解出氢离子的物质，包括对苯二酚、高氯酸四乙基胺；电解液包含在阴极能够将氢离子还原的物质，包括苯醌、蒽醌；电解液包含稳定的电解质，包括四乙基对甲苯磺酸胺、六氟磷酸四丁铵；电解液包含稳定溶剂，如乙腈、二氯甲烷、甲醇，及其三者的混合物。优选的，凝胶所浸泡的电解液包括对苯二酚、对苯醌、六氟磷酸四丁胺，溶剂为乙腈。
20.其中，步骤(3)中，用于清洁电极的空白凝胶所吸附的溶剂可以是不影响正常电化学反应的任何试剂。优选的，采用无水乙腈。
21.作为优选，本发明的电化学反应施加电压范围在1.2v-1.8v，优选的，采用1.4v。
22.进一步地，所述电化学合成的具体应用可以是dna、rna、多肽等由有限个单体构成的聚合物。
23.进一步地，步骤(2)中，凝胶在电极表面用于dna合成的步骤包括dna耦合、氧化、脱保护以及清洗；凝胶在电极表面的dna耦合时间为2分钟，凝胶在电极表面的dna氧化时间为40秒，凝胶在电极表面的dna脱保护时间为14秒。
24.其中，步骤(2)中，所述耦合试剂包括不同的亚磷酰胺单体(dmt-da(bz)亚磷酰胺单体、dmt-dg(ib)亚磷酰胺单体、dmt-dc(bz)亚磷酰胺单体、dmt-d亚磷酰胺单体)和活化剂5-乙硫基四氮唑。
25.其中，步骤(2)中，所述氧化试剂包括三氯过氧苯甲酸。
26.其中，步骤(2)中，所述脱保护试剂包括对苯二酚、对苯醌和六氟磷酸四丁胺。
27.其中，步骤(3)继续重复上述步骤(1)(2)，直到电极上所有碱基合成完成。
28.其中，作为优选，所述的碱基序列如seq id no：1所示。
29.本发明内容还包括所述的电化学合成方法得到的目标产物，所述的目标产物可以是是dna、rna、多肽等由有限个单体构成的聚合物。
30.进一步地，所述步骤(2)中，反应前对微电极阵列表面进行修饰：
31.(a)表面清洗：食人鱼溶液(体积比浓硫酸∶双氧水＝1∶1)中浸泡15min，超纯水冲洗，丙酮、乙醇、水中交替超声清洗；
32.(b)硅烷化：清洗好的电极与装有2ml二氯甲烷溶解的2％的1h，1h，2h，2h-全氟癸基三乙氧基硅烷的瓶置于同一封闭容器中，80℃加热2小时以上，冷却至室温；
33.(c)巯基己醇修饰：20mm 6-巯基1-己醇滴加至工作电极表面，室温孵育12h；
34.进一步地，所述步骤(2)中，在电极表面进行dna的合成：
35.(a)耦合反应：吸附耦合试剂(0.1m单体和0.5m活化剂5-乙硫基四氮唑)的凝胶置于电极表面，常温反应2min，空白凝胶(只吸收乙腈)擦拭电极表面；
36.(b)氧化反应：吸附氧化试剂(0.1m三氯过氧苯甲酸)的凝胶置于电极表面，常温反应40秒，空白凝胶(只吸收乙腈)擦拭电极表面；
37.(c)脱保护反应：吸附脱保护试剂(25mm对苯二酚、25mm对苯醌和25mm六氟磷酸四丁胺)的凝胶置于电极表面，施加1.4v的电场反应14秒，空白凝胶(只吸收乙腈)擦拭电极表面；
38.(d)重复上述(a)～(c)，直到电极上所有碱基合成。
39.本发明通过凝胶吸附不同合成步骤(dna耦合、氧化、脱保护、清洗)所用的试剂，试剂被约束在凝胶内部，通过不同凝胶与电极的依次接触完成电极上的dna合成，反应过程中不需要复杂的液体操控，并用凝胶擦拭电极替代液体冲洗，该方法简单高效，可以减少昂贵试剂的消耗，避免液体泄露对精密电子设备的腐蚀，简化液体操控所需的复杂管路及阀门等，降低dna合成成本，为dna合成技术的改进、dna数据存储领域和电化学合成领域的实际应用提供了新的思路。
40.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
41.(1)本发明提出一种基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，利用凝胶的固液性质，可以充分吸收反应溶剂处于饱和状态，同时保持一定的机械强度并允许各种反应物质扩散至反应界面，免去复杂的液体操控步骤；
42.(2)本发明的方法利用凝胶吸附残留在反应区域的试剂，免去液体清洗步骤；
43.(3)本发明的方法基于电化学完成合成反应，可以直接采用商品化试剂用于dna、rna、多肽的合成，适应面广。
附图说明
44.图1为本发明基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法示意图；
45.图2为本发明基于不同溶剂制备的凝胶的相对质量与时间的关系图；
46.图3为本发明所涉及的n-异丙基丙烯酰胺(nipam)凝胶实物图；
47.图4为本发明所涉及的微电极阵列结构示意图；
48.图5为在电极表面空白凝胶擦拭前后的拉曼光谱图；
49.图6为电极表面合成dna与互补荧光链杂交后的荧光图；
50.图7为电极表面合成dna电量与时间平方根的关系。
具体实施方式
51.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
52.如图1，本发明的一种基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，包括下述步骤：
53.(1)将反应凝胶移至电极表面；
54.具体的，将吸附有反应试剂的饱和状态凝胶转移至反应电极表面。
55.nipam凝胶经高温加热完全干燥，后浸泡至反应试剂中直至饱和状态。凝胶单体分
子量为20wt％。
56.(2)取步骤(1)所得饱和凝胶至电极表面，内部反应试剂逐步扩散至电极表面并与电极表面物质反应；
57.其中，合成反应步骤包括：耦合反应、氧化反应、脱保护反应，重复上述步骤，直到电极上所有碱基合成，反应步骤间用空白凝胶进行擦拭。
58.(3)将步骤(2)中每步反应后的凝胶及用于擦拭的空白凝胶移开电极表面。
59.具体的，将反应后的凝胶及擦拭后的空白凝胶移开电极表面。
60.实施例1凝胶制备条件的优化
61.优化凝胶所用溶剂比例的优化，步骤如下：
62.(1)设计五种不同的凝胶溶剂比例，即二甲基亚砜：去离子水的比例为0∶1、1∶3、1∶1、3∶1和1∶0。
63.具体的，包括以下五种：
64.称取0.6g单体n-异丙基丙烯酰胺、0.06g n，n-亚甲基双丙烯酰胺、3ml去离子水，常温下涡旋，至完全溶解，得到凝胶预聚溶液；
65.称取0.6g单体n-异丙基丙烯酰胺、0.06g n，n-亚甲基双丙烯酰胺、0.75ml二甲基亚砜和2.25ml去离子水，常温下涡旋，至完全溶解，得到凝胶预聚溶液；
66.称取0.6g单体n-异丙基丙烯酰胺、0.06g n，n-亚甲基双丙烯酰胺、1.5ml二甲基亚砜和1.5ml去离子水，常温下涡旋，至完全溶解，得到凝胶预聚溶液；
67.称取0.6g单体n-异丙基丙烯酰胺、0.06g n，n-亚甲基双丙烯酰胺、2.25ml二甲基亚砜和0.75ml去离子水，常温下涡旋，至完全溶解，得到凝胶预聚溶液；
68.称取0.6g单体n-异丙基丙烯酰胺、0.06g n，n-亚甲基双丙烯酰胺、3ml二甲基亚砜，常温下涡旋，至完全溶解，得到凝胶预聚溶液。
69.(2)将上述(1)得到的五种凝胶预聚溶液分别添加30微升2-羟基-2-甲基丙苯酮，紫外灯(5w)照射45秒得到相应凝胶，置于热台或烘箱至完全干燥，记质量为m0，并浸泡至无水乙腈中。
70.(3)每隔一分钟取出乙腈中的凝胶并记录质量为m
t
，连续记录十分钟以上。
71.(4)计算不同时间后凝胶的相对质量(m
t
/m0)，并做相对质量与时间的关系如图2所示，二甲基亚砜与去离子水的比例为3∶1时，凝胶吸收乙腈并溶胀的速度最快。
72.实施例2凝胶的制备
73.本发明所用凝胶的制备，步骤如下：
74.(1)称取0.6g单体n-异丙基丙烯酰胺、0.06g n，n-亚甲基双丙烯酰胺、0.75ml去离子水、2.25ml二甲基亚砜，常温下涡旋，至完全溶解，得到凝胶预聚溶液。
75.(2)取30微升2-羟基-2-甲基丙苯酮至上述步骤(1)所得溶液中，常温下涡旋，至完全溶解。
76.(3)用移液枪取上述步骤(2)所得溶液，加至两块玻璃板中间，两块玻璃板之间的厚度为1.2mm，紫外灯(5w)照射45秒，得到n-异丙基丙烯酰胺凝胶，如图3所示。将凝胶浸泡在去离子水中，浸泡一夜。
77.(4)取上述步骤(3)所得凝胶至玻片表面，至热台或烘箱加热，加热温度为80℃，加热时间30分钟以上，得到完全干燥的凝胶。
78.实施例3制备微电极阵列以及微电极阵列表面进行修饰
79.1、制备微电极阵列的步骤如下：
80.(1)设计微电极阵列图案，并委托公司加工掩膜。圆形电极直径为1毫米，间距1毫米，方形触角边长为1毫米，间距1.27毫米。设计的微电极阵列图案如图4。
81.(2)光刻步骤：按顺序进行玻片清洗、匀胶、前烘、曝光、显影。
82.(3)蒸镀步骤：将上述步骤(2)得到的玻片置于蒸镀腔室内，按顺序进行抽真空、预热靶材、蒸镀粘合层金属钛、冷却靶材、预热靶材、蒸镀电极层金属金。
83.(4)将上述步骤(3)中得到的玻片浸泡至剥离液中，室温孵育4小时以上，乙醇和水充分冲洗，烘箱60℃干燥两小时。
84.2、反应前对微电极阵列表面进行修饰：
85.(a)表面清洗：食人鱼溶液(体积比浓硫酸∶双氧水＝1∶1)中浸泡15min，超纯水冲洗，丙酮、乙醇、水中交替超声清洗；
86.(b)硅烷化：清洗好的电极与装有2ml二氯甲烷溶解的2％的1h，1h，2h，2h-全氟癸基三乙氧基硅烷的瓶置于同一封闭容器中，80℃加热2小时以上，冷却至室温；
87.(c)巯基己醇修饰：20mm 6-巯基1-己醇滴加至工作电极表面，室温孵育12h。实施例4空白凝胶擦拭电极的效果表征
88.(1)裸金电极表面作为对照组，测试其表面拉曼光谱。激发光波长632nm，激光功率5mw，积分时间10秒。
89.(2)实施例2制备的完全干燥的凝胶浸泡至乙腈溶解的cy3修饰的亚磷酰胺单体(河北迪纳兴科生物科技有限公司-20220310)中，饱和状态后取出，置于电极表面，移开后测试其表面拉曼光谱，参数同步骤(1)。
90.(3)将空白凝胶移至反应区，按照一个方向从左至右擦拭电极，时间为10秒。擦拭后测试其表面拉曼光谱，参数同步骤(1)。最终的空白凝胶擦拭电极前后的拉曼光谱图如图5所示。
91.实施例5基于不同凝胶的电化学dna合成
92.不同凝胶吸附dna合成所用的不同反应试剂，直至饱和状态，依次进行：
93.(1)耦合反应：吸附耦合试剂(0.1m单体(单体包括：dmt-da(bz)亚磷酰胺单体、dmt-dg(ib)亚磷酰胺单体、dmt-dc(bz)亚磷酰胺单体、dmt-d亚磷酰胺单体，浓度均为0.1m)和0.5m活化剂5-乙硫基四氮唑)的凝胶置于电极表面，常温反应2分钟，空白凝胶(只吸收乙腈)擦拭电极表面；
94.(2)氧化反应：吸附氧化试剂(0.1m三氯过氧苯甲酸)的凝胶置于电极表面，常温反应40秒，空白凝胶擦拭电极表面；
95.(3)脱保护反应：吸附脱保护试剂(25mm对苯二酚、25mm对苯醌和25mm六氟磷酸四丁胺)的凝胶置于电极表面，施加1.4v的电压，反应14秒后，空白凝胶擦拭电极表面；微电极阵列表面可以进行选择性脱保护，选择需要进行下一步碱基合成的电极施加1.4v电压，反应时间14秒，最后用空白凝胶擦拭；
96.(4)重复上述(1)～(3)，直到电极上所有碱基合成(5
’‑
ttgtctgtatgtttttt-3’)；
97.(5)将电极浸泡至体积比为1∶1的乙二胺和乙醇的混合溶液，常温两小时脱去侧链保护基团后，与25μm互补荧光单链(5
’‑
acatacagacaa-cy3-3’)杂交，避光反应1h，用荧光显
微镜观察，结果如图6所示，完成dna合成实验的电极(a)与荧光链杂交并出现明显的荧光，对照组(b)为空白电极(即不做dna合成实验)，与实验组区分明显。
98.实施例6合成在电极表面的dna表征
99.合成在电极表面的dna表征步骤如下：
100.(1)称量0.012g三氯化六氨合钌，用10mm tris-hcl(ph 8.3)溶解至终浓度为20mm、体积为2ml的三氯化六氨合钌溶液，并进一步稀释至50μm。
101.(2)将tris-hcl缓冲液(10mm、ph 8.3)和步骤(1)得到的50μm三氯化六氨合钌溶液分别鼓吹氮气10分钟。
102.(3)将上述步骤(2)所得除氧后的tris-hcl缓冲液和50μm三氯化六氨合钌溶液先后取50μl滴加至电极表面(已合成polyt-12)，用计时库伦法进行测量，起始电压为0.2v，终止电压为-0.5v，阶跃次数为2次，脉冲持续时间为0.25s，测量灵敏度为1
×
10-5
a/v。
103.(4)将上述步骤(3)所得的测量结果作出电荷量对时间的平方根的曲线，作曲线的拟合直线并得到截距差值，即电量差值，如图7所示，合成dna的电极表面(a)有明显的电量差值，差值约30纳库伦，在裸金电极表面(b)，没有任何电量差值。

技术特征：
1.一种基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)制备含有不同反应物的凝胶：将凝胶分别吸附不同的反应试剂得到吸附有反应试剂的不同凝胶；(2)将步骤(1)得到的不同凝胶与电极反应：将吸附有反应试剂的不同凝胶分别与电极进行耦合反应、氧化反应和脱保护反应；同时分别将空白凝胶清洁电极；(3)重复上述步骤(1)(2)，完成多步合成反应得到目标产物。2.根据权利要求1所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，步骤(1)中将单体、交联剂、光引发剂和溶剂反应制备得到凝胶，然后将凝胶分别吸附耦合试剂、氧化试剂和脱保护试剂得到不同凝胶，作为优选，所述单体包括n-异丙基丙烯酰胺或丙烯酰胺，交联剂包括n，n-亚甲基双丙烯酰胺或聚乙二醇二丙烯酸酯，作为优选，所述光引发剂包括2-羟基-2-甲基丙苯酮或2，2-二乙氧基苯乙酮，作为优选，所述溶剂包括水或二甲基亚砜中的一种或两种；作为优选，所述单体n-异丙基丙烯酰胺和交联剂n，n-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为10∶1～5∶1。3.根据权利要求1所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，步骤(1)中当溶剂为二甲基亚砜和水的混合溶液时，所述二甲基亚砜和水的体积比为3∶1～1∶3。4.根据权利要求1所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，步骤(2)中所述包括玻片电极、丝网印刷电极或ito导电玻璃中的一种或几种；所述电极的形状包括圆形、正方形、长方形或者多边形；所述电极的直径或对角线长度为0.1～2毫米。5.根据权利要求1所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，作为优选，步骤(2)的耦合反应步骤包括：将吸附耦合试剂的凝胶置于电极表面，常温反应，同时设置空白凝胶只吸收乙腈擦拭电极表面；作为优选，氧化反应步骤包括：将吸附氧化试剂的凝胶置于电极表面，常温反应，空白凝胶擦拭电极表面；作为优选，脱保护反应步骤包括：吸附脱保护试剂的凝胶置于电极表面，施加电压，反应后，空白凝胶擦拭电极表面；微电极阵列表面进行选择性脱保护，选择需要进行下一步碱基合成的电极施加电压，反应，最后用空白凝胶擦拭。6.根据权利要求5所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，所述耦合试剂包括dmt-da(bz)亚磷酰胺单体、dmt-dg(ib)亚磷酰胺单体、dmt-dc(bz)亚磷酰胺单体、dmt-d亚磷酰胺单体和活化剂5-乙硫基四氮唑。7.根据权利要求5所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，所述氧化试剂包括三氯过氧苯甲酸。8.根据权利要求5所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，所述脱保护试剂包括对苯二酚、对苯醌和六氟磷酸四丁胺。9.根据权利要求5所述的基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，其特征在于，重复上述步骤(1)(2)，直到电极上序列如seq id no：1所示的所有碱基合成完成。10.权利要求1～9所述的电化学合成方法得到的目标产物。

技术总结
本发明公开了基于可移动凝胶的目标产物的电化学合成方法，包括下述步骤：制备含有不同反应物的凝胶；不同的凝胶与电极反应；同时分别将空白凝胶清洁电极；重复上述步骤，完成多步合成反应得到目标产物。本发明通过凝胶吸附不同合成步骤所用的试剂，试剂被约束在凝胶内部，通过不同凝胶与电极的依次接触完成电极上的DNA合成，反应过程中不需要复杂的液体操控，并用凝胶擦拭电极替代液体冲洗，该方法简单高效，可以减少昂贵试剂的消耗，避免液体泄露对精密电子设备的腐蚀，简化液体操控所需的复杂管路及阀门等，降低DNA合成成本，为DNA合成技术的改进、DNA数据存储领域和电化学合成领域的实际应用提供了新的思路。领域的实际应用提供了新的思路。领域的实际应用提供了新的思路。


技术研发人员：刘宏 冯德志 赵超
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/8/24