一种一氧化氮检测试剂和检测方法及其应用与流程

1.本发明涉及一氧化氮的检测试剂及其应用。


背景技术：

2.一氧化氮(no)是一种广泛存在于生物体内的信使分子和效应分子，也是一种活性氮(active nitrogen species，ans)。已经知道，一氧化氮在生理学、病理学和药理学等方面具有重要作用。近年来，国外一些研究表明，一氧化氮自由基在衰老记忆损伤作用中发挥重要作用。另一些学者在对阿尔茨海默病患者的脑皮层进行研究中发现，一氧化氮自由基具有重要生物功能，它是内皮细胞松弛因子(edrf)，能抑制血小板凝集，但又具有反应性强和细胞毒性的一面，对心血管既有保护作用又可能有损伤，这种双面性非常典型的体现在了心脑血管系统中。其中，心肌缺血再灌注损伤与一氧化氮自由基的关系引起了人们的广泛关注。人们不仅应用生理生化方法进行了研究分析，而且也用esr技术研究了缺血再灌注过程产生的一氧化氮自由基。大量研究表明，血管内皮功能障碍与高血压密切相关。一氧化氮自由基减少与高血压的病例形成和发展奠定了基础。另外，no还具有免疫调节功能、抗溃疡以及调节性功能等作用。
3.目前已经有多种测定no的方法，如化学发光法、分光光度法、荧光法等。
4.化学发光法被认为是测定no的标准方法。经典的测定no的化学发光法是根据no与臭氧(o3)反应生成激发态二氧化氮(no2*)，no2*在返回基态的过程中释放能量而发光。此方法灵敏度较高，检出限为5pmol/l。但此方法的缺点是：no与o3的反应必须在气态进行，溶液中的一氧化氮必须用惰性气体将其气提出来，操作复杂，且该反应还存在易受氨气、硫化氢、烯类、二甲亚砜(dmso)等的干扰，以及反应条件不容易控制等。后来对氧化剂进行改进，用过氧化氢代替臭氧，即鲁米诺法。no可被h2o2强烈的氧化生成onoo-，而onoo-可使鲁米诺氧化并在溶液中发出很强的光。因为只有no可以激发这一光化学反应，而no
2-和no
3-则不能，所以该方法是可对溶液中的no进行实时测定且检测灵敏度最高的方法，其检出限可达10-13mol/l。由于人体血液中no极易被氧化为no
2-甚至no
3-，因此本法不适用于血液样本检测。
5.荧光法测定no的原理是no
2-在酸性条件下与dan(2,3-diaminonaphthalene)发生反应，生成荧光物质1-(h)-naphthotriazole，该物质在碱性条件下(ph10以上)具有很高的荧光效率，用365nm光激发，在450nm处测定荧光强度进行定量测定。该法虽然具有较高灵敏度，但检测需要特殊仪器，且耗时较长，不适用于临床大规模筛查。
6.电化学检测和no微传感器虽然可以实时在体原位检测，但设备昂贵，临床应用并不广泛。
7.no在体内或水溶液中极易氧化生成no
2-，在酸性条件下，no
2-促使griess反应发生而生成重氮化合物。其浓度与no
2-浓度具有线性关系。该化合物可在540～560nm处进行定量测定，即分光光度法，但此法操作过程中需要离心，处理量不易放大，过程费时费力且操作步骤繁琐大规模临床应用受到局限。
8.综上，急需操作简单，可以大规模临床应用的检测方法。


技术实现要素：

9.针对现有技术中no检测方法操作复杂，不适合于大规模临床应用的技术问题，本发明提供一种一氧化氮检测试剂。
10.本发明的检测试剂依据酶循环的方法，利用酶的底物特异性来放大靶物质(被测物)，以提高测定准确度和简化检测步骤。
11.酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质(被测物)的测定方法，过程中持续消耗某一种反应物，被测物消耗后又循环产生，反应每循环一次，将消耗对应物质的量的某反应物和被测物，生成对应物质的量的被测物，因此，在一定时间内，反应循环的次数则相当于一次循环中反应物消耗的倍数，因此可以利用测定反应物消耗速率来测定靶物质的含量。此法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或对靶物质的提取，而且该法不需要专门的设备，是一种前景广阔的测定技术。由于酶法测定的特异性好，检测简便很多，反应温和，无污染，且灵敏度较高(10-6
mol/l)，可满足体液中大部分物质的测定，因此在临床化学测定中已广为应用。
12.本发明提供了一种新的测定体液样本中一氧化氮的酶循环方法，该方法操作非常简便，具有优良的反应灵敏度。并首次采用测定一氧化氮方法中的工具酶，硝酸还原酶和亚硝酸盐歧化酶以及一氧化氮双加氧酶用于酶循环增量测定。此外，本发明同时还首次公开了基于上述三种工具酶的酶循环方法及利用该方法制备的一氧化氮诊断试剂，该试剂可以应用于目前广泛使用的临床自动分析仪，从而满足大规模筛查的要求。
13.本发明提供一种一氧化氮检测试剂，所述检测试剂包含还原型辅酶和/或其衍生物、硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。
14.优选地，其包含：
15.硝酸还原酶，在还原型辅酶和/或其衍生物存在下，使样品中硝酸根离子发生还原反应生成亚硝酸根离子；
16.亚硝酸盐歧化酶，在h+存在条件下，能使上述反应生成的以及样品中的亚硝酸根发生反应生成一氧化氮和硝酸根离子；
17.一氧化氮双加氧酶，在氧气和还原型辅酶和/或其衍生物存在条件下，可使所述一氧化氮发生反应生成硝酸根离子。
18.优选地，所述还原型辅酶选自还原型辅酶i(nadh)或还原型辅酶ii(nadph)中的一种或两种；
19.优选地，所述还原型辅酶衍生物选自硫代还原型辅酶i(thio-nadh)或硫代还原型辅酶ii(thio-nadph)中的一种或两种。
20.优选地，所述一氧化氮双加氧酶能使所述一氧化氮在还原型辅酶和/或其衍生物和氧气的存在下发生反应生成硝酸根离子。
21.优选地，所述硝酸还原酶在还原型辅酶和/或其衍生物存在条件下，使待测样品中硝酸根离子发生如下式(1)所示反应：
22.0.2％，更优选为0.1％。
46.优选地，所述检测试剂中还含有校准品，校准品为硝酸钠水溶液，浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l。
47.本发明还提供一种一氧化氮检测试剂盒，其包含：
48.含有硝酸还原酶和还原型辅酶和/或其衍生物的单元，能使待测样品中硝酸根离子发生还原反应生成亚硝酸根离子；
49.含有亚硝酸盐歧化酶的单元，能使所述亚硝酸根离子发生反应生成一氧化氮和硝酸根离子；
50.含有一氧化氮双加氧酶和还原型辅酶和/或其衍生物的单元，能使所述一氧化氮在还原型辅酶和/或其衍生物的存在下发生反应生成硝酸根离子。
51.本发明还提供一种一氧化氮含量的检测方法，所述检测方法中包含如下酶循环反应：
[0052][0053]
优选地，利用包含所述的检测试剂对样本进行检测。
[0054]
优选地，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中一氧化氮含量；
[0055]
优选地，利用分光光度法检测还原型辅酶消耗速率。
[0056]
优选地，所述检测方法包含如下步骤：将样本与还原型辅酶混合，加入硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中的一氧化氮的含量；
[0057]
优选地，将样本与含有还原型辅酶的缓冲液混合，加入硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中的一氧化氮的含量。
[0058]
优选地，利用速率法或终点法计算样本中的一氧化氮的含量，优选为速率法。
[0059]
优选地，所述样本为细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液、水溶液。
[0060]
优选地，所述的检测方法包含将试剂r1与待测样本混合，然后加入试剂r2进行检测；
[0061]
优选地，试剂r1、试剂r2、待测样本的体积比为200-300∶30-100∶1-20，优选为200∶60∶10。
[0062]
优选地，所述的检测方法还包含将试剂r1与校准品混合，然后加入试剂r2进行检测，制作标准曲线。
[0063]
本发明还提供所述的检测试剂或所述的检测方法在检测一氧化氮含量中的应用。
[0064]
本发明提供了一种采用循环增量技术的酶学测定方法及其试剂，测定体液样本中
一氧化氮的含量。该循环增量测定系统主要由硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶组成。硝酸还原酶目前已广泛应用于griess试剂；亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶在酶循环体系中应用较为少见。
[0065]
本发明提供了一种测定一氧化氮的诊断试剂，包含硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，除了以上三种工具酶，还包含还原型辅酶和/或其衍生物，因为实际上还原型辅酶的衍生物可以通过一些反应生成还原型辅酶i/ii，从而发生消耗还原型辅酶i/ii的酶循环反应。
[0066]
一氧化氮在体内或水溶液中通常被氧化为硝酸盐或亚硝酸盐，硝酸盐被诊断试剂中的硝酸还原酶(ec 1.7.1.1)(ec号是酶学委员会(enzyme commission)为酶所制作的一套编号分类法，是以每种酶所催化的化学反应为分类基础。这套分类法亦同时会为各种酶给予一个建议的名称，所以亦称为酶学委员会命名法。)还原成亚硝酸盐，同时消耗还原型辅酶i/ii，然后，在亚硝酸盐歧化酶(ec 1.7.6.1)的催化作用下，生成一氧化氮和硝酸盐。一氧化氮在一氧化氮双加氧酶(ec 1.14.12.17)的作用下氧化为硝酸盐/亚硝酸盐，同时消耗还原型辅酶i/ii。因此，样本中的硝酸盐反复循环反应，不断消耗还原型辅酶i/ii，还原型辅酶i/ii的消耗速率与样本中硝酸盐/亚硝酸盐的含量成正比，通过测定还原型辅酶i/ii的消耗速率就可以达到测定体液样本中一氧化氮含量的目的。
[0067]
本发明提供了一种一氧化氮测定方法，各步骤主要发生的化学反应方程式如下所示：
[0068][0069]
一氧化氮在体内或水溶液中极易氧化生成亚硝酸盐或者硝酸盐，因此需要先将溶液中的硝酸盐用硝酸还原酶还原为亚硝酸盐，进而采用亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶进行后两步酶循环反应。
[0070]
本发明首次创建了由硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶组成的酶循环反应，并应用于一氧化氮的测定。基于酶法循环增量测定的特点，循环反应系统的酶使用量不要求很高。当然，增加酶的用量并不影响本发明方法的应用，但会增加试剂的制造成本。优化酶和底物应用量可以促进循环反应向理想的方向进行，参考化学反应方程式(1)和(3)即可。
[0071]
本发明提供的一氧化氮检测试剂应用于一氧化氮检测，操作方法简便，具有优良的反应灵敏度，具有方便、快捷、自动化、抗干扰强和高灵敏度的特点。该试剂可以应用于目前广泛使用的临床自动分析仪，从而满足大规模筛查的要求。本发明提供了一种新的测定体液样本中一氧化氮的酶循环方法，该方法首次采用测定一氧化氮方法中的工具酶，硝酸还原酶和亚硝酸盐歧化酶以及一氧化氮双加氧酶用于酶循环增量测定。
[0072]
本发明提供的检测试剂检测通量大，单位时间内检测量多，能够大规模应用于一
氧化氮检测。
附图说明
[0073]
图1所示为实施例3中griess法和本发明试剂相关性标准曲线。
具体实施方式
[0074]
本发明提供了一种采用循环增量技术的酶学测定试剂及利用其检测一氧化氮的方法，测定样本中一氧化氮的含量。该循环增量测定系统包含硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。
[0075]
本发明提供的检测试剂能够检测细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液、水溶液中一氧化氮的含量。
[0076]
本发明提供的一氧化氮测定试剂可以做成双组分的试剂，也可以做成单试剂或者三试剂。双试剂即，分两部分长期存放，试剂r1包含缓冲液和还原型辅酶和/或其衍生物，试剂r2为酶溶液，包含硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。
[0077]
在本发明的具体实施方式中，还原型辅酶和/或其衍生物选自nadh、nadph、thio-nadh或thio-nadph中的一种或两种以上的组合。
[0078]
在本发明的具体实施方式中，利用本发明提供的检测试剂与样本混合后，采用测定还原型辅酶i/ii消耗速率的方法，测定样本中一氧化氮的含量。
[0079]
具体的，在本发明的实施方式中，一氧化氮的检测方法包括以下步骤：(1)将检测试剂和样本反应，硝酸还原酶将样本中的硝酸根还原为亚硝酸根，同时消耗还原型辅酶i或ii，(2)亚硝酸盐歧化酶将步骤(1)得到的溶液中的亚硝酸根生成硝酸根和一氧化氮；(3)一氧化氮双加氧酶将步骤(2)得到的溶液中的一氧化氮氧化为硝酸根，同时消耗还原型辅酶i或ii；(4)(1)-(3)步骤循环发生，通过测定还原型辅酶i或ii的消耗速率，得到样本中一氧化氮的含量。
[0080]
本发明的一种具体实施方式中，采用分光光度法测定还原型辅酶的消耗速率，在本发明提供的一种具体实施方式中，监测340nm处光吸收值下降的速率，计算出样本中一氧化氮的含量。
[0081]
在本发明的具体实施方式中，所述硝酸还原酶(nr)、亚硝酸盐歧化酶(np)和一氧化氮双加氧酶(nod)来源于商购或自制。
[0082]
在本发明的一种具体实施方式中，所述硝酸还原酶(nr)、亚硝酸盐歧化酶(np)和一氧化氮双加氧酶(nod)通过基因工程菌发酵纯化得到。
[0083]
所述基因工程菌制备步骤包括：引物合成、基因克隆、质粒构建、质粒鉴定、质粒转化、dna测序等步骤。
[0084]
具体地，基因克隆的主要步骤为：合成基因片段，通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物，通过多段重组的方法重组到目的载体(pet-28a(+))中，得到全长构建。
[0085]
nr、np和nod酶的基因序列和氨基酸序列及pcr扩增过程中所用的模板和引物序列如下所示：
[0086]
硝酸还原酶(nr)的目的基因序列如seq id no.1所示：
[0087]
[0088]
[0089][0090]
硝酸还原酶(nr)的氨基酸序列如seq id no.2所示：
[0091]
[0092][0093]
构建硝酸还原酶(nr)质粒过程中所用的pcr引物序列如下表1-1所示。
[0094]
表1-1
[0095]
[0096]
[0097]
[0098][0099]
构建硝酸还原酶(nr)质粒过程中所用的模板和引物如下表1-2中所示。
[0100]
表1-2
[0101][0102]
亚硝酸盐歧化酶(np)的目的基因序列如seq id no.3所示：
[0103]
[0104][0105]
亚硝酸盐歧化酶(np)的氨基酸序列如seq id no.4所示：
[0106][0107]
构建亚硝酸盐歧化酶(np)质粒过程中所用的pcr引物序列如下表1-3所示。
[0108]
表1-3
[0109]
[0110][0111]
构建亚硝酸盐歧化酶(np)质粒过程中所用的模板和引物如下表1-4中所示。
[0112]
表1-4
[0113][0114]
一氧化氮双加氧酶(nod)的目的基因序列如seq id no.5所示：
[0115]
[0116][0117]
一氧化氮双加氧酶(nod)的氨基酸序列如seq id no.6所示：
[0118]
构建一氧化氮双加氧酶(nod)质粒过程中所用的pcr引物序列如下表1-5所示。
[0119]
表1-5
[0120][0121][0122]
构建一氧化氮双加氧酶(nod)质粒过程中所用的模板和引物如下表1-6中所示。
[0123]
表1-6
[0124][0125]
具体地，克隆质粒的鉴定方法为：
[0126]
(1)pcr反应采用20μl体系：引物0.5μl，模板菌液2μl，聚合酶缓冲液0.5μl，buffer 3ul，ddh2o 14μl。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。
[0127]
(2)以菌液pcr方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒并测序。
[0128]
(3)测序比对正确的质粒，进行双酶切，预计获得包含目的基因及载体两个片段。
[0129]
具体地，质粒转化的方法如下
[0130]
(1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取1-3ul加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。质粒浓度较高的适当少加质粒，质粒浓度较低的可多加一些质粒
[0131]
(2)42℃水浴90s不要摇动
[0132]
(3)冰浴中放置3分钟左右
[0133]
(4)每管中加入500-800μl 37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。
[0134]
重组子的验证(dna测序步骤)
[0135]
(1)制备含相应抗性的琼脂平板(2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟
[0136]
(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落
[0137]
(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。
[0138]
三种基因工程菌均按照上述方法制备得到。
[0139]
具体地，其中np的纯化方式为：大肠杆菌中的表达，37℃、150rmp下培养到od 0.6。iptg浓度0.4mm，诱导温度30℃150rpm 15-18小时，离心收集细胞。100mm tris-hcl,ph 7.4,20mm edta,10％蔗糖，裂解，高压匀浆破碎，离心收集沉淀，含有triton x-100的缓冲液洗涤两次，在不含triton-x 100的缓冲液再洗两次。包涵体溶解于20ml的30mm tris-hcl,ph 7.4,1mm edta,6m盐酸胍，5mm dtt。10000g离心40min；将变性蛋白重新折叠，在80分钟的时间内使用30mm tris-hcl,ph 7.4,0.8m nacl,1mm edta,10mm dtt，以及15mm pmsf缓冲液0℃稀释，增加50倍的体积，4℃搅拌过夜。离心后采用超滤浓缩酶蛋白溶液。
[0140]
酶蛋白溶液采用常规sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。通过与marker比较分子
量大小，可以得知是否为目的蛋白。其中nr的分子量为109.08kd、np分子量为25.68kd、nod分子量为48.6kd。
[0141]
nr和nod亦为大肠杆菌系统表达，常规ni柱亲和纯化，纯化方法即常规操作。
[0142]
在本发明提供的一种具体实施方式中，试剂r1和试剂r2配方用于还原硝酸盐，以及采用由硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶组成的酶循环反应，测定固定时间段内还原型辅酶被氧化的速率。
[0143]
在本发明提供的一种具体实施方式中，试剂r1中含有磷酸盐缓冲液、还原型辅酶(nadh/nadph)、表面活性剂以及防腐剂。
[0144]
在本发明提供的一种具体实施方式中，试剂r2中含有tris-hcl缓冲液、硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶、一氧化氮双加氧酶、甘露糖醇、金属离子及防腐剂。试剂r1与试剂r2和校准品组合成完整的酶循环测定试剂。
[0145]
在本发明提供的一种具体实施方式中，试剂r1配制方法包含：分别称取2.584g na2hpo4·
12h2o和nah2po4·
2h2o 7.068g溶解于1000ml纯化水中，依次称取nadh 0.25g、tween-20 1ml、pc300 1ml并加入上述磷酸盐缓冲液中，充分溶解后用0.22μm膜过滤，至于2～8℃备用；
[0146]
在本发明提供的一种具体实施方式中，试剂r2配制方法包含：称取2.42g tris溶于1000ml纯化水中，用浓盐酸调节ph至7.4，称取甘露糖醇1g、fecl
2 126.75mg、nan
3 1ml加入上述缓冲液，充分溶解后依次称取硝酸还原酶1-9ku、最优3-5ku、亚硝酸盐歧化酶3-11ku、最优5-7ku、一氧化氮双加氧酶2-10ku、最优4-6ku逐一溶解至上述溶液中，缓慢搅拌至完全溶解，用0.45μm膜过滤，至于2～8℃备用；
[0147]
在本发明提供的一种具体实施方式中，样本测定，采用日立7080生化仪，r1∶r2∶样本为200-300∶30-100∶1-20，(或同比增加或减少用量，须在仪器适当的加量范围内)，温度37℃，测定波长340nm，r1加样本或校准品后在测定温度孵育300秒，然后加入r2，延迟60～120秒，排除样本中可消耗还原型辅酶物质的干扰，以及其它亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶的副反应，测定时间180秒，读数在测定时间内选择至少2个有效点。
[0148]
本发明实施例中所用原料信息如表1-7所示：
[0149]
表1-7
[0150]
名称出售厂家na2hpo4·
12h2o国药集团化学试剂有限公司nah2po4·
2h2o国药集团化学试剂有限公司nadh北京百灵威科技有限公司tween-20国药集团化学试剂有限公司pc300sigma-aldrichtrisamresco甘露糖醇国药集团化学试剂有限公司
[0151]
实施例
[0152]
以下实施例中列举的是本发明的具体举例，本领域技术人员可以根据本领域的通用技术对原料、步骤等进行替换或改进，应当理解的是，这些改进和替换也应属于本发明权利要求书和说明书的范围内。
[0153]
实施例1.酶用量筛选
[0154]
试剂r1配制：分别称取2.584g na2hpo4·
12h2o和nah2po4·
2h2o 7.068g溶解于1000ml纯化水中，依次称取nadh 0.25g、tween-20 1ml、pc300 1ml并加入上述磷酸盐缓冲液中，充分溶解后用0.22μm膜过滤，至于2～8℃备用；
[0155]
试剂r2配制：称取2.42g tris溶于1000ml纯化水中，用浓盐酸调节ph至7.4，称取甘露糖醇1g、nan
3 1ml加入上述缓冲液，充分溶解后依次称取硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶、一氧化氮双加氧酶逐一溶解至上述溶液中，缓慢搅拌至完全溶解，用0.45μm膜过滤，至于2～8℃备用；
[0156]
该循环酶法检测试剂中还含有校准品。校准品为硝酸钠水溶液，浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l。配制方法为：称取17mg硝酸钠溶解于1000ml纯化水中，充分溶解后得到200μmol/l浓度点校准品；取500ml 200μmol/l的校准品与纯化水1:1混合，得到100μmol/l浓度点校准品；以此类推，得到50、25、12.5μmol/l浓度点校准品。
[0157]
样本测定，采用日立7080生化仪，r1∶r2∶样本为200∶60∶10，温度37℃，测定波长340nm，试剂r1加校准品后在测定温度孵育300秒，然后加入r2，延迟60～120秒，排除样本中可消耗还原型辅酶物质的干扰，以及其它亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶的副反应，测定时间180秒，读数在测定时间内选择至少2个有效点。
[0158]
1.1硝酸还原酶用量筛选
[0159]
按照上述r2的配制方法，依次加入除酶外的其他组分，充分溶解后加入亚硝酸盐歧化酶12ku/l，一氧化氮双加氧酶10ku/l，分别加入硝酸还原酶1ku/l、3ku/l、5ku/l、7ku/l、9ku/l，测试反应速率，数据如表2所示。
[0160]
表2
[0161][0162][0163]
由表2结果表明，硝酸还原酶用量3-5ku/l时速率最优。
[0164]
1.2亚硝酸盐歧化酶用量筛选
[0165]
按照上述r2的配制方法，依次加入除酶外的其他组分，充分溶解后加入硝酸还原酶5g/l，一氧化氮双加氧酶10g/l，分别加入亚硝酸盐歧化酶3ku/l、5ku/l、7ku/l、9ku/l、11ku/l，测试反应速率，数据如表3所示。
[0166]
表3
[0167][0168]
由表3结果表明，亚硝酸盐歧化酶用量5-7ku/l时速率最优。
[0169]
1.3一氧化氮双加氧酶用量筛选
[0170]
按照上述r2的配制方法，依次加入除酶外的其他组分，充分溶解后加入硝酸还原酶5ku/l，亚硝酸盐歧化酶7ku/l，分别加入一氧化氮双加氧酶2ku/l、4ku/l、6ku/l、8ku/l、10ku/l，测试反应速率，数据如表4所示。
[0171]
表4
[0172][0173][0174]
由表4结果表明，一氧化氮双加氧酶用量4-6ku/l时速率最优。
[0175]
实施例2一种一氧化氮检测试剂
[0176]
实施例2.1
[0177]
按照实施例1中的配制方法，按照如下配方配制试剂r1、试剂r2和校准品：
[0178]
试剂r1：50mm的tris-hcl缓冲液1000ml，其中含有nadh 0.01wt％，吐温-20 0.5wt％，叠氮钠0.01wt％；
[0179]
试剂r2：20mm的tris-hcl缓冲液1000ml，其中含有nr 5ku/l，np 7ku/l，nod 6ku/
l，fecl
2 0.1mm，甘露糖醇1wt％，pc300 0.01wt％；
[0180]
校准品：配制浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l的硝酸钠水溶液。
[0181]
实施例2.2
[0182]
按照实施例1中的配制方法，按照如下配方配制r1、r2试剂和校准品：
[0183]
试剂r1：50mm的hepes缓冲液1000ml，其中含有nadh 0.05wt％，brij 35 0.01wt％，庆大霉素0.5wt％；
[0184]
试剂r2：20mm的hepes缓冲液1000ml，其中含有nr 5ku/l，np 7ku/l，nod 6ku/l，cacl
2 1mm，甘露糖醇5wt％，庆大霉素0.5wt％；
[0185]
校准品：配制浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l的硝酸钠水溶液。
[0186]
实施例2.3
[0187]
按照实施例1中的配制方法，按照如下配方配制r1、r2试剂和校准品：
[0188]
试剂r1：50mm的磷酸缓冲液1000ml，其中含有nadh 0.02wt％，triton x-100 0.1wt％，庆大霉素0.05wt％；
[0189]
试剂r2：20mm的磷酸缓冲液缓冲液1000ml，其中含有nr 5ku/l，np7ku/l，nod 6ku/l，mgcl
2 5mm，甘露糖醇0.01wt％，硫柳汞0.1wt％；
[0190]
校准品：配制浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l的硝酸钠水溶液。
[0191]
实施例2.4
[0192]
按照实施例1中的配制方法，按照如下配方配制r1、r2试剂和校准品：
[0193]
试剂r1：50mm的tris-hcl缓冲液缓冲液1000ml，其中含有nadh 0.03wt％，吐温-20 0.2wt％，pc300 0.2wt％；
[0194]
试剂r2：20mm的磷酸缓冲液缓冲液1000ml，其中含有nr 5ku/l，np 7ku/l，nod 6ku/l，fecl
2 1mm，甘露糖醇0.1wt％，pc300 0.3wt％；
[0195]
校准品：配制浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l的硝酸钠水溶液。
[0196]
实施例2.5
[0197]
按照实施例1中的配制方法，按照如下配方配制r1、r2试剂和校准品：
[0198]
试剂r1：50mm的磷酸盐缓冲液缓冲液1000ml，其中含有nadh 0.025wt％，吐温-20 0.1wt％，pc300 0.1wt％；
[0199]
试剂r2：20mm的tris-hcl缓冲液缓冲液1000ml，其中含有nr 5ku/l，np 7ku/l，nod 6ku/l，fecl
2 1mm，甘露糖醇0.1wt％，叠氮钠0.1wt％；
[0200]
校准品：配制浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l的硝酸钠水溶液。
[0201]
实施例2.6
[0202]
按照实施例1中的配制方法，按照如下配方配制r1、r2试剂和校准品：
[0203]
试剂r1：50mm的磷酸盐缓冲液缓冲液1000ml，其中含有nadh 0.04wt％，吐温-20 0.05wt％，硫柳汞0.3wt％；
[0204]
试剂r2：20mm的磷酸盐缓冲液缓冲液1000ml，其中含有nr 5ku/l，np 7ku/l，nod 6ku/l，fecl2 5mm，甘露糖醇3wt％，pc300 0.5wt％；
[0205]
校准品：配制浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l的硝酸钠水溶液。
[0206]
检测以上实施例所得试剂的吸光度值，测试方法见实施例1，测试结果见表5。
[0207]
表5
[0208][0209][0210]
由表5可知，实施例2.5响应值最高，为最优配方。
[0211]
实施例3本发明试剂与griess法一氧化氮检测试剂的相关性
[0212]
本发明试剂与griess法一氧化氮检测试剂同时测定40份人血清，以griess法一氧化氮检测试剂测定的结果为横坐标，以本发明酶循环法测定的结果为纵坐标作回归分析，检测本发明试剂与griess法一氧化氮检测试剂的相关性。
[0213]
具体检测方法为：采用日立7080生化仪，以如下所述griess法检测40份血清中一氧化氮含量：
[0214]
griess法：混匀，室温静置10分钟，蒸馏水调零，546nm，1.0cm光径，生化仪测各管吸光度值。
[0215]
酶循环法：
[0216]
试剂r1配制方法：分别称取1.292g na2hpo4·
12h2o和3.534gnah2po4·
2h2o溶解于500ml纯化水中，依次称取nadh 0.125g、tween-200.5ml、pc300 0.5ml并加入上述磷酸盐缓冲液中，充分溶解后用0.22μm膜过滤，置于2～8℃备用；
[0217]
试剂r2配制方法包含：称取0.605g tris溶于250ml纯化水中，用浓盐酸调节ph至7.4，称取甘露糖醇0.25g、fecl
2 31.69mg、nan
3 0.25g加入上述缓冲液，充分溶解后依次称取硝酸还原酶1.25ku、亚硝酸盐歧化酶1.75ku、一氧化氮双加氧酶1.5ku逐一溶解至上述溶液中，缓慢搅拌至完全溶解，用0.45μm膜过滤，至于2～8℃备用；
[0218]
采用日立7080生化仪，r1∶r2∶样本为200∶60∶10，温度37℃，测定波长340nm，试剂r1加校准品后在测定温度孵育300秒，然后加入r2，延迟60～120秒，排除样本中可消耗还原型辅酶物质的干扰，以及其它亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶的副反应，测定时间180秒，读数在测定时间内选择至少2个有效点，所得数据如下表6中所示。
[0219]
表6
[0220][0221]
按照griess法说明书和本法测试方法分别将griess法试剂和本发明试剂进行标准曲线测定，并同时测定40份血清，根据测定结果比较两试剂相关性。结果如表7和图1所示。
[0222]
表7
[0223]
[0224][0225]
如表7和图1所示，以griess法一氧化氮检测试剂测定的结果为横坐标，以本发明酶循环法测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为y＝0.9512x+5.5082，相关系数为0.9784。经统计学处理结果表明，本发明的一氧化氮测定试剂同griess法试剂盒临床样本测值相关性良好。
[0226]
实施例4抗干扰性能
[0227]
试剂的抗干扰性能是指被测物检测结果不受其它成分干扰的能力，即处于干扰物质存在的环境下，试剂也能将检测结果与实际数值的偏差控制在可接受的范围内的能力。一般认为
±
10％为可接受的范围。
[0228]
极高值特殊样本一般不容易得到，因此研发过程中一般在正常血清中加入特定浓度的干扰物质来模拟特殊样本。
[0229]
对照样本：血清450μl，双蒸水50μl，共计500μl。
[0230]
在血清样本中分别加入不同浓度的胆红素、血红蛋白、甘油三酯、抗环血酸制备干扰样本，干扰样本具体制备方法见下表8所示。
[0231]
表8
[0232]
[0233][0234]
用本循环酶法试剂进行测试：
[0235]
试剂r1配制方法：分别称取1.292g na2hpo4·
12h2o和3.534gnah2po4·
2h2o溶解于500ml纯化水中，依次称取nadh 0.125g、tween-200.5ml、pc300 0.5ml并加入上述磷酸盐缓冲液中，充分溶解后用0.22μm膜过滤，置于2～8℃备用；
[0236]
试剂r2配制方法包含：称取0.605g tris溶于250ml纯化水中，用浓盐酸调节ph至7.4，称取甘露糖醇0.25g、fecl
2 31.69mg、nan
3 0.25g加入上述缓冲液，充分溶解后依次称取硝酸还原酶1.25ku、亚硝酸盐歧化酶1.75ku、一氧化氮双加氧酶1.5ku逐一溶解至上述溶液中，缓慢搅拌至完全溶解，用0.45μm膜过滤，至于2～8℃备用；
[0237]
按照试剂r1∶试剂r2∶样本为200∶60∶10的比例，采用日立7080生化仪进行检测，数据如表9所示。
[0238]
表9
[0239]
干扰物质测值1测值2均值偏差对照35.4235.7535.59/胆红素(μmol/l)
ꢀꢀꢀꢀ
20035.7634.9835.37-0.60％40034.1935.8435.02-1.60％60034.2234.2734.24-3.77％80033.6333.2633.45-6.01％100031.2331.7831.50-11.47％
血红蛋白(mg/dl)
ꢀꢀꢀꢀ
5036.0736.7036.382.23％10035.6635.5035.58-0.04％15033.5132.1932.85-7.71％20031.2032.2231.71-10.90％甘油三酯(mmol/l)
ꢀꢀꢀꢀ
335.5235.0135.27-0.90％637.4034.5935.991.13％936.4137.7237.074.15％1238.7138.4838.598.44％1539.7139.3639.5411.09％抗坏血酸(mg/dl)
ꢀꢀꢀꢀ
1035.4036.8836.141.54％3034.0934.3934.24-3.79％5032.9132.6132.76-7.96％7030.9129.2230.06-15.53％
[0240]
由上表9可知，在待测样本中加入胆红素、血红蛋白、甘油三酯、抗环血酸，利用本发明提供的检测试剂检测待测样本中硝酸盐和亚硝酸盐含量从而得到一氧化氮含量，结果未受显著影响，说明本发明提供的检测试剂在样本中含有不多于800umol/l的胆红素、150mg/dl的血红蛋白、12mmol/l的甘油三酯、50mg/dl的抗环血酸时，测试结果均不受上述物质的影响。
[0241]
实施例5实时稳定性
[0242]
配制三批试剂(批号分别为20211022、20211103、20211118)，方法如下：
[0243]
试剂r1配制方法：分别称取1.292g na2hpo4·
12h2o和3.534gnah2po4·
2h2o溶解于500ml纯化水中，依次称取nadh 0.125g、tween-200.5ml、pc300 0.5ml并加入上述磷酸盐缓冲液中，充分溶解后用0.22μm膜过滤，置于2～8℃备用；
[0244]
试剂r2配制方法包含：称取0.605g tris溶于250ml纯化水中，用浓盐酸调节ph至7.4，称取甘露糖醇0.25g、fecl
2 31.69mg、nan
3 0.25g加入上述缓冲液，充分溶解后依次称取硝酸还原酶1.25ku、亚硝酸盐歧化酶1.75ku、一氧化氮双加氧酶1.5ku逐一溶解至上述溶液中，缓慢搅拌至完全溶解，用0.45μm膜过滤，至于2～8℃备用；
[0245]
校准品：浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l的硝酸钠水溶液。
[0246]
按照上述方法分别配制三批试剂(批号分别为20211022、20211103、20211118)，置于2～8℃，并分别于0天、1月、3月、5月、7月、9月、12月、15月取出适量进行测试。
[0247]
采用日立7080生化仪，r1∶r2∶校准品的体积比为250∶60∶10，校准品浓度如表8-10中记载，温度37℃，测定波长340nm，r1加校准品后在测定温度孵育300秒，然后加入r2，测定时间180秒，读数在测定时间内选择至少2个有效点。数据见表10-12。
[0248]
表10 20211022批次实时稳定性
[0249][0250][0251]
表11 20211103批次实时稳定性
[0252][0253][0254]
表12 20211118批次实时稳定性
[0255][0256]
由表10-12数据可知，该一氧化氮循环酶法试剂在2-8℃避光条件下，可稳定保存12个月。循环酶法一氧化氮检测试剂实时稳定性良好。
[0257]
上述试剂的测定方法，与本专业中常规的应用方法相同，如：可以采用速率法或终点法，通过参照校准品或绘制标准浓度曲线等，计算出被测物的含量。
[0258]
上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明绝不局限于上述举例的应用范围；此外，在本发明相关领域中的专业技术人员，可以根据本发明的原理和方法配制出与之类似的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。

技术特征：
1.一种一氧化氮检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含还原型辅酶和/或其衍生物、硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。2.根据权利要求1所述的一氧化氮检测试剂，其特征在于，其包含：硝酸还原酶，在还原型辅酶和/或其衍生物存在下，使样品中硝酸根离子发生还原反应生成亚硝酸根离子；亚硝酸盐歧化酶，在h+存在条件下，能使上述反应生成的以及样品中的亚硝酸根发生反应生成一氧化氮和硝酸根离子；一氧化氮双加氧酶，在氧气和还原型辅酶和/或其衍生物存在条件下，可使所述一氧化氮发生反应生成硝酸根离子。3.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，所述还原型辅酶选自还原型辅酶i(nadh)或还原型辅酶ii(nadph)中的一种或两种；优选地，所述还原型辅酶衍生物选自硫代还原型辅酶i(thio-nadh)或硫代还原型辅酶ii(thio-nadph)中的一种或两种。4.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述一氧化氮双加氧酶能使所述一氧化氮在还原型辅酶和/或其衍生物和氧气的存在下发生反应生成硝酸根离子。5.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述硝酸还原酶在还原型辅酶和/或其衍生物存在条件下，使待测样品中硝酸根离子发生如下式(1)所示反应：6.根据权利要求2-5任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述亚硝酸盐歧化酶与所述亚硝酸根离子发生如下式(2)所示反应：7.根据权利要求2-6任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述一氧化氮双加氧酶、一氧化氮和还原型辅酶和/或其衍生物发生如下式(3)所示反应：8.根据权利要求1-7任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包含缓冲液；优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。9.根据权利要求1-8任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含试剂r1和试剂r2，其中，试剂r1包含：a.还原型辅酶溶液，或，b.含有还原型辅酶的缓冲液，试剂r2包含硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。10.根据权利要求9所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂r1中的还原型辅酶的质量百分比为0.01-0.05％，优选为0.02-0.03％，更优选为0.025％。11.根据权利要求9或10所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂r1中的缓冲液为tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、磷酸缓冲液中的一种或两种以上的组合，优选为磷酸缓冲液。
12.根据权利要求9-11任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂r1中还含有表面活性剂和第一防腐剂；优选地，所述表面活性剂选自吐温-20，brij 35，triton x-100中的一种或两种以上的组合，优选地，所述试剂r1中的表面活性剂的质量百分比为0.01-1％，优选为0.01-0.5％，更优选为0.1％；优选地，所述第一防腐剂选自pc300，叠氮钠，庆大霉素，硫柳汞中的一种或两种以上的组合，优选地，所述试剂r1中的第一防腐剂的质量百分比为0.01-0.5％，优选为0.01-0.2％，更优选为0.1％。13.根据权利要求9-12任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂r2中硝酸还原酶的含量为1-9ku/l，优选为3-5ku/l；优选地，所述试剂r2中亚硝酸盐歧化酶的含量为3-11ku/l，优选为5-7ku/l；优选地，所述试剂r2中一氧化氮双加氧酶的含量为2-10ku/l，优选为4-6ku/l。14.根据权利要求9-13任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂r2中还含有第二缓冲液、甘露糖醇、金属离子或第二防腐剂中的一种或两种以上的组合；优选地，所述第二缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液中的一种；优选地，所述试剂r2中的甘露糖醇的质量百分比为0.01-5％，优选为0.01-1％，更优选为0.1％；优选地，所述金属离子选自fe
2+
、mg
2+
、ca
2+
中的一种或两种以上的组合；优选地，所述试剂r2中的金属离子的摩尔浓度为0.1-10mm，优选为1-5mm；优选地，所述第二防腐剂选自pc300，叠氮钠，庆大霉素，硫柳汞中的一种或两种以上的组合，优选地，所述试剂r2中的第二防腐剂的质量百分比为0.01-0.5％，优选为0.01-0.2％，更优选为0.1％。15.根据权利要求1-14任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中还含有校准品，校准品为硝酸钠水溶液，浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l。16.一种一氧化氮检测试剂盒，其特征在于，其包含：含有硝酸还原酶和还原型辅酶和/或其衍生物的单元，能使待测样品中硝酸根离子发生还原反应生成亚硝酸根离子；含有亚硝酸盐歧化酶的单元，能使所述亚硝酸根离子发生反应生成一氧化氮和硝酸根离子；含有一氧化氮双加氧酶和还原型辅酶和/或其衍生物的单元，能使所述一氧化氮在还原型辅酶和/或其衍生物的存在下发生反应生成硝酸根离子。17.一种一氧化氮含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法中包含如下酶循环反应：应：应：
18.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，利用包含权利要求1-11任一项所述的检测试剂对样本进行检测。19.根据权利要求17或18所述的检测方法，其特征在于，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中一氧化氮含量；优选地，利用分光光度法检测还原型辅酶消耗速率。20.根据权利要求18或19所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包含如下步骤：将样本与还原型辅酶溶液混合，加入硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中的一氧化氮的含量；优选地，将样本与含有还原型辅酶的缓冲液混合，加入硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中的一氧化氮的含量。21.根据权利要求17-20任一项所述的检测方法，其特征在于，利用速率法或终点法计算样本中的一氧化氮的含量，优选为速率法。22.根据权利要求12-16任一项所述的检测方法，其特征在于，所述样本为细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液、水溶液。23.根据权利要求17-21任一项所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包含将试剂r1与待测样本混合，然后加入试剂r2进行检测；优选地，试剂r1、试剂r2、待测样本的体积比为200-300∶30-100∶1-20，优选为200∶60∶10。24.根据权利要求17-22任一项所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法还包含将试剂r1与校准品混合，然后加入试剂r2进行检测，制作标准曲线。25.权利要求1-15任一项所述的检测试剂或权利要求17-24所述的检测方法在检测一氧化氮含量中的应用。

技术总结
本发明提供一种一氧化氮检测试剂和检测方法及其应用。本发明提供的一氧化氮检测试剂包含还原型辅酶和/或其衍生物、硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。本发明提供的检测试剂应用于一氧化氮检测具有方便、快捷、自动化、抗干扰强和高灵敏度的特点。抗干扰强和高灵敏度的特点。


技术研发人员：王薇 李旋 罗绍柳 王贻杰
受保护的技术使用者：王学忠
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/8/24