一种SNP分子标记在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用

一种snp分子标记在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用
技术领域
1.本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种snp分子标记a08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用。


背景技术：

2.根肿病也称“根癌”，是由芸薹根肿菌(plasmodiophora brassicaeworon.)侵染引起的世界性土传病害，主要侵染大白菜、小白菜、甘蓝、萝卜、花椰菜、芥菜、油菜等十字花科植物。根肿菌侵染后会导致根部细胞异常增殖，形成肿瘤，从而影响水分和营养物质的运输，造成植株地上部分缺乏养分枯萎，直至全株死亡。利用抗根肿病基因培育抗病品种具有安全、高效、经济的特点，是从根本上解决根肿病困扰的重要途径之一，而通过寻找与抗根肿病基因紧密连锁的分子标记，利用分子标记辅助选择育种(marker-assisted selection)能够大大提高抗病育种效率。因此，筛选出更多与白菜根肿病抗性基因相关的snp，应用于白菜抗病材料的选择和抗病品种的育种，对提高白菜产量和品质等方面均有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种snp分子标记a08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用。本发明所述snp分子标记a08-12285323能够实现抗根肿病大白菜的鉴定，用于筛选抗根肿病大白菜的选育。
4.本发明提供了一种snp分子标记a08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用，所述snp分子标记a08-12285323的序列如seq id no.1所示，seq id no.1所示序列自5’端起第70位碱基是snp位点，其碱基为t或c。
5.本发明还提供了一种检测上述技术方案所述应用中snp分子标记a08-12285323的试剂。
6.优选的是，所述试剂包括引物组crr5-funk2，所述引物组crr5-funk2包括crr5-funk2fa、crr5-funk2fb和crr5-funk2r；所述crr5-funk2fa的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述crr5-funk2fb的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述crr5-funk2r的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7.优选的是，所述crr5-funk2fa和crr5-funk2fb分别标记不同颜色的荧光基团。
8.优选的是，所述荧光基团包括fam和hex。
9.本发明还提供了一种检测上述技术方案所述应用中snp分子标记a08-12285323的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述试剂和反应液。
10.本发明还提供了上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用。
11.本发明还提供了一种鉴定大白菜根肿病抗性的方法，包括以下步骤：
12.使用上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒对大白菜基因组dna进行竞争性等位基因特异性pcr扩增，最后对kasp扩增产物进行终点法荧光信号读取，得到基因分型结果，当基因型为tt或tc时，鉴定所述大白菜为抗根肿病大白菜，当基因型为cc时，鉴定所述大白菜为感根肿病大白菜。
13.优选的是，所述pcr扩增的反应体系以8μl计，包括1.5μl基因组dna，4μl kasp mastermix(2
×
)，0.14μl引物组crr5-funk2和余量的水。
14.优选的是，所述pcr扩增的反应程序包括：94℃15min；94℃20s，61℃60s，共10个循环，从第二个循环开始，每个循环降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，共26个循环；37℃1min。
15.本发明提供了一种snp分子标记a08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用。本发明所述snp分子标记a08-12285323能够实现抗根肿病大白菜的鉴定，用于筛选抗根肿病大白菜的选育。具体的，使用检测所述snp分子标记a08-12285323的试剂进行检测，可以实现大白菜抗根肿病和感根肿病材料的区分鉴定，在分子水平上快速筛选大白菜后代群体中含有抗根肿病基因crr5的个体，准确性高，能够大大提高抗病育种效率。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为本发明提供的利用标记crr5-funk2对f2群体进行kasp基因分型结果图；
18.图2为本发明提供的利用标记crr5-funk2对自然群体进行kasp基因分型结果图。
具体实施方式
19.本发明提供了一种snp分子标记a08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用，所述snp分子标记a08-12285323的序列如seq id no.1所示(actcaaaccaaacataacacacaatgataatctaacacacatactgcaaaatgcgaaatgtttcttcagyttccatcaacatgagagagctaagctttctaaaggacgtagcccgcattctttaatctccccgtttttt，y＝t/c)，seq id no.1所示序列自5’端起第70位碱基是snp位点，其碱基为t或c。本发明所述snp分子标记a08-12285323为大白菜根肿病抗性相关基因crr5的snp分子标记。本发明首次公开了与大白菜抗根肿病性状基因crr5相关的snp分子标记a08-12285323。使用检测所述snp分子标记a08-12285323的试剂进行检测，可以实现大白菜抗根肿病和感根肿病材料的区分鉴定，在分子水平上快速筛选大白菜后代群体中含有抗根肿病基因的个体，准确性高，能够大大提高抗病育种效率。
20.本发明还提供了一种检测上述技术方案所述应用中snp分子标记a08-12285323的试剂。在本发明中，所述引物优选包括kasp(kompetitive allele specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)引物。在本发明中，所述试剂优选包括引物组crr5-funk2，所述引物组crr5-funk2包括crr5-funk2fa、crr5-funk2fb和crr5-funk2r；所述crr5-funk2fa的核苷酸序列如seq id no.2所示：5'-gaaggtgaccaagttcatgctaaatgcgaaatgtttcttcagt-3'；所述
crr5-funk2fb的核苷酸序列如seq id no.3所示：5'-gaaggtcggagtcaacggattatgcgaaatgtttcttcagc-3'；所述crr5-funk2r的核苷酸序列如seq id no.4所示：5'-cgtcctttagaaagcttagctctctc-3'。在本发明中，所述crr5-funk2fa和crr5-funk2fb优选分别标记不同颜色的荧光基团。在本发明中，所述荧光基团优选包括fam和hex。在本发明中，所述crr5-funk2fa连接fam，所述crr5-funk2fb连接hex。本发明首次公开了与大白菜抗根肿病性状相关的snp分子标记a08-12285323的检测引物组crr5-funk2，该检测引物包含三条引物，通过对抗病和感病大白菜dh系以及二者杂交后产生的f2代分离群体的dna进行pcr扩增，并利用kasp基因分析系统检测，发现crr5-funk2可明显区分抗根肿病和感根肿病材料，在分子水平上快速筛选大白菜后代群体中含有抗根肿病基因crr5的个体。
21.本发明还提供了一种检测上述技术方案所述应用中snp分子标记a08-12285323的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述试剂和反应液。在本发明中，所述反应液优选包括kaspmastermix(2
×
)。
22.本发明还提供了上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用。
23.本发明还提供了一种鉴定大白菜根肿病抗性的方法，包括以下步骤：
24.使用上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒对大白菜基因组dna进行竞争性等位基因特异性pcr扩增，最后对kasp扩增产物进行终点法荧光信号读取，得到基因分型结果，当基因型为tt或tc时，鉴定所述大白菜为抗根肿病大白菜，当基因型为cc时，鉴定所述大白菜为感根肿病大白菜。
25.在本发明中，所述pcr扩增的反应体系以8μl计，优选包括1.5μl基因组dna，2
×
4μlkasp mastermix，0.14μl引物组crr5-funk2和余量的水。在本发明中，所述引物组crr5-funk2中，各引物的浓度优选均为100μmol/l。在本发明中，所述引物组crr5-funk2中crr5-funk2fa、crr5-funk2fb、crr5-funk2r和ddh2o的混合体积比优选为12：12：30：46。对大白菜基因组dna的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规基因组dna提取方法即可。在本发明中，所述pcr扩增的反应程序优选包括：94℃15min；94℃20s，61℃60s，共10个循环，从第二个循环开始，每个循环降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，共26个循环；37℃1min。
26.得到kasp扩增产物后，本发明进行终点法荧光信号读取，得到基因分型结果：当基因型为tt或tc时，鉴定所述大白菜为抗根肿病大白菜，当基因型为cc时，鉴定所述大白菜为感根肿病大白菜。
27.在本发明中，所述终点法荧光信号读取优选采用罗氏荧光定量pcr仪lightcycler480 instrument ii(lc480ii)进行。利用lc480 software v1.5.1分析snp分型结果。
28.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种snp分子标记a08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
29.实施例1
30.1.1供试材料和抗病性状调查
31.选择大白菜抗病dh系材料1edhr1(p1)和感病材料1edhs1(p2)作为亲本(杨双娟等.
大白菜抗根肿病基因braa.pb.8.4的定位及kasp标记开发.园艺学报，2021，48(7)：1317-1328.公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)。两个材料进行正反交获得f1代种子，f1材料自交获得f2种子。对p1，p2，f1和f2进行苗期接种鉴定，菌源为河南新野新菌xy-2，该菌源根据williams系统鉴定系统为4号生理小种，根据ecd鉴别系统为ecd21/31/31小种(原玉香，赵艳艳，魏小春等.2017.河南省大白菜根肿病菌生理小种鉴定.河南农业科学，46(7)：71-76)。接种6周之后调查各单株的发病级别，发病级别分为0级、1级、3级、5级和7级，具体调查方法参考赵艳艳等(赵艳艳，蒋武生，原玉香等.大白菜根肿病室内人工接种方法和条件比较及不同品种抗性鉴定，园艺学报，2014，41(s1)：2675)。
32.抗病鉴定结果表明，抗病亲本1edhr1(p1)的10株发病级别全部是0级，10株1edhs1(p2)的发病级别全部是7级，10株f1材料的发病级别为0级(表1)，f2群体中159株为0级，156株为1级，9株为3级，15株为5级，96株为7级。将0级和1级归为抗病类型，3级、5级和7级为感病类型，f2群体中抗病单株有315株，感病单株为120株，经卡平方测验符合3︰1的分离比例(表1)，表明1edhr1(p1)中的携带的抗根肿病基因由1对显性核基因控制，抗病对感病为显性。
33.表1大白菜亲本及其后代抗病、感病植株分离情况
[0034][0035]
1.2基因组dna提取
[0036]
采用改良的ctab法提取两亲本、f1和f2各单株基因组dna。具体步骤如下。
[0037]
取新鲜叶片于2.0ml eppendorf离心管中，向每管放入钢珠1粒(直径为5mm)，之后加1000μl 2％ctab提取缓冲液，在组织破碎仪(型号:德国retsch mm400)上以30次/秒的频率破碎1min。65℃温浴1h，待冷却后加入500μl 24:1的氯仿/异戊醇抽提液，上下摇动30次，静置分层，离心(12000r/min)10min，吸取400μl上清液至新的1.5ml离心管中，之后加400ul异丙醇沉淀dna，上下混匀后离心(12000r/min)5min，弃上清，然后加70％乙醇750μl清洗dna沉淀，离心(12000r/min)2min，弃上清，室温晾干dna，加入100μl ddh2o溶解dna，置于-20℃冰箱中备用。
[0038]
1.3根肿病基因crr5连锁snp标记的发现及其检测引物组crr5-funk2的开发
[0039]
通过基因定位方法确定白菜根肿病抗性基因crr5的候选基因，对候选基因进行测序和序列比对，发现在a08染色体12285323bp位置处(brapa_chiifu_v3.0参考基因)存在snp变异t/c，如下一段所示在70bp位置，在抗病材料中的碱基为t，在感病材料中的碱基为c，将此变异称为snp标记a08-12285323。
[0040]
actcaaaccaaacataacacacaatgataatctaacacacatactgcaaaatgcgaaatgtttcttcag[t/c]ttccatcaacatgagagagctaagctttctaaaggacgtagcccgcattctttaatctccccgtttttt(seq id no.1)。
[0041]
针对此snp标记a08-12285323设计kasp标记crr5-funk2，包括三条引物：
[0042]
crr5-funk2fa：5'-gaaggtgaccaagttcatgctaaatgcgaaatgtttcttcagt-3'(seq id no.2)；
[0043]
crr5-funk2fb：5'-gaaggtcggagtcaacggattatgcgaaatgtttcttcagc-3'(seq id no.3)；
[0044]
crr5-funk2r：5'-cgtcctttagaaagcttagctctctc-3'(seq id no.4)。
[0045]
crr5-funk2fa和crr5-funk2fb为两条等位基因特异性正向引物，crr5-funk2fa为抗病基因型的特异引物，crr5-funk2fb为感病基因型的特异引物，5'端分别加上fam和hex荧光序列标签序列(下划线部分)，crr5-funk2fa连接fam，所述crr5-funk2fb连接hex。crr5-funk2r为一条共同的反向引物。
[0046]
kasp-pcr反应在96孔pcr仪上进行，反应体系8μl：1.5μl dna(80ng/μl)，4μlkasp mastermix(2
×
)，0.14μl引物混合物(由浓度为100μmol/l的crr5-funk2fa、crr5-funk2fb、crr5-funk2r与ddh2o按12:12:30:46的体积比混合得到)，其余用ddh2o补齐。
[0047]
kasp-pcr扩增程序为：第一阶段94℃变性15min；第二阶段94℃变性20s，61℃退火60s，共10个循环(从第二个循环开始，每个循环降低0.6℃)；第三个阶段94℃变性20s，55℃退火60s，共26个循环；第四阶段37℃1min。
[0048]
kasp-pcr扩增产物用罗氏荧光定量pcr仪lightcycler 480instrument ii(lc480ii)进行终点法荧光信号读取。利用lc480 software v1.5.1分析snp分型结果：纯合抗病材料的信号点为蓝色，5'末端连接fam荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在x轴附近，基因型为tt；纯合感病材料的信号点为绿色，5'末端连接hex荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在y轴附近，基因型为cc；杂合抗病材料的信号点为红色，聚合在对角线附近，基因型为tc(图1，利用标记crr5-funk2对f2群体进行kasp基因分型结果图)。crr5-funk2标记能够显著区分两种纯合基因型，而且可以鉴别出杂合基因型，具有共显性标记特点，标记开发成功。
[0049]
利用crr5-funk2标记对f2群体的86个单株进行基因分型，将纯合抗病的基因型记为a，纯合感病的基因型记为b，杂合类型记为h。结果表明，基因型为a的单株有18株，其发病级别均为0，基因型为h的单株有21株，其发病级别均为0，基因型为b的单株有47株，其发病级别均为7(图1)。标记crr5-funk2在86个f2单株中的基因型和表型一致率达到100％。crr5-funk2标记可以用于大白菜的根肿病抗性品种的分子辅助育种。
[0050]
1.4snp标记检测引物的应用
[0051]
用ctab法进行叶片dna的提取。材料选择y636-9、y663-8、y623-1、y578-2等47个dh系材料。利用kasp标记crr5-funk2在47个dh群体中进行验证，以1edhr1作为抗病对照，结果表明47个感病dh系材料全部聚合在y轴附近，表现为感病基因型，1edhr1作为抗病材料聚集在x轴附近。标记crr5-funk2在48个dh系材料中的基因型和表型一致率达到100％。标记crr5-funk2具有很好的通用性和准确性，可以用于大白菜根肿病材料的分子标记辅助选择。
[0052]
图2为利用标记crr5-funk2对自然群体进行kasp基因分型结果图。
[0053]
结论：本发明发明了与大白菜根肿病抗病基因crr5相关的snp标记a08-12285323，公布了检测该标记的检测引物组crr5-funk2。该snp标记及其检测引物组crr5-funk2能够准确、高效地检测抗病及感病材料型。此筛选方法不受环境因素影响，能大幅度降低田间选择工作量，有助于辅助加快大白菜抗病育种。
[0054]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种snp分子标记a08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用，所述snp分子标记a08-12285323的序列如seq id no.1所示，seq id no.1所示序列自5’端起第70位碱基是snp位点，其碱基为t或c。2.一种检测权利要求1所述应用中snp分子标记a08-12285323的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物组crr5-funk2，所述引物组crr5-funk2包括crr5-funk2fa、crr5-funk2fb和crr5-funk2r；所述crr5-funk2fa的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述crr5-funk2fb的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述crr5-funk2r的核苷酸序列如seq id no.4所示。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述crr5-funk2fa和crr5-funk2fb分别标记不同颜色的荧光基团。5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述荧光基团包括fam和hex。6.一种检测权利要求1所述应用中snp分子标记a08-12285323的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2～5任一项所述试剂和反应液。7.权利要求2～5任一项所述试剂或权利要求6所述试剂盒在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用。8.一种鉴定大白菜根肿病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求2～5任一项所述试剂或权利要求6所述试剂盒对大白菜基因组dna进行竞争性等位基因特异性pcr扩增，最后对kasp扩增产物进行终点法荧光信号读取，得到基因分型结果，当基因型为tt或tc时，鉴定所述大白菜为抗根肿病大白菜，当基因型为cc时，鉴定所述大白菜为感根肿病大白菜。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系以8μl计，包括1.5μl基因组dna，4μl2
×
kaspmastermix，0.14μl引物组crr5-funk2和余量的水。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序包括：94℃15min；94℃20s，61℃60s，共10个循环，从第二个循环开始，每个循环降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，共26个循环；37℃1min。

技术总结
本发明属于分子标记辅助育种技术领域，涉及一种SNP分子标记A08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用。本发明提供了一种SNP分子标记A08-12285323在鉴定大白菜根肿病抗性和/或抗根肿病大白菜育种中的应用，所述SNP分子标记A08-12285323的序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第70位碱基是SNP位点，其碱基为T或C。本发明所述SNP分子标记A08-12285323能够实现抗根肿病大白菜的鉴定，用于筛选抗根肿病大白菜的选育。筛选抗根肿病大白菜的选育。筛选抗根肿病大白菜的选育。


技术研发人员：张晓伟 杨双娟 张文静 原玉香 苏贺楠 王志勇 魏小春 赵艳艳 李林 王坐京
受保护的技术使用者：河南省农业科学院园艺研究所
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/8/24