一种碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶及其制备方法

1.本发明属于葡甘聚糖降解技术领域，具体涉及一种碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶及其制备方法。


背景技术：

2.魔芋(amorphophallus albus)又名“蒟篛”，是天南星科(araceae)魔芋属(amorphophallus blume)多年生宿根草本植物，地下茎呈球茎状，叶片呈伞状，是亚洲常见的食物来源和传统药物。中国是魔芋的主要生产国之一，随着市场对魔芋粉的需求量越来越大，我国每年的魔芋产量都在不断增加。魔芋较其它植物资源，富含独特营养成分葡甘聚糖，经脱水烘干的魔芋片，其葡甘聚糖含量高达50％以上。魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，kgm)是一种从魔芋中分离的中性杂多糖，是魔芋的主要活性成分，由d-葡萄糖与d-甘露糖以1:1.5～1:1.6的比率由β-1,4糖苷键连接而成。魔芋葡甘聚糖对人体有很好的保健功能，是一种重要的膳食纤维，可用作“瘦身”食品。但是天然的大分子魔芋葡甘聚糖粘度大，吸水膨胀率高，直接食用难以下咽，自身带有异味，加工魔芋豆腐等凝胶食品时须用碱液处理，这些大大限制了魔芋葡甘聚糖利用和食用。魔芋葡甘低聚糖(kgm oligosaccharides，kgos)是kgm非彻底降解的产物，由葡萄糖(glucose，g)和甘露糖(mannose，m)构成，属于功能性低聚糖。相比于kgm，kgos的粘度显著降低，具有更高的水溶性、热量低、性能稳定，更有利于食品加工。此外，kgos还具有优异的益生元功能，对改善肠道微生物结构有促进作用，可广泛应用于食品与保健品。
3.近年来大量研究表明，魔芋葡甘聚糖经化学或生物水解方法可获得大量魔芋葡甘低聚糖，常用于魔芋葡甘聚糖降解的酶有纤维素酶、β-甘露糖酶和葡聚糖酶，不同种类的酶对魔芋葡甘聚糖的降解条件和效果不同。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，纤维素酶的组成比较复杂，一般作用温度为40～50℃，最终分解产物为葡萄糖；β-甘露糖酶是一种酶类蛋白质，能够催化β-甘露糖苷的水解反应，作用温度为45～55℃，能将β-甘露糖苷分解成葡萄糖和甘露糖；葡聚糖酶是一种能够降解葡聚糖的酶类蛋白质，作用温度为50～55℃，能将葡聚糖水解成葡萄糖单元。以上三种酶系也存在着一些缺点：首先，它们的最佳降解温度较低，不利于工厂在适宜温度下进行酶解反应；其次，它们只能获得葡萄糖单糖单元，无法获得葡甘露低聚糖，降低了生理功能；最后，它们的酶效率较低，需要较长时间才能完成降解反应。


技术实现要素：

4.为了解决以上问题，本发明提供了一种耐高温且水解效果明显的魔芋葡甘聚糖降解酶及其制备方法。该酶的最佳降解温度较高，可在高温条件下进行酶解反应，提高了反应效率，以便于魔芋高温加工，在魔芋葡甘聚糖降解的同时去除魔芋中的生物碱等有害物质；该酶能够在碱性条件下进行酶解反应，扩大了反应条件范围，提高了反应效率和速度；该酶能够将魔芋葡甘聚糖降解为2～14分子量的寡糖单元，提高了其生理活性功能和原料利用
率。
5.针对上述目的，本发明采用的魔芋葡甘聚糖降解酶由下述方法制备得到：
6.步骤1：菌种获取
7.取已被微生物水解为液体的魔芋豆腐，离心，取沉淀于无菌生理盐水中震荡均匀，过5～20μm滤纸，获得混合菌液；将混合菌液均匀涂布在基础培养基上，在30～45℃培养至有肉眼可见的菌落；观察基础培养基菌落形态，分别将不同形态的菌体再转接于基础培养基上，平板划线、纯化培养。在30～45℃培养至平板上有肉眼可见的菌落；重复平板划线、纯化培养3～5次，至所分离到的菌株为单一菌落，分别将所述菌株再转接于种子培养基上，30～45℃培养24～36h，选取培养基由透明半固态变为淡黄色液体状态、无明显魔芋气味的纯化菌株，即为嗜碱芽孢杆菌，4℃保存。
8.步骤2：菌种活化
9.将4℃保存的嗜碱芽孢杆菌转接到接种于种子培养基中，于30～45℃摇床培养24～36h，得到活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液。
10.步骤3：菌悬液制备
11.取步骤2活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液，离心，无菌水清洗，将沉淀转接于扩大培养基中，接种量为5％～15％，于30～45℃摇床培养24～36h；然后将扩大培养后的菌液置于高速离心机离心，用生理盐水洗涤、离心活菌体；最后将收集的菌体用无菌生理盐水稀释至107～109cfu/ml，得到菌悬液，于4℃保存。
12.步骤4：酶的提取
13.将菌悬液进行冻融和超声处理后，离心，收集上清液即为粗酶液；所述冻融的操作为：将菌悬液在-30～-10℃下冷冻，每4h取出，待溶液中心温度恢复至室温后，继续冷冻，反复4～8次；超声处理条件为：5号变幅杆，功率比50％～70％，运行时间10～20min，每超声开30s，关30s，运行温度10～30℃。
14.步骤5：酶的浓缩和干燥
15.将粗酶液置于超高速离心机中离心，取上清液，在-0.08～-0.09pa、50～80℃真空热风干燥，得到魔芋葡甘聚糖降解酶。
16.上述步骤1中，所述已被微生物水解为液体的魔芋豆腐的生产过程为：将制备好的固态魔芋豆腐装入塑料袋中，添加ph 11的ca(oh)2悬浊液浸没，密封包装，经85℃、30min湿热杀菌，常温储存3～5d后获得已被微生物水解为液体的魔芋豆腐。
17.上述步骤1中，所述基础培养基是将20.0g葡萄糖、10.0g蛋白胨、2.0g nano3、0.5g mgso4·
7h2o、1.5g kh2po4、15.0g琼脂加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min获得。
18.上述步骤2中，所述种子培养基是将10～20g葡甘聚糖、4～9g胰蛋白胨、5～12g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min获得；所述扩大培养基是将15～30g葡甘聚糖、7～15g胰蛋白胨、5～12g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min获得。
19.上述步骤3中，优选接种量为10％。
20.上述步骤4中，优选冻融操作为：将菌悬液在-20
±
2℃下冷冻，每4h取出，待溶液中心温度恢复至室温后，继续冷冻，反复6次。
21.上述步骤4中，优选超声处理条件为：5号变幅杆，功率比60％，运行时间10min，每超声开30s，关30s，运行温度20℃。
22.本发明的有益效果如下：
23.本发明从已被微生物水解为液体的魔芋豆腐中分离得到一株在强碱性条件下耐85℃芽孢细菌，该菌对魔芋葡甘聚糖有很好的水解作用；将该菌扩大培养后，收集细胞，再经过细胞破碎等工艺制成葡甘聚糖降解酶。本发明得到的葡甘聚糖降解酶耐高温，以此酶进行魔芋葡甘聚糖的水解，水解效果明显，在65℃保温4h时仍具有80％以上活力，降解产物为2～14个分子的寡糖，能够维护肠道健康、调节血糖和胆固醇水平、促进免疫系统功能等。在实际加工中，高温处理便于在降解魔芋的同时去除魔芋中的生物碱等有害物质，去除魔芋本身的腥味，增加魔芋浆的营养价值。高温降解处理对于发挥魔芋的功能作用，增大人体一次性对魔芋的食用量、脱除魔芋异味都具有一定的实践意义，有望开发出高效快速的葡甘聚糖水解酶食品添加剂，为魔芋产业的开发和利用做出更大的贡献。
附图说明
24.图1是芽孢s-4菌株形态图。
25.图2是冻融后菌液中可溶性蛋白含量。
26.图3是冻融后菌液中魔芋葡甘聚糖降解酶活力。
27.图4是超声后菌液中可溶性蛋白含量。
28.图5是超声后菌液中魔芋葡甘聚糖降解酶活力。
29.图6是干燥方式对蛋白得率和酶活的影响。
30.图7是魔芋葡甘聚糖降解酶与β-葡聚糖酶作用条件对比。
31.图8是魔芋葡甘聚糖降解酶在65℃、ph 9.0条件下活性随时间变化。
32.图9是金属离子对酶活的影响。
33.图10是魔芋葡甘聚糖降解酶降解产物的maldi-tof-ms分析。
34.图11是魔芋葡甘聚糖降解酶降解产物的1h核磁共振谱。
35.图12是魔芋葡甘聚糖降解酶降解产物的
13
c核磁共振谱。
36.图13是底物浓度对魔芋葡甘聚糖降解酶降解率的影响。
37.图14是魔芋葡甘聚糖降解酶降解时间对粘度的影响。
具体实施方式
38.下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
39.为了确定本发明的工艺条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：
40.一、实验材料
41.魔芋葡甘聚糖：kgm干基含量大于99.5％。
42.基础培养基：将20.0g葡萄糖、10.0g蛋白胨、2.0g nano3、0.5g mgso4·
7h2o、1.5g kh2po4、15.0g琼脂加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min。
43.种子培养基：将10.0g葡甘聚糖、5.0g胰蛋白胨、10.0g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min。
44.扩大培养基：将20.0g葡甘聚糖、10.0g胰蛋白胨、10.0g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min。
45.二、测定方法
46.菌株的分离、纯化：平板划线法。
47.活菌数测定：将发酵液稀释后涂布固体培养基平板，置30℃恒温箱培养14h，计数菌落数(以每个平皿20～300个为宜)。
48.蛋白含量：采用考马斯亮蓝法；
[0049][0050]
式中：c——样品测得od
650
值对应标准曲线的含量，单位：μg；
[0051]
n——稀释倍数；
[0052]
w——样品重量，单位：g。
[0053]
降解葡甘聚糖的酶活力测定：采用3,5-二硝基水杨酸显色法。向25ml待测试管和25ml空白试管中分别加入4ml0.5％(w/v)魔芋葡甘聚糖的磷酸缓冲溶液(ph 8.0)，65℃水浴中预热2min，向待测管中加入1g酶反应5min，迅速将所有试管转入100℃沸水浴中，5min后向空白管中加入1g酶，再向所有试管中加入3ml3,5-二硝基水杨酸(dns)试剂反应10min，迅速冷却后测定od
540
。1g酶于65℃、ph 8.0条件下，1h液化1g魔芋葡甘聚糖，即为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
[0054][0055]
式中：a——样品测得od
540
值；
[0056]
n——酶液的稀释倍数；
[0057]
10——反应时间；
[0058]
w——样品水分百分含量(％)。
[0059]
三、实验内容
[0060]
1、魔芋葡甘聚糖降解菌株的分离和鉴定
[0061]
取已被微生物水解为液体的魔芋豆腐，于6000r/min离心10min，取沉淀于无菌生理盐水中，震荡，过10μm滤纸，获得混合菌液；将混合菌液均匀涂布在基础培养基上，在40℃培养至有肉眼可见的菌落。观察培养基形态、菌落形态，分别将不同形态的菌种转接于基础培养基上平板划线、纯化培养，在40℃培养至有肉眼可见的菌落；重复平板划线、纯化培养3～5次至所分离到的菌株为单一菌落。发现有些菌落对培养基有水解作用，出现半透明水浸斑，分别命名为芽孢s-1、s-2、s-3、s-4、s-5；分别将其转接于种子培养基上，40℃培养24h，测定培养液降解魔芋葡甘聚糖的酶活力，选取具有高酶活的菌株芽孢s-4作为目标菌株。该菌落培养基呈淡黄色液体状态、无明显魔芋气味；呈白色，菌落形状不规则，表面光滑，用接种环挑取时感觉粘稠。再将该菌转接到扩大培养基上，40℃培养24h，发现该菌株在扩大培养基上生长很好，并将固态粘稠的培养基变成液态状。对该菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察结果，并对该菌株的部分生理生化性质进行检测。结果见图1和表1。从中初步判
断为芽孢细菌。
[0062]
表1分离菌株生理生化性质
[0063][0064]
注：“+”表示阳性反应；
“‑”
表示阴性反应。
[0065]
将上述得到的芽孢细菌进行种子培养和扩大培养后，利用16srdna序列比对法对筛选到的菌株进行分子生物学鉴定。具体方法如下：
[0066]
提取该菌株的基因组dna，通过pcr进行16s rdna的基因克隆。用正向引物5
′‑
agagttgatcmggctcagga-3
′
和反向引物5
′‑
tacggytaccttgtt acgattcg-3
′
对菌株进行pcr扩增。将pcr扩增产物回收后进行测序。将测序结果提交至国家生物技术信息中心的数据库中，通过美国gen bank核酸序列比对工具，对菌株16s rdna基因序列进行同源性比对。
[0067]
结果表明，该菌株与嗜碱芽孢杆菌(bacillus alcalophilus)亲缘关系最近，相似度为98％。
[0068]
2、冻融温度和时间对可溶性蛋白含量及酶活力的影响
[0069]
将上述鉴定后的4℃储存的嗜碱芽孢杆菌接种于锥形瓶内的基础培养基中，锥形瓶装液量1/5，于180r/min、40℃摇床培养24h。取活化后的嗜碱芽孢杆菌10ml种子液，离心，无菌水清洗2～3次，将沉淀转接于扩大培养基中，于180r/min、40℃摇床培养24h。将扩大培养后的菌液置于高速离心机，于8000r/min离心30min，用生理盐水洗涤活菌体3次，每次洗涤都离心10min，菌体收率为3％～4％；最后将收集的菌体用无菌生理盐水稀释至108cfu/ml，得到菌悬液，于4℃保存。
[0070]
将上述4℃保存菌悬液在不同温度下冻融处理不同时间(每4h取出，缓慢升温至室温后重新冷冻)，将样品缓慢升温至30℃后测定冻融温度和作用时间对活菌数、可溶性蛋白含量及酶活力的影响。结果见表2和图2、图3。
[0071]
表2不同冻融温度与时间对活菌数的影响
[0072][0073][0074]
如表2及图2、图3可见，冻融时活菌数、蛋白酶活力和可溶性蛋白质含量随着温度下降和时间延长，在-20℃处理36h时，活菌数仅2.68
×
103cfu/ml，此时可溶性蛋白质含量和蛋白酶活力与-10℃处理组无显著差异，分别为6.73
±
0.09mg/g和182.54
±
4.15u/g，且与更低温度处理组相比结果存在极显著性差异(p《0.01)。根据试验可得，在-20℃的冻融温度处理24h为最佳冻融条件，活菌数较少，可溶性蛋白含量》5mg/g。
[0075]
3、超声对蛋白含量及酶活力的影响
[0076]
对上述最佳冻融条件冻融后的溶液在不同超声功率比下超声处理不同时间，固定超声运行温度20℃，测定超声功率比和时间对可溶性蛋白含量及酶活力的影响。结果见图4、图5。
[0077]
从图可知，超声处理0～20min时，可溶性蛋白含量随超声处理时间的增加逐渐增大，当超声时间为20min时，可溶性蛋白含量最大达7.48
±
0.11mg/g。这主要是因为超声作用改变了蛋白质的空间构象，使其分子结构变得疏松，蛋白分子与水之间的接触面积以及相互作用力增大，可溶性蛋白含量增多，从而溶解度显著提高。而葡酶活力随时间的延长，先增大后减小又趋于平稳，当超声时间为10min时，酶活力最大，为211.63
±
3.57u/g。根据试验可得，在超声功率比为60％，处理10～40min后的酶活力较高，可溶性蛋白含量》7mg/g。超声功率比为60％，处理10min为葡甘聚糖降解酶最佳提取条件。
[0078]
4、酶的干燥
[0079]
将上述最佳超声条件超声处理后的菌液置于超高速离心机中，于10000r/min离心30min，取上清液，分别以30kpa、-60℃真空冷冻干燥(zl)，-0.08～-0.09pa、60℃真空热风干燥(zr6)，-0.08～-0.09pa、80℃真空热风干燥(zr8)，60℃热风干燥(r6)，80℃热风干燥(r8)，2w/g、60℃微波干燥(w2)，4w/g、60℃微波干燥(w4)，测定干燥方式和温度对酶得率和
酶活力的影响。结果见图6。
[0080]
由实验结果可得，微波处理得率较高，但真空处理下的活性更高。经2w/g、60℃微波干燥所得的葡甘聚糖降解酶制剂，得率最高，为16.35％；经-0.08～-0.09pa、60℃真空热风干燥所得的葡甘聚糖降解酶制剂，酶活力最高，为199.12u/g。以30kpa、-60℃真空冷冻干燥(zl)，-0.08～-0.09pa、60℃真空热风干燥(zr6)，-0.08～-0.09pa、80℃真空热风干燥(zr8)获得的酶粉活性较高；综合试验结果及能量消耗最低原则，选择-0.08～-0.09pa、60℃真空热风干燥。
[0081]
实施例1
[0082]
步骤1：菌种获取
[0083]
将制备好的固态魔芋豆腐装入塑料袋中，添加ph＝11的ca(oh)2悬浊液浸没，密封包装，经85℃、30min湿热杀菌，常温储存4d后获得已被微生物水解为液体的魔芋豆腐。取已被微生物水解为液体的魔芋豆腐，于6000r/min离心10min，取沉淀于无菌生理盐水中，震荡，过10μm滤纸，获得混合菌液；将混合菌液均匀涂布在基础培养基上，在40℃培养至有肉眼可见的菌落。观察培养基形态、菌落形态，分别将不同形态的菌种转接于基础培养基上平板划线、纯化培养，在40℃培养至有肉眼可见的菌落；重复平板划线纯化培养3～5次至所分离到的菌株为单一菌落，选取培养基呈淡黄色液体状态、无明显魔芋气味的菌株作为目标菌株，并经鉴定为嗜碱芽孢杆菌，4℃保存。
[0084]
步骤2：菌种活化
[0085]
将4℃保存的嗜碱芽孢杆菌转接到接种于锥形瓶内的种子培养基中，锥形瓶装液量1/5，于180r/min、40℃摇床培养24h，得到活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液。
[0086]
步骤3：菌悬液制备
[0087]
取10ml步骤2活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液，于8000r/min离心30min，无菌水清洗2～3次。将沉淀转接于扩大培养基中，菌种接种量为10％，于180r/min、40℃摇床培养24h。然后将扩大培养后的菌液置于高速离心机，于8000r/min离心30min，用生理盐水洗涤活菌体3次，每次洗涤都离心10min，菌体收率为3％～4％；最后将收集的菌体用无菌生理盐水稀释至108cfu/ml，得到菌悬液，于4℃保存。
[0088]
步骤4：酶的提取
[0089]
将菌悬液进行冻融和超声处理，使细胞破碎，释放出胞内的所有物质；然后8000r/min离心10min收集上清液，即为粗酶液。其中，冻融的操作为：将菌悬液放在-20
±
2℃下冷冻，每4h取出，待溶液中心温度恢复至室温后，继续冷冻，反复6次；超声处理条件为：5号变幅杆，功率比60％，运行时间10min(每超声开30s，关30s)，运行温度20℃。
[0090]
步骤5：酶的浓缩和干燥
[0091]
将粗酶液置于超高速离心机中，于10000r/min离心30min，取上清液，在-0.08～-0.09pa、60℃真空热风干燥，得到魔芋葡甘聚糖降解酶。
[0092]
为了证明本发明的有益效果，对实施例1制备的魔芋葡甘聚糖降解酶进行各种性能测试，具体实验如下：
[0093]
1、魔芋葡甘聚糖降解酶的活力
[0094]
将实施例1制备的魔芋葡甘聚糖降解酶与β-葡聚糖酶进行不同降解时间、温度和ph下的酶活力对比测定，结果见图7。由图可见，随降解时间的延长，两种酶活均逐渐增加，
魔芋葡甘聚糖降解酶活力始终强于β-葡聚糖酶；在48h时魔芋葡甘聚糖降解酶活力达最大。魔芋葡甘聚糖降解酶在温度为55～75℃时活力较高，当温度低于55℃时，酶活力较低；β-葡聚糖酶在温度为45～55℃时活力较高，当温度高于55℃时，酶活力锐减；显然，温度是酶活的主要影响因素。当初始ph值小于7时，魔芋葡甘聚糖降解酶的活力较低；当ph值在7与10之间时，魔芋葡甘聚糖降解酶活力较高；在ph在8～9时酶活基本保持稳定。β-葡聚糖酶活力随ph的上升逐渐下降，在ph为6时活力较大。
[0095]
2、魔芋葡甘聚糖降解酶的热耐受性
[0096]
将20％(w/v)魔芋葡甘聚糖溶液置于65℃、ph为9.0的水浴锅中预热30min，加入0.3％(w/v)葡甘聚糖降解酶，测定葡甘聚糖降解酶活力随时间的变化，如图8。
[0097]
试验结果表明，提取得到的葡甘聚糖降解酶在20～80℃的条件下具有活力和热稳定性；在65℃条件下，活性可保持4h不变，24h后有80％以上的活性；同时，65℃时葡甘聚糖降解酶在2～4h内可以有效水解魔芋葡甘聚糖，将其中多糖组分高效降解为单糖或者寡糖成分，从而提高葡甘聚糖的消化率和生物可及性。
[0098]
3、金属离子对酶活的影响
[0099]
分别以20g/ml魔芋葡甘聚糖水溶液配置终浓度为10mm的金属离子(cu
2+
、li
+
、k
+
、na
+
、ba
2+
)5
×
pp2c缓冲液，调节ph＝8.0，以不添加其他金属离子的pp2c缓冲液配置酶活体系为对照，测定酶活力，结果见图9。
[0100]
图9显示了金属离子对酶活力的影响，以不含金属离子的酶活反应体系为对照，发现li
+
和ba
2+
对酶活力起到了较为明显的促进作用，k
+
和na
+
对其活力的影响不明显。当反应体系中加入cu
2+
时，酶活力被极大的抑制，推测原因可能是cu
2+
与酶的活性中心结合，改变了酶的构象，影响了酶与底物的结合能力，导致酶活力降低。
[0101]
4、葡甘聚糖降解酶降解产物分析
[0102]
将葡甘聚糖降解酶降解产物进行hplc分析，发现产物多糖的分子量在8～500kda，并发现较多分子量介于二糖和三糖之间的水解产物。hplc用于测定葡甘聚糖降解酶降解产物的分子量，后续对经葡甘聚糖降解酶降解得到的kgos进一步分析其结构。
[0103]
图10显示了降解产物的maldi-tof-ms结果，根据质荷比分析，发现葡甘聚糖降解酶作用下产生了典型的低聚糖(4.7
×
105da)和少量相应的氧化低聚糖(9.2
×
103da)。所得kgos离子的质荷比值在365.755～2394.903之间，其聚合度为2～14，其中聚合度为3的低聚物是主要产物；同时，能获得少量醛酸和大量的天然低聚糖。由于maldi-tof ms只是对存在的低聚物的筛选，且具有相同聚合度的低聚糖具有相同的分子量，因此通过层析及高效液相色谱等方法对kgos进行更详细的表征。
[0104]
葡甘聚糖降解酶降解产物一维(1h和
13
c)nmr如图11、12所示，一维1h nmr中化学位移值在2.11ppm、2.15ppm的信号和一维
13
c nmr中化学位移值在23.11ppm、176.16ppm的信号证明了乙酰基的存在。经二维nmr表征，由葡甘聚糖降解酶降解产物中含有一种以上的低聚糖，其中具有还原性末端葡萄糖和还原性末端甘露糖。不同的酶决定最终产物的结构特征，推测葡甘聚糖降解酶主要成分为内切葡聚糖酶，可以分解kgm并产生kgos。
[0105]
5、底物浓度对酶解率的影响
[0106]
当酶添加量为0.2％(活力为200
±
20u/g)，作用温度为65℃，酶解时间为12h时，底物浓度对酶解率的影响如图13所示。从整体上看，kgm的酶解率随底物浓度的增大有下降的
趋势。当底物浓度从10g/l上升至20g/l时，酶解率随接菌量增加大幅度降低；当底物浓度继续增加至50g/l时，酶解率没有明显的变化。当kgm浓度过高时，部分kgm无法充分吸水溶胀，酶解体系中同时存在溶液和kgm固体颗粒，均一性受到影响，阻碍了酶分子与kgm分子的结合，酶促反应速率降低；同时，随着kgm浓度的升高，酶分子可以与更多的kgm分子结合，酶的降解速率加快；因而kgm的降解速率没有大幅度变化。
[0107]
6、酶解时间对粘度的影响
[0108]
当底物浓度为20g/l，酶添加量为0.2％(活力为200
±
20u/g)，作用温度为65℃时，酶解时间对粘度的影响如图14所示。从整体上看，随着酶解时间的延长，粘度呈现先迅速下降后趋于稳定的趋势。溶液初始粘度为2430.33mpa
·
s；在0～4h内，粘度下降速率最快；在4h时，溶液粘度下降至50.16mpa
·
s，此时的酶解率为2.736％；在4～10h时，粘度的下降速率较慢，并逐渐趋于平稳；在10h时，溶液的酶解率为38.77％。

技术特征：
1.一种碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤1：菌种获取取已被微生物水解为液体的魔芋豆腐，离心，取沉淀于无菌生理盐水中震荡均匀，过5～20μm滤纸，获得混合菌液；将混合菌液均匀涂布在基础培养基上，在30～45℃培养至有肉眼可见的菌落；观察基础培养基菌落形态，分别将不同形态的菌体再转接于基础培养基上，平板划线、纯化培养。在30～45℃培养至平板上有肉眼可见的菌落；重复平板划线，纯化培养3～5次，至所分离到的菌株为单一菌落，分别将所述菌株再转接于种子培养基上，30～45℃培养24～36h，选取培养基由透明半固态变为淡黄色液体状态、无明显魔芋气味的纯化菌株，即为嗜碱芽孢杆菌，4℃保存；步骤2：菌种活化将4℃保存的嗜碱芽孢杆菌转接到接种于种子培养基中，于30～45℃摇床培养24～36h，得到活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液；步骤3：菌悬液制备取步骤2活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液，离心，无菌水清洗沉淀物，将沉淀转接于扩大培养基中，接种量为5％～15％，于30～45℃摇床培养24～36h；然后将扩大培养后的菌液置于高速离心机离心，用生理盐水洗涤、离心活菌体；最后将收集的菌体用无菌生理盐水稀释至107～109cfu/ml菌悬液，于4℃保存；步骤4：酶的提取将菌悬液进行冻融和超声处理后，离心，收集上清液即为粗酶液；所述冻融的操作为：将菌悬液在-30～-10℃下冷冻，每4h取出，待溶液中心温度恢复至室温后，继续冷冻，反复4～8次；超声处理条件为：5号变幅杆，功率比50％～70％，运行时间10～20min，每超声开30s，关30s，运行温度10～30℃；步骤5：酶的浓缩和干燥将粗酶液置于超高速离心机中离心，取上清液，在-0.08～-0.09pa、50～80℃真空热风干燥，得到魔芋葡甘聚糖降解酶。2.根据权利要求1所述的碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述已被微生物水解为液体的魔芋豆腐的生产过程为：将制备好的固态魔芋豆腐装入塑料袋中，添加ph＝11的ca(oh)2悬浊液浸没，密封包装，经85℃、30min湿热杀菌，常温储存3～5d。3.根据权利要求1所述的碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述基础培养基是将20.0g葡萄糖、10.0g蛋白胨、2.0g nano3、0.5g mgso4·
7h2o、1.5g kh2po4、15.0g琼脂加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min获得。4.根据权利要求1所述的碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述种子培养基是将10～20g葡甘聚糖、4～9g胰蛋白胨、5～12g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min获得；所述扩大培养基是将15～30g葡甘聚糖、7～15g胰蛋白胨、5～12g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0
±
0.2，121℃灭菌20min获得。5.根据权利要求1所述的碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步
骤3中，接种量为10％。6.根据权利要求1所述的碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述冻融操作为：将菌悬液在-20
±
2℃下冷冻，每4h取出，待溶液中心温度恢复至室温后，继续冷冻，反复6次。7.根据权利要求1所述的碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步骤4中，超声处理条件为：5号变幅杆，功率比60％，运行时间10min，每超声开30s，关30s，运行温度20℃。

技术总结
本发明公开了一种碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶及其制备方法，属于葡甘聚糖降解技术领域。本发明从已被微生物水解为液体的魔芋豆腐中分离提取到一株降解葡甘聚糖的嗜碱芽孢杆菌，经扩大培养、收集、破碎、干燥后制得葡甘聚糖降解酶。本发明葡甘聚糖降解酶对魔芋葡甘聚糖的水解效果显著，在65℃保温4h时仍具有80％以上活力，降解产物为2～14个分子的寡糖，具有维护肠道健康、调节血糖和胆固醇水平等功能；其高温降解便于降低魔芋粘度，同时去除生物碱等有害物质，对于发挥魔芋的功能作用，增加人体一次性对魔芋的食用量、脱除魔芋异味都具有践意义，有望开发出高效快速的葡甘聚糖水解酶食品添加剂，为魔芋产业的开发和利用做出更大的贡献。更大的贡献。更大的贡献。


技术研发人员：孙楠 张宝善 张薇 张钰瑶 赵育 姚苏贺 宋金枝
受保护的技术使用者：陕西师范大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/24