甘蓝型油菜BnaTT10基因及其突变体的制备与应用

甘蓝型油菜bnatt10基因及其突变体的制备与应用
技术领域
1.本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜bnatt10基因及其突变体的制备与应用。


背景技术：

2.油菜是我国第五大作物、第一大油料作物，常年种植面积约1.2亿亩，年生产“最健康的大宗食用植物油”菜籽油500多万吨，约占我国食用植物油的55％，同时可提供800多万吨的饲料饼粕。此外，油菜营养体可用作蔬菜和绿肥；油菜花具有观赏价值，也可作为蜜源应用于生产。
3.籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。相比黑籽，黄籽种皮变薄、皮壳率降低、种皮中木质素含量降低、含油量和蛋白含量增加；因此，黄籽的出油率更高，而且饼粕的营养价值也会提高。由于种皮中花青素含量减少，黄籽在榨油时加工过程更为简单，不仅节约了加工成本，还可以减少营养物质的流失。虽然在白菜型油菜和芥菜型油菜中均有较多的黄籽自然资源，但甘蓝型油菜还没有发现天然的黄籽材料。研究者们通过远缘杂交成功获得了甘蓝型黄籽油菜，但黄籽度不高，且黄籽表型易受环境影响，选育效率低，育种周期长，而且可能存在不利的连锁累赘。由于甘蓝型油菜是我国生产上种植的最主要的类型，因此在甘蓝型油菜中鉴定黄籽重要功能基因、研究其形成的调控机理、并创建黄籽种质资源，将具有很大的应用价值及前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供甘蓝型油菜bnatt10基因及其突变体的制备与应用。本发明通过crispr/cas9基因编辑技术靶向敲除bnatt10基因的3个同源拷贝(bnatt10.a06、bnatt10.a02和bnatt10.c02)，并获得了bnatt10基因突变的甘蓝型油菜突变体，研究发现，三纯合突变体株系的成熟种子种皮变黄、变薄且木质素含量减少，同时含油量也显著升高，因此可将bnatt10基因应用于油菜育种中以改良油菜种子性状，具有巨大的应用潜力和前景，为油菜品质育种提供了新的种质资源。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
6.本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜bnatt10基因，所述bnatt10基因包括3个同源拷贝基因，分别为：如seq id no.1所示的bnatt10.a06基因、如seq id no.2所示的bnatt10.a02基因，以及如seq id no.3所示的bnatt10.c02基因。
7.进一步地，所述bnatt10.a06基因的cdna序列如seq id no.4所示，所述bnatt10.a02基因的cdna序列如seq id no.5所示，bnatt10.c02基因的cdna序列如seq id no.6所示。
8.本发明的目的之二在于提供一种甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，所述突变体由所述3个同源拷贝基因同时发生基因编码区内的突变获得。
9.进一步地，利用crispr/cas9技术敲除所述3个同源拷贝基因。
10.进一步地，包括以下步骤：
11.步骤一：获取所述bntt10基因片段；
12.步骤二：针对所述bntt10基因的核苷酸序列设计sgrna，并以sgrna为靶序列，分别设计合成正向和反向寡核苷酸序列，退火形成双链，制成oligo二聚体，将所述oligo二聚体与cas9载体连接，构建得到植物表达载体；
13.步骤三：将步骤二中构建的表达载体转化至甘蓝型油菜株系中，获得转基因油菜植株；
14.步骤四：对转基因油菜植株进行检测，确定基因型；
15.步骤五：转基因油菜植株自交，获得bnatt10.a06基因、bnatt10.a02基因以及bnatt10.c02基因被同时敲除的三纯合突变体。
16.进一步地，所述sgrna包括：
17.特异性靶向甘蓝型油菜bnatt10.a02基因的sgrna1，其核苷酸序列如seq id no.18所示；
18.特异性靶向bnatt10.c02基因的sgrna3，其核苷酸序列如seq id no.20所示；
19.特异性靶向甘蓝型油菜bnatt10.a06基因的sgrna2和sgrna4，其核苷酸序列分别如seq id no.19和seq id no.21所示。
20.进一步地，所述寡核苷酸序列包括：
21.根据sgrna1设计的寡核苷酸序列sgrna1-f和sgrna1-r如seq id no.22-23所示；
22.根据sgrna2设计的寡核苷酸序列sgrna2-f和sgrna2-r如seq id no.24-25所示；
23.根据sgrna3设计的寡核苷酸序列sgrna3-f和sgrna3-r如seq id no.26-27所示；
24.根据sgrna4设计的寡核苷酸序列sgrna4-f和sgrna4-r如seq id no.28-29所示。
25.进一步地，步骤二中采用pylcrispr/cas9多重基因组靶向载体系统构建所述植物表达载体。
26.进一步地，步骤三中将建的表达载体转化至半冬性甘蓝型油菜纯系j9707中。
27.本发明的目的之三在于提供所述甘蓝型油菜bnatt10基因在油菜育种中的应用。
28.本发明的目的之四在于提供所述甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法在油菜育种中的应用。
29.进一步地，所述油菜育种包括：甘蓝型油菜黄籽、薄种皮、种子高含油量方面的育种。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用crispr/cas9技术靶向bnatt10的3个同源基因(bnatt10.a06、bnatt10.a02和bnatt10.c02)，通过遗传转化和突变体后代筛选获得了不含t-dna插入的三拷贝纯合突变体，并对这些突变体表型鉴定及品质分析。研究发现，bnatt10基因的三拷贝纯合突变体可以产生黄籽表型，种皮变薄，种皮木质素含量降低，含油量也显著增加。因此可将bnatt10基因应用于油菜育种中以改良油菜种子性状，具有巨大的应用潜力和前景，为油菜品质育种提供新的种质资源。
附图说明
31.图1为本发明实施例中bnatt10的基因结构图及利用crispr/cas9技术构建的载体图；
32.图2为本发明实施例中转化植株t3代三纯合突变体tt10-1、tt10-13和tt10-43的sgrna1-4位点核苷酸；
33.图3为本发明实施例中野生型和bnatt10突变体的表型图，图3-a为三纯合突变体与野生型的成熟种子表型，图3-b为野生型、三纯合突变体、双纯合突变体和单纯合突变体不同发育时期的种皮染色结果，其中左边为香草醛染色，右边为dmaca染色；
34.图4为本发明实施例中野生型和bnatt10突变体的种皮发育及种皮厚度测定结果，图4-a为三纯合突变体与野生型番红和固绿染色的石蜡切片和成熟种子的切面，图4-b为三纯合突变体与野生型的种皮厚度测量结果，图4-c为三纯合突变体和野生型皮壳率统计结果，图4-d为三纯合突变体和野生型成熟种子及种皮中的木质素含量测定结果；
35.图5为本发明实施例中无转基因成分的三纯合突变bnatt10转化株系的含油量分析结果，图5-a为转化株系的含油量，图5-b为转化株系脂肪酸组分摩尔质量百分比。
具体实施方式
36.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例
38.本实施例利用crispr/cas9技术靶向敲除bnatt10的3个同源基因(bnatt10.a06、bnatt10.a02和bnatt10.c02)，原理如附图1所示，其中图1a灰色方框代表外显子，黑色实线代表内含子；bnatt10基因的3个同源拷贝均包含6个外显子，5个内含子。基因模型中的垂直线表示靶位点。s1～s4展示了靶点序列，下划线字体表示pam区；图1b为bnatt10载体的构建图。通过遗传转化得到突变体单株，经过自交分离，最后获得纯合突变体；并对获得的突变体表型鉴定，含油量脂肪酸测定。具体过程如下。
39.1、基因克隆：
40.种植半冬性油菜纯系j9707(种子来自中国武汉油菜籽国家工程研究中心)，从鲜嫩叶片中提取基因组dna，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，并用紫外分光光度计检测dna浓度。从提取的dna中克隆分离得到bnatt10.a06、bnatt10.a02和bnatt10.c02的基因组dna和编码序列。bnatt10.a06、bnatt10.a02和bnatt10.c02基因的基因组核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。bnatt10.a06、bnatt10.a02和bnatt10.c02基因的全长cdna序列分别如序列表seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。
41.其中基因克隆所采用的引物包括：
42.bnatt10.a06基因组核苷酸序列克隆的引物对为hl-11/hl-12，其序列如seq id no.7-8所示；
43.bnatt10.a06基因全长cdna序列克隆的引物对为bntt10-17/bntt10-18，其序列如seq id no.9-10所示；
44.bnatt10.a02基因组核苷酸序列克隆的引物对为bntt10-7/bntt10-8和hl-15/hl-16，其序列如seq id no.11-14所示；
45.bnatt10.a02基因全长cdna序列克隆的引物对为bntt10-7/hl-16，其序列如seq id no.11和seq id no.14所示；
46.bnatt10.c02基因组核苷酸序列克隆的引物对为hl-17/hl-18和hl-19/hl-16，其序列如seq id no.15-17和seq id no.14所示；
47.bnatt10.c02基因全长cdna序列克隆的引物对为hl-17/hl-16，其序列如seq id no.15和seq id no.14所示。
48.2、载体构建
49.对分离得到的bnatt10.a06、bnatt10.a02和bnatt10.c02的基因组dna和cdna序列进行分析，使用crispr-p程序在bnatt10.a06基因上设计了靶基因sgrna2和sgrna4(如seq id no.19和seq id no.21所示)；使用crispr-p程序在bnatt10.a02和bnatt10.c02基因上设计了靶基因sgrna1和sgrna3(如seq id no.18和seq id no.20所示)，sgrna1和sgrna3在bnatt10.a02和bnatt10.c02拷贝上完全一样。
50.基于sgrna1-4分别设计相应的正向和反向寡核苷酸序列，包括：
51.根据sgrna1设计的寡核苷酸序列sgrna1-f和sgrna1-r如seq id no.22-23所示；
52.根据sgrna2设计的寡核苷酸序列sgrna2-f和sgrna2-r如seq id no.24-25所示；
53.根据sgrna3设计的寡核苷酸序列sgrna3-f和sgrna3-r如seq id no.26-27所示；
54.根据sgrna4设计的寡核苷酸序列sgrna4-f和sgrna4-r如seq id no.28-29所示。
55.运用pylcripsr/cas9多重基因组靶向载体系统进行载体构建，具体的载体构建流程参照相关文献：ma(2015b)a robust crispr/cas9 system forconvenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.mol plant,2015b,8:1274-1284。通过测序验证构建的载体。
56.3、遗传转化
57.用农杆菌介导的下胚轴遗传转化方法将构建好的载体转入半冬性甘蓝型油菜纯系j9707中，具体操作流程参照：武语笛(2015)白菜型油菜多室基因brclv3的功能研究。
58.4、突变体的检测：
59.(1)用特异性引物pb-l/pb-r对突变单株进行转基因的阳性鉴定，挑选出含有t-dna插入的阳性单株。pcr体系及程序参照朱恺毓(2017)利用crispr/cas9技术创建甘蓝型油菜多室突变体[硕士学位论文]，引物序列包括：
[0060]
pb-l：gcgcgcggtctcgctcgactagtatgg(如seq id no.30所示)；
[0061]
pb-r：gcgcgcggtctctaccgacgcgtatcc(如seq id no.31所示)。
[0062]
(2)根据目标片段附近的序列用primer premier5设计引物，引物确定后进行blast分析，保证没有其他同源序列。
[0063]
(3)用设计的目标片段附近的引物(如seq id no.32-37所示)进行pcr扩增。pcr体系及程序参照朱恺毓(2017)利用crispr/cas9技术创建甘蓝型油菜多室突变体[硕士学位论文]。
[0064]
(4)1％琼脂糖水平电泳对pcr扩增效果进行检测。
[0065]
(5)hi-tom测序对pcr扩增产物进行测序，确定转基因植株的基因型。
[0066]
5、自交纯合
[0067]
获得的t0代编辑单株自花授粉产生t1代和t2代，通过靶位点附近的pcr产物测序
得到单拷贝纯合、双拷贝纯合以及三拷贝纯合的突变体，这些纯合突变体都会引起移码突变产生功能丧失的蛋白质。经过pcr测序验证获得了一批不含t-dna插入的三纯合突变体株系tt10-1、tt10-13以及tt10-43，其sgrna1～4位点的核苷酸如图2所示。
[0068]
6、表型观察和测定
[0069]
对野生型和bnatt10突变体产生的种子进行表型观察，结果如图3-a所示。发现三纯合突变体表现为黄籽表型，而单纯合突变体以及双纯合突变体与野生型一样表现为黑籽表型。
[0070]
对野生型和bnatt10突变体不同发育时期种子的种皮进行香草醛和dmaca染色，如图3-b所示，发现在开花21天后野生型和bnatt10纯合突变体(三纯合突变体、双纯合突变体、单纯和突变体)的种皮均被染上红色(香草醛染色)和蓝色(dmaca染色)，并且在种子发育过程中，颜色越来越深。
[0071]
7、石蜡切片显微观察
[0072]
在开花期标记花，开花后28～49天收集种子用于石蜡切片的显微观察，结果见图4-a，番红固绿染色4个发育时期(28～49daf)的种子横切面表明：bnatt10三纯合突变体的栅栏层和第一层内皮层变薄，种皮的木质化程度降低；成熟种子中bnatt10三纯合突变体的种皮厚度和皮壳率均显著的低于野生型，结果如图4-b和c所示，而单纯合突变体和双纯合突变体相较于野生型无变化；进一步测定木质素含量，结果如图4d所示，bnatt10三纯合突变体的种子及种皮中的木质素含量均显著低于野生型。
[0073]
8、种子品质性状分析
[0074]
进一步对野生型和bnatt10三纯合突变体的种子含油量及比例进行分析，结果如图5所示，结果显示：bnatt10三纯合突变体的含油量相较于野生型显著提高，升高了3.08
±
0.73％；并且其中亚麻酸(c18:3)的摩尔百分比显著增加，说明bnatt10基因的突变可使甘蓝型油菜的含油量和亚麻酸的含量升高。
[0075]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.甘蓝型油菜bnatt10基因，其特征在于，所述bnatt10基因包括3个同源拷贝基因，分别为：如seq id no.1所示的bnatt10.a06基因、如seq id no.2所示的bnatt10.a02基因，以及如seq id no.3所示的bnatt10.c02基因。2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜bnatt10基因，其特征在于，所述bnatt10.a06基因的cdna序列如seq id no.4所示，所述bnatt10.a02基因的cdna序列如seq id no.5所示，bnatt10.c02基因的cdna序列如seq id no.6所示。3.一种甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，所述突变体由如权利要求1所述的3个同源拷贝基因同时发生基因编码区内的突变获得。4.根据权利要求3所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，利用crispr/cas9技术敲除所述3个同源拷贝基因。5.根据权利要求4所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：获取如权利要求1所述的bntt10基因片段；步骤二：针对所述bntt10基因的核苷酸序列设计sgrna，并以sgrna为靶序列，分别设计合成正向和反向寡核苷酸序列，退火形成双链，制成oligo二聚体，将所述oligo二聚体与cas9载体连接，构建得到植物表达载体；步骤三：将步骤二中构建的表达载体转化至甘蓝型油菜株系中，获得转基因油菜植株；步骤四：对转基因油菜植株进行检测，确定基因型；步骤五：转基因油菜植株自交，获得bnatt10.a06基因、bnatt10.a02基因以及bnatt10.c02基因被同时敲除的三纯合突变体。6.根据权利要求5所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，所述sgrna包括：特异性靶向甘蓝型油菜bnatt10.a02基因的sgrna1，其核苷酸序列如seq id no.18所示；特异性靶向bnatt10.c02基因的sgrna3，其核苷酸序列如seq id no.20所示；特异性靶向甘蓝型油菜bnatt10.a06基因的sgrna2和sgrna4，其核苷酸序列分别如seq id no.19和seq id no.21所示。7.根据权利要求6所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，所述寡核苷酸序列包括：根据sgrna1设计的寡核苷酸序列sgrna1-f和sgrna1-r如seq id no.22-23所示；根据sgrna2设计的寡核苷酸序列sgrna2-f和sgrna2-r如seq id no.24-25所示；根据sgrna3设计的寡核苷酸序列sgrna3-f和sgrna3-r如seq id no.26-27所示；根据sgrna4设计的寡核苷酸序列sgrna4-f和sgrna4-r如seq id no.28-29所示。8.根据权利要求5所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，步骤二中采用pylcrispr/cas9多重基因组靶向载体系统构建所述植物表达载体。9.如权利要求1或2所述的甘蓝型油菜bnatt10基因在油菜育种中的应用。10.如权利要求3-8任一项所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法在油菜育种中的应用。

技术总结
本发明公开了甘蓝型油菜BnaTT10基因及其突变体的制备与应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除BnaTT10基因的3个同源拷贝BnaTT10.A06、BnaTT10.A02和BnaTT10.C02，获得了BnaTT10基因突变的甘蓝型油菜突变体，研究发现三纯合突变体株系的成熟种子种皮变黄、变薄且木质素含量减少，成熟种子的含油量也显著升高，因此可将BnaTT10基因应用于油菜育种中以改良油菜种子性状，具有巨大的应用潜力和前景，为油菜品质育种提供了新的种质资源。为油菜品质育种提供了新的种质资源。为油菜品质育种提供了新的种质资源。


技术研发人员：范楚川 李淮琳 何菡子 余凯迪
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/8/24