多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶理性改造及其高效合成甘露糖-6-磷酸

1.本发明涉及多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶理性改造及其高效合成甘露糖-6-磷酸，属于生物催化技术领域。


背景技术：

2.甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosphate，m6p)是参与生命体内溶酶体酶合成，且参与蛋白质磷酸化修饰的重要化合物。甘露糖-6-磷酸参与了脂肪酸、氨基酸等物质的合成、还包括糖原异生等代谢路径。甘露糖-6-磷酸在细胞内可以与受体特异性结合，它们共同在溶酶体酶的形成过程产生着重要的作用，因此甘露糖-6-磷酸也是溶酶体酶的重要标识，当缺乏甘露糖-6-磷酸时，会诱发许多严重的疾病。甘露糖-6-磷酸受体m6pr，在与甘露糖-6-磷酸结合的同时，还能够与胰岛素生长因子(igf)、β转化生长因子(tgf-p)等多种细胞膜表面以及存在于信号通道的信号分子蛋白结合。甘露糖-6-磷酸可以作为以上多种因子的竞争性物质，调节受甘露糖-6-磷酸控制的下游信号通路，从而影响生命体的生理生化反应。
3.近年来，随着合成生物学的飞速发展，利用微生物设计和创建人工合成细胞发酵生产天然产物，已作为一种绿色高效的新型生产模式被科学界及工业界认可。但是微生物异源生物合成天然产物的效率经常受到酶调控的影响。酶产物抑制效应是限制化合物产率的主要因素之一。当产物浓度过高，超过某个阈值时，会触发产物抑制效应，从而降低酶反应速率，影响目标化合物的合成。目前，甘露糖-6-磷酸的合成方法广泛为这两种：化学合成法、酶法合成法。其中化学合成法由于反应剧烈，需高压高温条件，需要羟基保护剂，采用有毒的试剂或催化剂参与反应；成本过高，得率过低等问题限制了化学法合成甘露糖-6-磷酸及其类似物的发展，无法实现高效率合成。目前国内外研究较多的是采用酶法合成(化学-酶法)甘露糖-6-磷酸。作为化学合成法的有效替代途径，酶法生产非常温和，不存在极端的高温高压情况；且不需要太多的有毒溶剂和催化剂；对于ph值的要求更接近中性范围。就催化效率而言，酶催化反应的底物专一性非常好，效率高，节省能量，且副产物少，更利于产品的分离提纯，成本也就降低了很多。研究发现，存在着一种激酶，可以以甘露糖为底物，以磷酸盐为磷酸供体，实现甘露糖的磷酸化，生产甘露糖-6-磷酸。当使用atp作为磷酸盐供体进行生产时，价格太过昂贵，转化率虽能满足，但是成本太高，不利于今后的大规模量化生产。
4.近年来，随着合成生物学的飞速发展，利用微生物设计和创建人工合成细胞发酵生产天然产物，已作为一种绿色高效的新型生产模式被科学界及工业界认可。但是微生物异源生物合成天然产物的效率经常受到酶调控的影响。酶产物抑制效应是限制化合物产率的主要因素之一。当产物浓度过高，超过某个阈值时，会触发产物抑制效应，从而降低酶反应速率，影响目标化合物的合成。


技术实现要素：

5.为解除甘露糖-6-磷酸对多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的反馈抑制，本研究在对
该酶氨基酸序列同源比较的基础上，结合已报道的大肠杆菌全基因组序列和通过同源建模，分子对接以及多重序列比对等手段将高度保守区域进行定点突变，成功地构建了既部分解除了甘露糖-6-磷酸的反馈抑制又提高了酶催化活性的酶突变体。
6.本发明提供了一种高效生产甘露糖-6-磷酸的大肠杆菌工程菌及其构建方法。本发明人通过数据库挖掘比对，筛选了上百条基因，从中选出了一种来自于arthrobacter sp.i3中的多聚磷酸盐依赖型激酶，克隆到escherichia coli bl21(de3)中实现高效表达，对重组酶的功能进行验证。为了进一步提高酶的工业属性，通过同源建模，分子对接以及多重序列比对等方法对多聚磷酸盐依赖型激酶特定的氨基酸位点进行突变，解除了底物产物抑制，获得催化效率明显提升的突变株。由此本发明的目的在于筛选得到具有较高的活性和特异性的磷酸酶用于催化甘露糖合成甘露糖-6-磷酸的方法。
7.本发明的目的在于根据arthrobacter sp.基因组序列分析方法，克隆出一种新型多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因ppgmk。
8.本发明提供了一种多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体，所述突变体包含位点168、171位置的一个或者多个位置氨基酸取代，其中168位氨基酸替代为r、q、k、l、m，更优选的替代为q，171位氨基酸替代为q、r、y、p，更优选的替代为r。
9.所述突变体为以上位点更优选的替代的一种或多种组合，其中最优选的为e168q/h171r。
10.在本发明的一种实施方式中，所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体的催化效率是以甘露糖为底物进行全细胞反应，经hplc检测其产物峰面积衡量的。
11.本发明提供了一种多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体，所述突变体为，将多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位和/或171位中的氨基酸进行突变后得到的；所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶为氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶，或与氨基酸序列如seq id no.1所示的序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶。
12.在本发明的一种实施方式中，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸得到的，命名为e168r；
13.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺得到的，命名为e168q；
14.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为e168k；
15.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为e168l；
16.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为e168m；
17.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为精氨酸得到的，命名为h171r；
18.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺得到的，命名为h171q；
19.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为酪氨酸得到的，命名为h171y；
20.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为脯氨酸得到的，命名为h171p；
21.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸得到的，命名为e168q/h171r；
22.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺得到的，命名为e168q/h171q；
23.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸得到的，命名为e168r/h171r；
24.或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺得到的，命名为e168r/h171q。
25.在本发明的一种实施方式中，所述亲本酶多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶来源于arthrobacter sp.。
26.在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
27.本发明还提供了编码上述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体的基因。
28.本发明还提供了一种携带所述突变体，或携带上述基因的重组载体。
29.在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pet系列载体、prsf系列载体或pcdf系列载体为表达载体。
30.在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pet28a质粒、prsfduet1质粒或pcdf质粒为表达载体。
31.本发明还提供了一种表达上述突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的微生物细胞。
32.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
33.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为表达宿主。
34.本发明提供了一种多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶，编码所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
35.本发明提供了一种多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶，所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶氨基酸序列包括但不限于与seq id no.1所示序列同源性≥90％的氨基酸序列。
36.本发明利用构建的重组菌高效制备甘露糖-6-磷酸的方法，产物甘露糖-6-磷酸的产率最高可达到98.6％。
37.本发明还提供了一种提高多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶酶活的方法，所述方法为，将多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位和/或171位中的氨基酸进行突变；
38.所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶为氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸
盐依赖型甘露糖激酶，或与氨基酸序列如seq id no.1所示的序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶。
39.在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸；
40.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
41.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为赖氨酸；
42.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为亮氨酸；
43.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为甲硫氨酸；
44.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为精氨酸；
45.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺。
46.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为酪氨酸。
47.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为脯氨酸。
48.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸；
49.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺；
50.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸；
51.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺。
52.在本发明的一种实施方式中，编码所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
53.本发明还提供了一种提高多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶催化合成甘露糖-6-磷酸的产量方法，所述方法为，将多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位和/或171位中的氨基酸进行突变；
54.所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶为氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶，或与氨基酸序列如seq id no.1所示的序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激
ppgmk，重组质粒pet-ppgmk转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞，通过含100μg/ml卡那霉素的lb平板筛选，获得重组菌株e.coli bl21/pet-ppgmk，步骤为：
75.1)多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因ppgmk的获取，用于调取ppgmk基因的菌种(本实验室保藏)为arthrobacter sp.。多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因ppgmk的克隆：以节杆菌基因组为模板，pcr扩增反应获得ppgmk基因。pcr扩增条件：98℃预变性30s，然后进行以下循环：98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
76.2)重组质粒pet-ppgmk的构建：利用限制性内切酶对目的基因ppgmk和表达载体pet28a分别进行双酶切，处理后的dna片段通过粘性末端连接，获得带有多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因ppgmk的重组质粒pet-ppgmk。
77.3)重组质粒转化大肠杆菌：取重组质粒0.5μl，转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞，转化液涂布到含100μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃倒置培养过夜，获得阳性克隆e.coli bl21/pet-ppgmk。
78.本发明提供了一种用于催化合成甘露糖-6-磷酸的酶制剂，所述酶制剂中含有所述多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体。
79.在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂为液态制剂。
80.在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂为冻干粉，所述冻干粉中含有所述的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体及保护剂。
81.本发明还提供了一种制备甘露糖-6-磷酸的方法，所述方法为，以甘露糖为底物，采用上述突变体，或上述微生物细胞，或上述重组大肠杆菌，或上述酶制剂转化制备得到甘露糖-6-磷酸。
82.在本发明的一种实施方式中，所述底物甘露糖浓度为5mm～2000mm。
83.在本发明的一种实施方式中，微生物细胞或重组大肠杆菌的全细胞浓度5～60mg/ml。
84.在本发明的一种实施方式中，，所述方法包括以下步骤：
85.1)首先是微生物细胞或重组大肠杆菌的培养，所用培养基为lb液体培养基，挑取微生物细胞或重组大肠杆菌的单菌落接种于5ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜；取500μl培养液转接于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至od
600
为0.6，在培养物中加入诱导物异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.1mmol/l，于30℃诱导培养16h；12,000
×
g离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，收集得到微生物细胞或重组大肠杆菌全细胞；
86.2)以微生物细胞或重组大肠杆菌全细胞为催化剂，以甘露糖为底物，反应缓冲液为1ml0.1mo1/l ph 4.5～6.0的醋酸缓冲液，或者1ml 0.1mol/l ph 6.5～7.5的磷酸缓冲液，或者1ml0.1mol/l ph 8.0～9.0的tris-hcl，底物甘露糖浓度为5～2000mm，反应温度为20～40℃；微生物细胞或重组大肠杆菌全细胞浓度5～60mg/ml，反应8h。
87.3)反应结束后，将反应混合物离心除去固体物质，每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6，使用高效液相色谱法(hplc)测定甘露糖含量以计算转化率。通过美国博乐有机酸柱aminex hpx-87h检测。流动相为5mm稀硫酸，流速为0.6ml/min，柱温为65℃。用示差检测器检测信号，检测温度为40℃。
88.4)产物甘露糖-6-磷酸产率计算方法：产率(％)＝(c0-cs)/c0
×
100％。
89.式中c0为反应前甘露糖浓度，cs为反应后甘露糖浓度。
90.本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组大肠杆菌，或上述酶制剂在制备甘露糖-6-磷酸或含有甘露糖-6-磷酸的产品中的应用。
91.在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
92.有益效果
93.(1)本发明通过氨基酸序列和结构比对，挖掘到一种来源于arthrobacter sp.的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶，克隆到大肠杆菌中，实现高效异源表达，该基因全长804bp。将ppgmk基因插入表达载体pet28a中，转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，构建带有目的基因的重组菌株e.coli bl21/pet-ppgmk。同时通过同源建模，分子对接以及多重序列比对等手段对多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶进行关键氨基酸位点的突变，催化效率有很大提升，酶活提升为野生型酶的4倍左右。
94.(2)本发明以廉价的甘露糖为底物，经过多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶一步催化，便可获得转化效率与立体选择性高的甘露糖-6-磷酸。全细胞生物催化反应不需要繁琐的步骤，无多余的副产物生成，反应条件温和，对环境友好。本发明通过生物催化一步法获得目标产物，是一种绿色高效的生物合成甘露糖-6-磷酸的方法。通过生物转化反应条件的优化，在0.1mol/l ph 8.5的tris-hcl缓冲中，利用20mg/ml表达e168q/h171r突变体的重组细胞对2000mm的底物甘露糖(合计为360.28g/l)在35℃下催化转化8h，最终产物甘露糖-6-磷酸产率为98.06％，产量可达510g/l；远远大于原始酶的产量(335.679g/l)。
95.本发明的这些工作不仅探索一种新的酶法合成甘露糖-6-磷酸的方法，同时也为低成本化生产甘露糖-6-磷酸提供可能性，为今后的规模化生产奠定基础。
附图说明
96.图1：e.coli bl21/pet-ppgmk在大肠杆菌中的表达；其中，lane m：protein mw marker(low)；lane 1：空感受态细胞e.coli bl21/pet28a的蛋白；lane 2：e.coli bl21/pet-ppgmk转化子的发酵液上清。
97.图2：纯化的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶sds-page图；其中，line 1为纯化后的的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶纯酶条带；line 2为空感受态细胞e.coli bl21/pet28a的蛋白。
98.图3：ph与温度对多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的纯酶酶活性的影响；其中，图3中的a表示多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶在不同ph下的酶活稳定性；图3中的b表示多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶在不同ph下的酶活性；图3中的c表示多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的温度稳定性；图3中的d表示多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶在不同温度下的酶活性。
99.图4：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶全细胞催化合成甘露糖-6-磷酸液相检测图。
100.图5：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶全细胞催化合成甘露糖-6-磷酸核磁共振氢谱图。
101.图6：甘露糖合成甘露糖-6-磷酸全细胞生物催化条件的优化；其中，图6中的a表示温度对多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶全细胞催化的影响；图6中的b表示底物添加量对多聚
磷酸盐依赖型甘露糖激酶全细胞催化的影响；图6中的c表示全细胞浓度对多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶全细胞催化的影响。
102.图7：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的同源建模结构及分子对接结构展示。
103.图8：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的多重序列比对。
具体实施方式
104.技术术语：
105.多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶：出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的活性。在一方面，本发明的突变体具有seq id no.1任一所示的多肽的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。
106.多聚磷酸盐需要借助依赖多聚磷酸型激酶将其储存的能量释放出来，用于生物大分子的合成。很早之前，依赖多聚磷酸盐激酶就被报道存在于多种原核微生物中，例如聚磷酸激酶、葡萄糖激酶、nad激酶、amp磷酸转移酶以及1，3-二磷酸甘油酸磷酸转移酶。硏究发现聚磷酸激酶、多聚磷酸/atp依赖型葡萄糖激酶以及多聚磷酸/atp依赖型nad激酶能够利用多聚磷酸盐将葡萄糖、adp磷酸化。人们推测，依赖多聚磷酸盐激酶是依赖atp激酶的起源。近年来，聚磷酸激酶(ppk)是研究热点，pfk可借助多聚磷酸盐实现atp与adp之间的转化，进行能量的传递。
107.甘露糖-6-磷酸：甘露糖-6-磷酸能够与甘露糖-6-磷酸受体(mannose-6-phosphatereporter，m6pr)产生相互作用，这种受体与配体相互作用间接影响细胞信号传导途径。研究表明m6pr与细胞内多条代谢通道都有着密切的联系。m6pr不仅能够与m6p结合，同时还能够与胰岛素生长因子(igf)围、β转化生长因子(tgf-β)、白血病抑制因子(lif)、增殖蛋白切、甲状腺球蛋白閃等多种细胞膜表面蛋白以及胞内信号分子蛋白相结合。当m6pr已经与m6p结合时,其他信号分子以及膜表面蛋白将不能够再与m6pr结合,此时将会影响细胞内信号传导途径,影响细胞生理反应。m6p的这种竞争性结合作用在治疗许多疾病中有着广泛的作用。
108.表达：术语“表达”包括涉及多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
109.表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，所述分子包含编码本发明的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
110.片段：术语“片段”意指在多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶活性。在一方面，片段含有seq id no.1～4任一所示的氨基酸1至440(即不包含酶原区序列长度)的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％。
111.宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的
突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
112.宿主细胞可以是在多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体的重组生产中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
113.原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属(bacillus)、梭菌属(clostridium)、肠球菌属(enterococcus)、土芽孢杆菌属(geobacillus)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(oceanic bacillus)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)和链霉菌属(streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(campylobacter)、大肠杆菌(e.coli)、黄杆菌属(flavobacterium)、梭杆菌属(fusobacterium)、螺杆菌属(helicobacter)、泥杆菌属(mycobacterium)、奈瑟氏菌属(neisseria)、假单胞菌属(pseudomonas)、沙门氏菌属(salmonella)、以及脲原体属(ureaplasma)。
114.宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
115.下述实施例中所涉及的培养基如下：
116.lb液体培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，nacl 1％，ph 7.0。使用前加入卡那霉素(100μg/ml)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
117.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
118.产物甘露糖-6-磷酸的检测方法：
119.首先是核磁共振氢谱检测法。共振条件下可以使氢原子吸收电磁波而产生跃迁，而处于不同位置的氢原子，在光谱上就具有了不同的位置。利用峰面积和化学位移等信息可以帮助推断其在化合物中的位置。因此可以将甘露糖-6-磷酸的氢原子信息与核磁谱图(图5)一一对应，这是一种准确的定性检测方法。
120.由于多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶有很好的专一性，且该反应是不可逆反应，因此通过检测底物甘露糖含量，也知道了产物甘露糖-6-磷酸的含量，同时也可以知道该酶催化反应的转化率。每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6，使用高效液相色谱法(hplc)测定甘露糖含量以计算转化率。通过美国博乐有机酸柱aminex hpx-87h检测。流动相为5mm稀硫酸，流速为0.6ml/min，柱温为65℃。用示差检测器检测信号，检测温度为40℃。
121.多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶酶活的检测：
122.ppgmk的酶活性通过nadphna4吸光度值测定。反应体系为100mm甘露糖，10mm六偏磷酸钠、5mm mgcl2，加入tris-hcl缓冲液，在30℃下反应10分钟。100℃沸水处理3min使酶失活。再用0.5mm的nadpna2以及1u的6-磷酸葡萄糖脱氢酶、1u的甘露糖-6-磷酸异构酶、1u的6-磷酸葡萄糖异构酶处理在30℃下，使用多功能酶标仪(biotek,vermont,usa)监测340nm(ε＝6220/m/cm)处nadphna4吸光度值。所有实验重复三次；在此基础上，以甘露糖为底物来测定ppgmk的酶活性。
123.考虑用高效液相色谱法(hplc)定量检测酶活，根据文献记载，用美国博乐有机酸柱aminex(hercules，ca，usa)hpx-87h检测。流动相为5mm稀h2so4，流速0.6ml/min，柱温65℃。用示差检测器检测，温度为40℃。反应底物直接用甘露糖，可以同时检测出其对甘露糖的催化活性的优劣。
124.首先制作标曲，配置1g/l、4g/l、10g/l、15g/l、20g/l的甘露糖水溶液，用hplc检测，以甘露糖峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制作标曲，可以从样品的峰面积反映剩余甘
露糖的含量。底物体系为5g/l甘露糖、5g/l六偏磷酸钠、10mm mgcl2，用ph为8.5的0.1mol/l tris-hcl缓冲液配置，定容，过膜后用hplc检测11～12min的甘露糖峰面积，在标曲上标定其实际浓度。分别将1ml底物体系加一定量的粗酶，30℃反应10min，沸水加热失活3min，离心取上清，过膜测hplc。
125.实施例1：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因ppgmk及含有野生型ppgmk重组菌的获得
126.具体步骤如下：
127.(1)从ncbi中获取来自arthrobacter sp.的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的氨基酸序列(ncbi数据库基因登陆号为wp_028275864.1，氨基酸序列如seq id no.1所示)，根据大肠杆菌的密码子偏好性，对基因进行密码子优化(核苷酸序列如seq id no.2所示)。多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的同源建模结构及分子对接结构展示及多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的多重序列比对如图7～图8所示。
128.多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因ppgmk的克隆：以arthrobacter sp.基因组为模板，pcr扩增反应获得ppgmk基因。
129.pcr扩增的体系为：prime star 25μl，模板1μl，上下游引物1μl
×
2，ddh2o 22μl。
130.pcr扩增条件：98℃预变性30s，然后进行以下循环：98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
131.(2)重组质粒pet-ppgmk的获得
132.利用限制性内切酶对目的基因ppgmk和表达载体pet28a分别进行双酶切，处理后的dna片段通过粘性末端连接，获得带有多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶基因ppgmk的重组质粒pet-ppgmk。
133.(3)重组菌株e.coli bl21/pet-ppgmk的获得
134.将步骤(2)制备得到的重组质粒pet-ppgmk转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞，通过含有含100μg/ml卡那霉素的lb平板筛选，获得重组菌株e.coli bl21/pet-ppgmk。具体步骤如下：
135.1)重组质粒转化大肠杆菌：
136.在每管的50μl e.coli bl21(de3)感受态细胞悬液中加入0.5μl连接产物，轻轻混匀后冰浴30min。42℃热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μl lb液体培养基，37℃200rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000
×
g离心2min，弃上清600μl，剩余菌液混匀后涂布含100μg/ml卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜。
137.2)挑取4个克隆，转接入装有5ml的含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒mini-plasmid rapid i solation kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。经下列酶切体系验证：10
×
buffer 2μl，质粒dna5μl，bamh i 0.5μl，xho i 0.5μl，ddh2o将体系补足20μl。
138.酶切结果为阳性的菌体即为重组菌e.coli bl21/pet-ppgmk。
139.(4)重组菌的培养：
140.挑取步骤(3)中e.coli bl21/pet-ppgmk的单菌落接种于5ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，制备得到培养液；
141.取500μl培养液转接于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，
h171y、e.coli bl21/pet-h171p。
156.(3)粗酶液的制备
157.分别挑取步骤(2)得到的重组菌的单菌落接种于5ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，得到培养液；取500μl培养液转接于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至od
600
为0.6，在培养物中加入诱导物iptg 0.1mmol/l，于30℃诱导培养16h；12,000
×
g离心10min，收集菌体，用ph 8.5,0.1mol/l的tris-hcl重悬。
158.0℃超声破碎，功率为25％，破胞时间15min。4℃,12,000
×
g离心20min，取上清，-20℃保存，分别制备得到粗酶液。粗酶液的蛋白如图1所示。
159.(4)纯酶液的制备
160.蛋白表达同步骤(3)，诱导条件为：0.1mm iptg，30℃下培养14～16h，获得的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶全细胞，重组表达载体pet28a(+)包含his组氨酸标签，可以利用组氨酸与ni
+
的亲和作用，ppgmk可以利用ni
2+
柱来进行纯化。获得单一条带的蛋白。所述菌株的构建，诱导表达以及纯化均为常规操作；分别制备得到纯酶液，纯化的蛋白如图2所示。
161.结果显示，sds-page显示单一条带，分子量大约为30kda，与重组蛋白的理论分子量相吻合。
162.分别检测获得的纯酶液的比酶活，结果如下表所示：
163.表2突变酶纯酶液的比酶活
[0164][0165][0166]
2、多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体h171r纯酶的酶学性能
[0167]
(1)评估ph和温度依赖性
[0168]
分别使用醋酸(ph 4.5～6.0)、磷酸盐(ph 6.5～7.5)和tris-hcl(ph 8.0～9.0)作为缓冲试剂。测定不同ph值(ph 4.5～9.0)条件下的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体酶活。
[0169]
在不同温度(10～80℃)条件下反应10分钟，检测ppgmk突变体的酶活。
[0170]
(2)为了研究ph的稳定性，酶溶液在各种ph缓冲液中孵育12小时，在30℃下测定残留活性。
[0171]
为了评估热稳定性，酶溶液在20mm tris缓冲液(ph 8.5)中在不同温度(10～80℃)下孵育1h，冷却后在30℃下测定剩余的酶活性。
[0172]
结果如图3所示，图3中的a、3中的b显示，研究表明多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶在温度10～40℃时，具有稳定的酶活性，最适反应温度为40℃；ph值为8.0～9.0时，具有稳定且高的活性(图3中的c、图3中的d)。
[0173]
实施例3：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶催化制备甘露糖-6-磷酸
[0174]
具体步骤如下：
[0175]
(1)全细胞的准备
[0176]
分别将实施例2制备得到的含有多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体的重组菌株，进行全细胞的制备：
[0177]
挑取步骤含有不同突变体的e.coli bl21/pet-ppgmk突变体的单菌落接种于5ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，制备得到培养液；
[0178]
取500μl培养液转接于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至od
600
为0.6后，加入0.1mmol/l iptg诱导剂，于30℃诱导培养8h，得到发酵液；
[0179]
取发酵液在10,000
×
g条件下离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集重组菌全细胞。
[0180]
(2)全细胞催化体系为：
[0181]
100mm甘露糖，10mm六偏磷酸钠、5mm mgcl2和10mg/ml湿细胞，每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6。反应缓冲液为0.1mol/l tris-hcl(ph 8.5)。
[0182]
反应在摇床中进行，转速200rpm，温度30℃，反应时间8h，反应结束后高速离心去掉全细胞，上清适当稀释后进行液相上样检测，所有实验均重复三次取平均值。
[0183]
结果如表3所示。
[0184]
表3：野生型酶及突变酶催化合成甘露糖-6-磷酸比较
[0185][0186]
结果显示，通过液相检测目标产物的含量，最终获得9个位点突变催化转化产物效率明显提高的突变体：位点168、171的氨基酸定向突变；其中突变体e168q，h171r效果最好，其全细胞催化甘露糖-6-磷酸的转化率达到91.36％。
[0187]
实施例4：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶双突变体的制备
[0188]
对获得的单点突变进行组合突变，并测试其全细胞转化效果；构建方法为：以某个单点突变的氨基酸序列为模板，通过设计另外突变位点的全质粒pcr引物，通过模板消化、产物纯化、转化以及挑取克隆子测序验证得到突变正确的双突变质粒，其中，分别将双突变体命名为：e168q/h171r(命名为m1)，e168q/h171q(命名为m2)，e168r/h171r(命名为m3)，e168r/h171q(命名为m4)；
[0189]
并按照实施例2～3的方法，分别制备得到含有双突变体的全细胞(e.coli bl21/pet-m1、e.coli bl21/pet-m2、e.coli bl21/pet-m3、e.coli bl21/pet-m4)按照实施例3的方法进行催化反应，其全细胞催化甘露糖-6-磷酸的转化率达到95.95％。
[0190]
结果如表4所示。
[0191]
表4：有益突变位点组合突变催化合成甘露糖-6-磷酸转化效率
[0192][0193]
结果显示，突变体m1的效果最好，后续实验以m1为例进行研究。
[0194]
实施例5：多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变株m1全细胞合成甘露糖-6-磷酸的条件优化
[0195]
具体步骤如下：
[0196]
(1)全细胞的制备
[0197]
挑取步骤含有不同突变体的e.coli bl21/pet-m1的单菌落接种于5ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，制备得到培养液；
[0198]
取500μl培养液转接于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至od
600
为0.6后，加入0.1mmol/l异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于30℃诱导培养8h，得到发酵液；
[0199]
取发酵液在10,000
×
g条件下离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集重组菌全细胞。
[0200]
(2)多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变株m1全细胞合成甘露糖-6-磷酸
[0201]
初始反应条件为：
[0202]
反应体系为1ml，包含100mm甘露糖，10mm六偏磷酸钠、5mm mgcl2和10mg/ml步骤(1)得到的湿细胞，每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6。反应缓冲液为0.1mol/l tris-hcl(ph 8.5)。
[0203]
反应在摇床中进行，转速200rpm，温度30℃，反应时间8h，反应结束后高速离心去掉全细胞，得到上清液。
[0204]
色谱分析使用agilent-1260hplc系统(agilent technologies inc.，palo alto，usa)，用示差检测器检测信号，检测温度为40℃。色谱柱：有机酸柱aminex hpx-87h，流动相：5mm稀硫酸，流速：0.6ml/min，温度：65℃。
[0205]
结果如图4所示，其中甘露糖出峰时间为11.240min。
[0206]
(2)优化了甘露糖-6-磷酸全细胞催化反应的温度
[0207]
反应体系：
[0208]
反应体系为1ml，包含100mm甘露糖，10mm六偏磷酸钠、5mm mgcl2和10mg/ml步骤(1)得到的湿细胞，每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6。反应缓冲液为0.1mol/l tris-hcl(ph 8.5)。
[0209]
反应在摇床中进行，转速200rpm，温度设置为20～40℃，反应时间8h，反应结束后高速离心去掉全细胞，上清适当稀释后进行液相上样检测，所有实验均重复三次取平均值。
[0210]
结果显示：由图6中的a所示，温度的提升对多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体全细胞催化甘露糖-6-磷酸的转化率有促进作用，当环境条件极端时，例如低温(20℃)或高温(40℃)，酶催化反应受到抑制，酶的催化活性较低，根据实验结果，我们推测极端温度可能会部分使酶失活。选取35℃为最适反应温度，此时底物转化率为97％，产量为：38.359g/l。
[0211]
(3)优化了反应的底物添加量
[0212]
反应体系：
[0213]
反应体系为1ml，包含5～2000mm甘露糖，10mm六偏磷酸钠、5mm mgcl2和10mg/ml步骤(1)得到的湿细胞，每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6。反应缓冲液为0.1mol/l tris-hcl(ph 8.5)。
[0214]
反应在摇床中进行，转速200rpm，温度35℃，反应时间8h，反应结束后高速离心去掉全细胞，上清适当稀释后进行液相上样检测，所有实验均重复三次取平均值。
[0215]
结果显示：由图6中的b所示，随着底物添加量增大转化率有下降但依旧很高，底物
转化率为98.90％，于是继续提高底物浓度进行反应优化，如表5所示
[0216]
表5：不同全细胞浓度和底物添加量的全细胞转化效果
[0217][0218][0219]
结果显示，通过正交法优化甘露糖-6-磷酸合成路线得到全细胞添加量为15mg，底物添加量为100mm时转化率最高，此时底物转化率为97.91％，产量为：38.719g/l。
[0220]
(4)优化了反应的全细胞浓度
[0221]
反应体系：
[0222]
反应体系为1ml，包含100mm甘露糖，10mm六偏磷酸钠、5mm mgcl2和5～60mg/ml步骤(1)得到的湿细胞，每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6。反应缓冲液为0.1mol/l tris-hcl(ph 8.5)。
[0223]
反应在摇床中进行，转速200rpm，温度35℃，反应时间8h，反应结束后高速离心去掉全细胞，上清适当稀释后进行液相上样检测，所有实验均重复三次取平均值。
[0224]
结果显示：由图6中的c所示，湿细胞浓度在一定范围内与底物转化率呈现正相关，当湿细胞浓度大于20mg/ml，转化率开始缓慢上升，说明此时全细胞所含酶量已达到最大酶量，因此选取20mg/ml作为多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体全细胞反应的最适用量，此时底物转化率为98.14％，产量为：38.809g/l。
[0225]
实施例6：扩大反应全细胞合成甘露糖-6-磷酸
[0226]
本发明将底物甘露糖的浓度扩大至2000mm，以测试多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体催化转化效率。
[0227]
其全细胞催化体系为：
[0228]
2000mm甘露糖，10mm六偏磷酸钠、5mm mgcl2和20mg/ml湿细胞(实施例4步骤(1)得到的制备得到的)，每个样品都用0.2mol/l的cacl2去除过量(napo3)6。反应缓冲液为0.1mol/l tris-hcl(ph 8.5)。
[0229]
反应在摇床中进行，转速200rpm，温度35℃，反应时间8h，反应结束后高速离心去掉全细胞，上清适当稀释后进行液相上样检测，所有实验均重复三次取平均值。
[0230]
转化效果如表6所示。
[0231]
表6：扩大反应结果
[0232][0233][0234]
结果显示，野生型多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶在2000mm的底物添加的情况下只能获得64.52％的转化率，多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体e168q/h171r在2000mm的底物添加的情况下，底物转化率达到了98.06％，转化时间仅需8h。
[0235]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为赖氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为亮氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为甲硫氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为精氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为酪氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为脯氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸得到的；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺得到的。2.编码权利要求1所述的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pet系列载体、prsf系列载体或pcdf系列载体为表达载体。5.表达权利要求1所述的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体，或携带权利要求2所述的基因，或携带权利要求3或4所述的重组载体的微生物细胞。6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞是以细菌或真菌为表达宿主。7.一种提高多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶酶活的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷
氨酸突变为谷氨酰胺；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为赖氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为甲硫氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为酪氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺。8.一种提高多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶催化合成甘露糖-6-磷酸的产量方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为赖氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为甲硫氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组
氨酸突变为酪氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第171位的组氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.1所示的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的第168位的谷氨酸突变为精氨酸，同时将第171位的组氨酸突变为谷氨酰胺。9.用于催化合成甘露糖-6-磷酸的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂中含有权利要求1或2所述的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶突变体。10.根据权利要求9所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂为液态制剂或冻干粉。11.一种制备甘露糖-6-磷酸的方法，其特征在于，所述方法为，以甘露糖为底物，采用权利要求1所述的突变体，或权利要求5或6所述的微生物细胞，或权利要求9或10所述的酶制剂转化制备得到甘露糖-6-磷酸。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述底物甘露糖浓度为5mm～2000mm。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，微生物细胞的全细胞浓度5-60mg/ml。14.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3或4所述的重组载体，或权利要求5或6所述的微生物细胞，或权利要求9或10所述的酶制剂在制备甘露糖-6-磷酸或含有甘露糖-6-磷酸的产品中的应用。15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述产品为化学品。

技术总结
本发明公开了多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶理性改造及其高效合成甘露糖-6-磷酸，属于生物技术领域。本发明通过将来自Arthrobacter sp.的新型多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶，基于同源建模，分子对接以及多重序列比对等方法手段，对多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶关键氨基酸位点第168位的谷氨酸和第171位的组氨酸进行突变，获得催化效率显著提升的突变株M1。通过生物转化反应条件的优化，最终产物甘露糖-6-磷酸产率为98.06％，终产量高达510g/L，为目前报道的解除了底物/产物抑制后的最高产量。本发明极大地降低制备成本，为工业化规模生产甘露糖-6-磷酸奠定了坚实的基础。磷酸奠定了坚实的基础。磷酸奠定了坚实的基础。


技术研发人员：张荣珍 徐岩 邹宇欣
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/24