一种编码右旋糖酐蔗糖酶的基因及其应用的制作方法

1226发酵后生成高分子葡聚糖聚合物，经处理后精制而得的，肠膜状明串珠菌l-m-1226(现编号：l-m-cmcc(b)34991)是国内制备右旋糖酐或低聚糖的模式菌株，2021年中国食品药品检定研究院王珊珊等对肠膜状明串珠菌l-m-cmcc(b)34991进行了全基因组测序(中国生物制品学杂志，2021,34(06):666-670+677)，但没有对相关右旋糖酐蔗糖酶基因进行注释。
5.由于肠膜状明串珠菌产生的右旋糖酐蔗糖酶是以蔗糖为诱导物的胞外酶，其产酶的培养基较为复杂，蔗糖是该酶的诱导物，也是该酶的催化底物。当在肠膜状明串珠菌来制备右旋糖酐蔗糖酶过程中，蔗糖诱导该酶的分泌表达，产生的酶同时又催化培养基中的蔗糖成分合成大分子的右旋糖酐，发酵液变得非常粘稠，这种条件下，酶与菌体及高粘性右旋糖酐产物紧密地结合在一起，该酶的分离纯化变得较为困难，纯化过程中酶的操作稳定性差，酶活的损失较大。当通过肠膜状明串珠菌发酵蔗糖制备右旋糖酐或低聚糖时，由于肠膜状明串珠菌基因组中含有其它可利用蔗糖相关酶的基因(蔗糖磷酸化酶基因等)，造成了蔗糖实际转化为右旋糖酐或低聚糖的利用效率降低；而且发酵液中大分子的右旋糖酐粘度大，培养基杂质、细胞内溶物、杂蛋白等极易和右旋糖酐包裹在一起，右旋糖酐的分离和纯化也变得非常困难，无法提高右旋糖酐或低聚糖产品的品质。


技术实现要素：

6.本发明克服了现有肠膜状明串珠菌发酵蔗糖制备右旋糖酐等产物过程中存在的不足，公开了一种来源于肠膜状明串珠菌l-m-cmcc(b)34991的右旋糖酐蔗糖酶基因及其应用，具体是通过设计引物从肠膜状明串珠菌l-m-cmcc(b)34991基因组中克隆得到右旋糖酐蔗糖酶基因，并对其基因进行测序分析，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其相应的氨基酸序列如seq id no.2所示。该基因的dna片段再与表达载体pet-22b(+)进行连接后转化大肠杆菌宿主e.coli rosetta(de3)，即本发明再通过构建工程菌的方式，使用非蔗糖诱导的组成型启动子或t7启动子对其基因在大肠杆菌中成功地进行异源表达，并对该酶进行理化性质研究，及其催化蔗糖生成右旋糖酐、低聚糖和果糖的相关实验，为该右旋糖酐蔗糖酶的分子改造及其工业化生产和应用提供技术支持。
7.为实现本发明目的所使用的技术方案为：
8.一种编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，所述基因为基因dsra，包括seq id no.1核苷酸序列序列。
9.进一步地，所述基因所编码的蛋白质，包括seq id no.2氨基酸序列。
10.进一步地，所述基因来源于肠膜状明串珠菌的右旋糖酐蔗糖酶基因，是通过设计引物从肠膜状明串珠菌基因组中克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因。
11.进一步地，通过对肠膜状明串珠菌进行非产酶条件的培养，培养基成分及培养条件：即lb液体培养基添加终浓度为1～2.0％(w/v)的蔗糖，于30℃，转速为200rpm的摇床培养30h，并提取其基因组dna为模板，设计引物对右旋糖酐蔗糖酶基因进行pcr扩增，引物序列如下：
12.引物1序列：5
’‑
cagcatatgacctttacagaaaaagtaatgcgg-3’13.引物2序列：5
’‑
atactcgagttatgctgacacagcatttccattattatc-3’14.引物1序列的下划线为ndei酶切位点，引物2序列下划线为xhoi酶切位点。
15.进一步地，25μl的pcr反应体系：5
×
ps pcr缓冲液5μl，dntp 200μmol/l，引物各
10pmol/l，基因组dna模板100ng，primestar hs dna聚合酶0.5个单位，加超纯水至反应总体积为25.0μl。
16.进一步地，pcr扩增程序如下：95℃3min；95℃30sec；58.5℃30sec；延伸温度和时间72℃4.5min；循环34次；72℃10min。
17.进一步地，采用pcr扩增程序获得pcr产物用试剂盒进行纯化后，再分别用ndei和xhoi内切酶进行酶切，将此dna片段连接到表达载体pet-22b(+)的ndei和xhoi酶切位点处，得到重组表达载体pet-22b-dsra，转化到大肠杆菌宿主菌e.colixl-1blue进行克隆筛选和全基因测序分析，最终将序列正确的表达质粒pet-22b-dsra转化到大肠杆菌rosetta(de3)中得到重组大肠杆菌rosetta(de3)/pet-22b-dsra。
18.本发明还提供一种表达载体，它含有权利要求1～7任一项所述的基因。
19.本发明还提供一种宿主细胞，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
20.本发明还提供一种编码右旋糖酐蔗糖酶的基因的应用，所述的蛋白质在转化蔗糖制备右旋糖酐、低聚糖或果糖中的应用。
21.本发明具有以下有益效果：
22.本发明通过设计引物从肠膜状明串珠菌l-m-cmcc(b)34991基因组中克隆右旋糖酐蔗糖酶基因，进行全基因的测序与分析，再使用非蔗糖诱导的组成型启动子或t7启动子对其基因在需要廉价培养基的大肠杆菌(或乳酸菌)中进行异源表达，以规模化制备右旋糖酐蔗糖酶，通过构建工程菌的方式解决了实际生产的问题。同时，通过分析该酶的氨基酸组成，通过同源建模的方法获得了该酶的三维结构，从而为对该右旋糖酐蔗糖酶的分子改造以提高其活性和稳定性，为其工业化生产和应用提供技术支持。
附图说明
23.图1为右旋糖酐蔗糖酶基因dsra的pcr产物琼脂糖电泳分析图。
24.图2为右旋糖酐蔗糖酶的蛋白表达sds-page分析图。
25.图3为右旋糖酐蔗糖酶制备右旋糖酐的色谱分析图。
26.图4为右旋糖酐蔗糖酶合成的低聚糖的色谱分析图。
具体实施方式
27.以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，下述实例所述内容属于本发明的主要内容，但是并不仅仅限于这些内容。需要说明的是，有些对本领域专业人员来说是显而易见的修改或扩展内容，虽然并未在本专利说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。
28.实验材料、试剂及实验方法说明：本发明及实施例所述的菌株及载体，如宿主细胞大肠杆菌e.colixl1-blue、e.coli rosetta(de3)和表达载体pet-22b(+)等材料均通过商业途径购买；肠膜状明串珠菌(leuconostoc mesenteroides cmcc(b)34991)购于中国医学细菌保藏管理中心；酶类及其他生化试剂、培养基等实验耗材均从生化试剂公司买到，固体lb培养基加1.5％(w/v)琼脂和浓度为100μg/ml氨苄青霉素；实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)书中所列具体方法和步骤实行，或
按照试剂盒和产品说明书进行；酶的高效表达、酶活检测、转化实验、产物鉴定与检测等方法均参照相关已报导的常规方法和文献进行。
29.下面将通过实施例对本发明作详细描述：
30.实施例1.右旋糖酐蔗糖酶基因的克隆、测序分析及其重组菌的构建
31.本发明通过对肠膜状明串珠菌(leuconostoc mesenteroides，l-m-cmcc(b)34991)进行非产酶条件的培养(培养基成分及培养条件：即lb液体培养基添加终浓度为2.0％(w/v)的蔗糖，于30℃，转速为200rpm的摇床培养30h)，并提取其基因组dna为模板，设计引物对右旋糖酐蔗糖酶基因进行pcr扩增，引物序列与pcr反应程序如下：
32.引物1序列：5
’‑
cagcatatgacctttacagaaaaagtaatgcgg-3’33.引物2序列：5
’‑
atactcgagttatgctgacacagcatttccattattatc-3’34.引物1序列的下划线为ndei酶切位点，引物2序列下划线为xhoi酶切位点。
35.25μl的pcr反应体系：5
×
ps pcr缓冲液5μl，dntp 200μmol/l，引物各10pmol/l，基因组dna模板100ng，primestar hs dna聚合酶0.5个单位，加超纯水至反应总体积为25.0μl。
36.pcr扩增程序如下：95℃3min；95℃30sec；58.5℃30sec；延伸温度和时间72℃4.5min；循环34次；72℃10min。取3μl的pcr产物在0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如图1的lane 1所示，有4.5kb大小的dna片段出现，其命名为dsra基因。pcr产物用试剂盒进行纯化后，再分别用ndei和xhoi内切酶进行酶切，将此dna片段连接到表达载体pet-22b(+)的ndei和xhoi酶切位点处，得到重组表达载体pet-22b-dsra，转化到大肠杆菌宿主菌e.colixl-1blue进行克隆筛选和全基因测序分析，最终将序列正确的表达质粒pet-22b-dsra转化到大肠杆菌rosetta(de3)中得到重组大肠杆菌rosetta(de3)/pet-22b-dsra，进行该基因的表达及其相关酶学性质研究。
37.表达载体pet-22b-dsra由苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因测序，结果表明，该基因由4584个核苷酸组成，序列如seq id no.1所示，该基因的起始密码子为atg，终止密码子为taa，编码一个含1527个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示，用nti软件预测该蛋白质的理论分子量大小为169.82kda。
38.将本发明来源于肠膜状明串珠菌l-m-cmcc(b)34991的dsra基因编码的右旋糖酐蔗糖酶的氨基酸序列(序列如seq id no：2)在ncbi网站进行blastp(protein-protein blast)比对分析，结果表明，该酶与肠膜状明串珠菌0326的dexyg基因(genbank：dq345760.1)编码的右旋糖酐蔗糖酶相似性最高，相似度为99.7％，两者只有4个氨基酸残基的不同，其中有3个氨基酸残基位于酶的功能区域，或造成了酶结构与功能的微小差异；其次，该酶与另一个肠膜状明串珠菌右旋糖酐蔗糖酶基因dsrb(genbank:mbd9366793.1)编码的酶相似度为99.3％，有11个氨基酸残基的不同；该酶与肠膜状明串珠菌(leuconostoc mesenteroides nrrlb-512-f)dsrs基因(genbank:aad10952.1)编码的右旋糖酐蔗糖酶(dsr-s)相似性为98.9％。
39.实施例2.右旋糖酐蔗糖酶诱导表达与酶学性质研究
40.在涂有重组大肠杆菌rosetta(de3)/pet-22b-dsra平板上，挑一个单菌落于5ml lb(含100μg/ml氨苄青霉素，amp)液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。从5ml的lb菌液中按2％的接种量接种到装有200ml lb(含100μg/mlamp)液体培养基的500ml摇瓶中，当在37
℃和220rpm培养菌体浓度至od
600
为0.5时，加入iptg至终浓度为0.25mmol/l，在25℃和220rpm的摇床中振荡培养诱导15h。取诱导培养12h后的培养液200ml，离心收集菌体，按每克菌体加5ml的破胞缓冲液(20mm醋酸钠缓冲液，ph 5.4)重悬菌体，加入triton x-100至终浓度0.5％，超声波破胞后(工作时间10sec，间隔时间10sec，60个循环)，于4℃12000rpm离心15min取上清液即得粗酶液。同时，对诱导表达的重组菌进行sds-page电泳检测dsra基因的表达情况，如图2所示，空白对照(lane 1)的大肠杆菌rosetta(de3)/pet-22b没有目标条带出现，右旋糖酐蔗糖酶(lane 2，dsra)的分子量大小约为170kda，表明该酶表达成功，其分子量大小与其理论值相符。
41.右旋糖酐蔗糖酶的酶活测定采用3，5-二硝基水杨酸法(即dns法)：其原理是右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖中的葡萄糖基被聚合成右旋糖酐，同时释放出果糖，果糖是一种还原糖，所以可以通过检测果糖的含量来检测右旋糖酐蔗糖酶的活性。
42.右旋糖酐蔗糖酶活力测定方法：取200μl反应缓冲溶液(200mmol/l蔗糖；20mmol/l醋酸钠缓冲溶液，ph 5.4；20mmol/l cacl2。)于冰上浴预冷5min后，用排枪分装入96孔反应板，加入20μl适当倍数稀释酶液，在最适温度下准确反应30min(以沸水灭活的酶10min为空白对照)，加入200μldns终止反应，然后沸水浴5min使充分显色，再置冷水中冷却，经过适当的稀释，用酶标仪检测其od
520
值，计算酶的活力。
43.酶活力单位定义：在最适反应温度及最适ph条件下，每min生成1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(1u)。
44.以蔗糖为底物，配制含有同一底物浓度的不同ph值的反应缓冲液(ph值5.0～6.5之间)，按前述的方法测定不同ph对右旋糖酐蔗糖酶活力的影响，相对活力最高的ph即为该酶的最适ph，实验表明本发明的右旋糖酐蔗糖酶突变酶最适ph为5.4。
45.在最适ph条件下，以蔗糖为底物按上述方法制备反应缓冲溶液，用薄壁96孔反应板分装100μl的反应液，采用梯度pcr仪将酶促反应的温度控制在22℃～45℃之间，在不同的温度条件下，用dns法测定果糖的生成量，确定酶的最适反应温度，结果表明，该右旋糖酐蔗糖酶最适温度是33℃，右旋糖酐蔗糖酶在28～35℃温度范围内保持80％以上的活力。
46.实施例3.右旋糖酐蔗糖酶转化蔗糖的制备右旋糖酐的实验
47.按本发明实施例2的方法，制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液，进行转化蔗糖生成右旋糖酐的实验。本发明在250ml的玻璃三角烧瓶中加入100ml的转化反应缓冲溶液(含20mmol/l醋酸钠缓冲液，ph 5.4，20mmol/l的cacl2，蔗糖12g。)，再加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液30u，在28℃温度、150rpm条件下催化反应30h，取反应液样品稀释100倍后，使用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)测定溶液中右旋糖酐的分子量及产物的含量。当反应至30h时终止反应，将三角烧瓶置于温度70℃水浴锅保温1h以灭活右旋糖酐蔗糖酶，用纱布滤过变性酶蛋白等杂质后，转化液再置于沸水浴中20分钟灭活残留的其它小分子蛋白，再于12000rpm离心10min除去蛋白杂质及其他不溶性杂质，上清液为乳状透明的含有大分子量右旋糖酐和果糖的混溶液，经hpgpc法检测，如图3色谱图所示，分别在9.590、18.193和18.870分钟处出现特征峰，其成分分别为右旋糖酐(分子量1020kda、分配系数1.20)、残留的蔗糖和大量的副产物果糖。混合溶液中的果糖按本研究小组的专利进行分离纯化(中国发明专利申请文献，专利申请号：202210698098.7)，即得到只含有大分子量的右旋糖酐溶液。再加入终浓度为50％的乙醇静置1h，高速离心得到右旋糖酐沉淀，沉淀物加纯净水加热溶解，再次加入无水乙醇到
50％，溶液静置2h，高速离心收集沉淀(上清液含有大量果糖和少量的二糖、三糖产物)，60℃烘箱烘干到恒重，即得右旋糖酐产品。
48.实施例4.右旋糖酐蔗糖酶转化蔗糖的制备低聚糖的实验
49.低聚糖也可以通过肠膜明串珠菌发酵生产，在蔗糖溶液中添加麦芽糖等受体来限制聚合物分子量的大小。本发明所指的右旋糖酐蔗糖酶，当在特定浓度的、可识别的外源受体(麦芽糖、异麦芽糖、葡萄糖等)存在时，该酶也能将葡糖基转移给外源受体而产生低聚糖，同时伴有果糖副产物的生成。本发明在250ml的玻璃三角烧瓶中加入100ml的转化反应缓冲溶液(含20mmol/l醋酸钠缓冲液，ph 5.4，蔗糖15g，麦芽糖7.5g。)，再加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液30u，在28℃温度、150rpm条件下催化反应30h，取反应液样品适当稀释后，使用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)测定溶液中低聚糖分子量及产物的含量，如图4色谱图所示，分别在16.857、18.193和18.873分钟处出现特征峰，其成分分别为低聚糖(分子量1451da、分配系数1.10)、残留的蔗糖和大量的副产物果糖。将反应液置于温度70℃水浴锅保温1h以灭活右旋糖酐蔗糖酶，用纱布滤过变性酶蛋白等杂质后，转化液再置于沸水浴中20分钟灭活残留的其它小分子蛋白，再于12000rpm离心10min除去蛋白杂质及其他不溶性杂质，上清液为透明的含有低聚糖和果糖的混溶液，加入无水乙醇到50％浓度，混匀后高速离心去除杂质，再加入无水乙醇到80％，静置1h，高速离心得到低聚糖沉淀(上清液含有大量果糖和少量的二糖、三糖产物)，沉淀加纯净水溶解，再次加入无水乙醇到80％，静置溶液1h，高速离心收集沉淀，60℃烘箱烘干，即得低聚糖产品。
50.实施例5.高纯度果糖的制备
51.将实施例3、实例4中含有大量果糖的醇沉后离心得到的上清液按本研究小组的专利进行分离纯化(中国发明专利申请文献，专利申请号：202210698098.7)，即含有大量果糖的醇沉上清液经200da截留分子量纳滤膜纳滤除去低聚糖和右旋糖酐，再经过反渗透除去钠离子等杂质，进一步蒸发浓缩，得到高纯度果糖，经检测，纯度为92％。
52.应该理解的是，对本领域的研究人员来说，根据上述说明的方法加以改进或变换，例如，所述的右旋糖酐蔗糖酶或其功能等同的突变体，或氨基酸序列高度相似的突变体，除了来源于肠膜状明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)，还可以来源于柠檬明串珠菌(leuconostoc citreum)之外、口腔链球菌(oral streptococcus)、乳酸明串珠菌(leuconostoc lactis)、大蒜明串珠菌(leuconostoc garlicum)、leuconostoc suionicum、芽孢杆菌属、放线菌、酸假孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热thermus属thermus thermophilus等菌株。所述的载体适于在大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等宿主中表达，也可通过电转化法、原生质体转化法和同源整合等方法将本发明的右旋糖酐蔗糖酶转入原核或者真核宿主中，以实现右旋糖酐蔗糖酶的表达和制备。或者按照上述说明的办法通过酶工程技术对本发明所述的突变体的某些区段的氨基酸残基进行剪除或替换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

技术特征：
1.一种编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其特征在于，所述基因为基因dsra，包括seq id no.1核苷酸序列序列。2.根据权利要求1所述的编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其特征在于，所述基因所编码的蛋白质，包括seq id no.2氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其特征在于，所述基因来源于肠膜状明串珠菌的右旋糖酐蔗糖酶基因，是通过设计引物从肠膜状明串珠菌基因组中克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因。4.根据权利要求3所述的编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其特征在于，通过对肠膜状明串珠菌进行非产酶条件的培养，培养基成分及培养条件：即lb液体培养基添加终浓度为1～2.0％(w/v)的蔗糖，于30℃，转速为200rpm的摇床培养30h，并提取其基因组dna为模板，设计引物对右旋糖酐蔗糖酶基因进行pcr扩增，引物序列如下：引物1序列：5
’‑
cagcatatgacctttacagaaaaagtaatgcgg-3’引物2序列：5
’‑
atactcgagttatgctgacacagcatttccattattatc-3’引物1序列的下划线为ndei酶切位点，引物2序列下划线为xhoi酶切位点。5.根据权利要求4所述的编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其特征在于，25μl的pcr反应体系：5
×
pspcr缓冲液5μl，dntp200μmol/l，引物各10pmol/l，基因组dna模板100ng，primestarhsdna聚合酶0.5个单位，加超纯水至反应总体积为25.0μl。6.根据权利要求4所述的编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其特征在于，pcr扩增程序如下：95℃3min；95℃30sec；58.5℃30sec；延伸温度和时间72℃4.5min；循环34次；72℃10min。7.根据权利要求6所述的编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其特征在于，采用pcr扩增程序获得pcr产物用试剂盒进行纯化后，再分别用ndei和xhoi内切酶进行酶切，将此dna片段连接到表达载体pet-22b(+)的ndei和xhoi酶切位点处，得到重组表达载体pet-22b-dsra，转化到大肠杆菌宿主菌e.colixl-1blue进行克隆筛选和全基因测序分析，最终将序列正确的表达质粒pet-22b-dsra转化到大肠杆菌rosetta(de3)中得到重组大肠杆菌rosetta(de3)/pet-22b-dsra。8.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1～7任一项所述的基因。9.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。10.一种根据权利要求2～7任一项所述的编码右旋糖酐蔗糖酶的基因的应用，其特征在于，所述的蛋白质在转化蔗糖制备右旋糖酐、低聚糖或果糖中的应用。

技术总结
本发明公开了一种右旋糖酐蔗糖酶基因及其应用，所述基因为基因dsrA，包括SEQ ID NO.1核苷酸序列序列，所述基因所编码的蛋白质，包括SEQ ID NO.2氨基酸序列。所述基因来源于肠膜状明串珠菌的右旋糖酐蔗糖酶基因，是通过设计引物从肠膜状明串珠菌基因组中克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因。该基因编码的蛋白质可用于制备右旋糖酐、低聚糖或果糖。本发明通过分析该酶的氨基酸组成，通过同源建模的方法获得了该酶的三维结构，从而为对该右旋糖酐蔗糖酶的分子改造以提高其活性和稳定性，为其工业化生产和应用提供技术支持。生产和应用提供技术支持。生产和应用提供技术支持。


技术研发人员：韦旭钦 陈发忠 陈欣怡 周志强 韦志明 邓慧连 陆江南 戴洪明 韦文孟 苏照环 许司粲 吴睿 阮恒 李广 曹志强 王则奋 吴建璋
受保护的技术使用者：广西产研院生物工程有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/24