分子标志物组合及其在制备嗜酸型慢性鼻窦炎诊断试剂中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及分子标志物组合及其在制备嗜酸型慢性鼻窦炎诊断试剂中的应用。


背景技术：

2.慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis,crs)是发生在鼻窦和副鼻窦，持续时间超过12周的慢性炎症。crs产生的鼻塞、鼻分泌物、嗅觉障碍等临床症状令人困扰，还可同时伴有哮喘、过敏性鼻炎等共患病，给社会带来了巨大的经济负担。根据嗜酸性粒细胞在局部炎症组织处的浸润程度，crs可分为嗜酸型(eosinophilic chronic rhinosinusitis,ecrs)与非嗜酸型(non-eosinophilic,non-ecrs)。ecrs主要以2型辅助性t细胞和相关细胞因子如白介素4、5、13产生为特点。两型在临床特点上差异显著。有研究表明，与non-ecrs相比，ecrs往往有更严重的病情和更高的术后复发率。与non-ecrs更适合大环内酯类药物治疗不同的是，局部或系统使用糖皮质激素对于ecrs效果更佳。因此，更好地对此进行区分在指导临床治疗，判断疾病预后等方面意义重大。
3.目前对于高倍镜视野下多少数量的嗜酸性粒细胞为两型界值尚未统一，使得更丰富的多中心临床研究，更准确的疾病治疗、预后研究困难重重。但值得一提的是，不同环境因素和宿主免疫系统之间的功能失调造成crs存在多种免疫反应失衡。有研究发现这些失衡的免疫分子与嗜酸性粒细胞存在紧密联系，如白介素4，5，13，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子均可促进嗜酸性粒细胞的生存、迁移、浸润，从而加重组织破坏和嗜酸性粒细胞参与的免疫失调。更好地了解这些分子通过嗜酸性粒细胞发挥作用的免疫机制，以及找寻新的免疫分子，发掘其与嗜酸性粒细胞联合应用的价值对更有效评估疾病免疫微环境，诊断疾病，判断疾病进展方向大有裨益。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供分子标志物组合及其在制备嗜酸型慢性鼻窦炎诊断试剂中的应用。
5.本发明提供的分子标志物组合包括如下i)～ii)中的任一项：
6.i)、cd40蛋白、cd40l蛋白、icos蛋白和icosl蛋白；
7.ii)、编码cd40蛋白的核酸、编码cd40l蛋白的核酸、编码icos蛋白的核酸和编码icosl蛋白的核酸。
8.cd40-cd40l，icos-icosl为正常免疫反应所必需的共刺激分子，表达于t细胞、b细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞等各种免疫细胞表面，在生发中心的形成，抗体的类别转换，t细胞的分化以及效应功能发挥，嗜酸性粒细胞的存活和细胞因子释放等过程中起了重要作用。本发明研究表明：通过局部炎性鼻窦组织处免疫组化染色结果显示嗜酸型患者cd40，icos，icosl的表达水平显著高于非嗜酸型患者(图1)。通过关联性分析找寻这些共刺激分
子与疾病发生发展的关系，结果表明cd40，cd40l，icos，icosl的表达水平与局部浸润以及外周循环嗜酸性粒细胞显著正相关(图2，3)。同时icos和icosl还与疾病严重程度呈显著相关关系(图4)。以上证据表明cd40，cd40l，icos和icosl可以做为嗜酸型慢性鼻窦炎诊断分子标志物。
9.本发明实施例中，所述cd40，cd40l，icos和icosl可为核酸或蛋白，其中，
10.所述cd40蛋白为homosapienschromosomex,grch38.p14primaryassembly，其pubmed登录号为nc_000023.11:136648158-136660390；
11.所述cd40l蛋白为homosapienschromosome20,grch38.p14primaryassembly，其pubmed登录号为nc_000020.11:46118314-46129858；
12.所述icos蛋白为homosapienschromosome2,grch38.p14primaryassembly，其pubmed登录号为nc_000002.12:203936763-203961577；
13.所述icosl蛋白为homosapienschromosome21,grch38.p14primaryassembly.其pubmed登录号为nc_000021.9:c44240943-44216981。
14.所述核酸为dna或rna，更具体的，为来自人类的cdna或者mrna。
15.进一步的，本发明提供了以如前所述的分子标志物组合为标志物，在制备鼻窦炎分型诊断试剂中的应用。
16.本发明中，所述分型诊断包括区分嗜酸型慢性鼻窦炎与非嗜酸型慢性鼻窦炎。
17.本发明中，所述分型诊断的标准包括：
18.嗜酸性粒细胞占总炎性细胞数量的百分比超过10％，则为嗜酸型慢性鼻窦炎；所述嗜酸性粒细胞为cd40，cd40l，icos和icosl阳性的细胞。
19.或者，样品满足cd40+＞22.3％，cd40l+＞39.2％，icos+＞30％或icosl+＞27％中至少一种则为嗜酸型慢性鼻窦炎。本发明中，所述分型诊断的标准还包括：cd40，cd40l，icos，icosl的表达水平高，则局部浸润以及外周循环嗜酸性粒细胞含量也高。或者，所述分型诊断的标准还包括：icos和icosl表达水平越高，则疾病严重程度越高。
20.更进一步的，本发明还提供了鼻窦炎分型诊断的试剂，其包括检测如前所述分子标志物组合的试剂。
21.所述分子标志物为核酸时则所述检测试剂中包括cd40的特异性引物、cd40l的特异性引物、icos的特异性引物和icosl的特异性引物。作为一种实施方案，其还可以包括cd40的靶向探针、cd40l的靶向探针、icos的靶向探针和icosl的靶向探针。
22.所述分子标志物为核酸，则检测试剂为实时荧光定量pcr检测试剂、qpcr检测试剂或微滴式数字pcr检测试剂。
23.所述分子标志物组合为蛋白，则所述检测试剂中包括cd40抗体、cd40l抗体、icos抗体和icosl抗体。
24.所述分子标志物组合为蛋白，则所述试剂为免疫组化检测试剂、酶联免疫吸附法检测试剂、间接免疫吸附测定检测试剂、斑点酶免疫吸附法检测试剂或免疫印迹法检测试剂。
25.本发明所述试剂中还包括样品前处理试剂，所述样品为鼻部组织。包括息肉或鼻甲、钩突组织标本。
26.更进一步的，本发明还提供了一种鼻窦炎分型诊断的方法，其包括对样本中的
cd40，cd40l，icos和icosl进行检测，根据cd40，cd40l，icos和icosl的表达水平，判断样本是否为ecrs或crs。
27.本发明提供了一种分子标志物组合，其包括cd40，cd40l，icos和icosl。并提供了该分子标志物组合在制备鼻窦炎分型诊断的试剂中的应用。研究表明，嗜酸型患者cd40，icos，icosl的表达水平显著高于非嗜酸型患者且cd40，cd40l，icos，icosl的表达水平与局部浸润以及外周循环嗜酸性粒细胞显著正相关，且icos和icosl还与疾病严重程度呈显著相关关系。
附图说明
28.图1示ecrs和non-ecrs局部鼻组织处共刺激分子的表达水平；
29.图2示cd40、cd40l、icos、icosl蛋白表达水平于区分ecrs和non-ecrs的roc(region of curve)曲线；
30.图3示crs患者局部鼻组织共刺激分子表达水平与组织嗜酸性粒细胞数的关系；
31.图4示crs患者局部鼻组织共刺激分子表达水平与外周嗜酸性粒细胞数的关系；
32.图5示crs患者局部鼻组织共刺激分子表达水平与疾病严重程度的关系。
具体实施方式
33.本发明提供了分子标志物组合及其在制备嗜酸型慢性鼻窦炎诊断试剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
34.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。例如：
35.anti-cd40抗体来自affinity biosciences,usa(af5336)；
36.anti-trap/cd40l抗体来自abcam,usa(ab65854)；
37.anti-icos抗体来自abcam,usa(ab233151)；
38.anti-icosl抗体来自abcam,usa(ab224644)。
39.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
40.实施例
41.1)实验试剂
42.本发明嗜酸型与非嗜酸型crs患者的炎性鼻组织标本来自苏州大学附属第一医院耳鼻咽喉科，其他所用试剂或耗材为普通市售或本领域技术人员通过公开途径可以获得的。
43.2)实验方法
44.经手术留取的息肉或鼻甲、钩突组织标本离体后用生理盐水冲洗，置于福尔马林溶液1-2天，石蜡包埋，每个样本切成数张4μm厚的白片，用于苏木素-伊红染色和免疫组化染色。
45.白片进行苏木素-伊红染色，首先进行切片脱蜡，依次将切片放入环保型脱蜡液ⅰ10min、环保型脱蜡液ⅱ10min、环保型脱蜡液ⅲ10min、无水乙醇ⅰ5min、无水乙醇ⅱ5min、无
水乙醇ⅲ5min，蒸馏水冲洗；然后将切片放置于苏木素染色液中染色3-8min，自来水漂洗，1％盐酸酒精分化数秒，自来水漂洗，1％氨水水溶液返蓝1min，流水冲洗数秒；接着将切片放入伊红染液中，室温下染色1-3min，取出流水漂洗数秒；最后将切片分别放置于75％乙醇2min、85％乙醇2min、无水乙醇i 5min、无水乙醇ii 5min、二甲苯i 5min、二甲苯ii 5min进行脱水，略晾干后中性树脂封片。显微镜下观察，根据嗜酸性粒细胞的浸润程度对每个纳入患者进行是否嗜酸的分型。
46.白片进行cd40，cd40l，icos，icosl分子的免疫组化染色，首先进行脱蜡，步骤同上；第二步抗原修复，条件为柠檬酸(ph＝6.0)，微波中火8min，停火8min，转中低火再持续7min。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将切片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；第三步将切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，然后将其置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，以阻断内源性过氧化物酶；第四步在组织处滴加3％牛血清白蛋白，进行室温30min的封闭；第五步一抗孵育，在切片上分别按比例滴加一抗(pbs稀释，稀释比为：cd40-1：100；cd40l-1：200；icos-1:500；icosl-1：200)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜；第六步在组织处滴加辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(1：500)，进行50min的室温孵育；第七步用dab显色液进行显色；第八步苏木素和苏木素返蓝液复染细胞核；最后按以上程序脱水封片。
47.3)分析方法
48.嗜酸型与非嗜酸型crs患者分组的判别标准：鼻组织经苏木素-伊红染色后，显微镜下随机选取5个高倍镜视野(x400)，由2名操作者独立计数每个视野中的嗜酸性粒细胞和总炎性细胞(包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞)，计算嗜酸性粒细胞百分比，求得均值，该值超过10％即为ecrs。
49.cd40，cd40l，icos，icosl分子经免疫组化染色后表达水平的分析：选取5个200倍的随机视野，由2名不知晓临床数据的操作人员人工计数阳性细胞，求得均值，各个指标的表达水平以阳性细胞数/高倍镜视野表示。
50.使用graphpad prism 7.0进行统计学分析并作图。使用shapiro-wilk test进行正态性检验，brown-forsythe test进行方差齐性分析。2组正态分布的数据进行比较时使用student’s unpaired t-test，否则使用mann-whitney u test。变量间的相关性分析根据是否符合正态分布分别使用pearson’s test或spearman’s test。p值小于0.05认为有统计学差异。
51.4)结果分析
52.回顾性收集2021.4月-5月期间因crs就诊于苏州大学附属第一医院耳鼻喉科，并行功能性内镜鼻窦手术的10例嗜酸型crs与21例非嗜酸型crs患者，采集鼻部组织标本，置于福尔马林溶液中，及时制成石蜡切片，根据苏木素-伊红染色结果分型。所有受试对象均获得知情同意并经伦理委员会批准(no.215)。受试者的临床特征见表1。
53.表1受试者的临床特征
[0054][0055]
注：连续变量为均数
±
标准差(mean
±
se)，分类变量用数量(百分比)表示。ecrs，嗜酸型慢性鼻窦炎；non-ecrs,非嗜酸型慢性鼻窦炎。
[0056]
对每个受试者的鼻部组织白片进行cd40，cd40l，icos，icosl免疫组织化学染色，具体步骤如上所述，分析组间目标分子的表达水平差异。图1结果表明嗜酸型患者局部组织处cd40，icos，icosl的表达水平显著高于非嗜酸型crs。相较于非嗜酸型，嗜酸型患者cd40l的表达水平也较高。接下来在所有31例crs患者中进行相关性分析。图2表示cd40，cd40l，icos，icosl蛋白表达水平于区分ecrs和non-ecrs的roc(region of curve)曲线，图3表明crs患者局部鼻组织处cd40，cd40l，icos，icosl表达水平均与局部浸润嗜酸性粒细胞数呈显著正相关关系。图4表明crs患者局部鼻组织处cd40，cd40l，icos，icosl表达水平与外周循环嗜酸性粒细胞数显著正相关。图5表明crs患者局部鼻组织处cd40，cd40l，icos，icosl表达水平与采用lund-mackay score评估的疾病严重程度相关关系。
[0057]
通过收集10例嗜酸型crs与21例非嗜酸型crs患者，进行cd40，cd40l，icos，icosl免疫组织化学染色，分析组间的表达差异，将目标分子的表达水平与临床指标做关联分析。所有结果均表明cd40，cd40l，icos，icosl与嗜酸性粒细胞浸润有密切关联，且这些指标可能参与疾病的发生发展，这提示其作为嗜酸型crs诊断分子标志物的价值。
[0058]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.分子标志物组合，其包括如下i)～ii)中的任一项：i)、cd40蛋白、cd40l蛋白、icos蛋白或icosl蛋白中至少一种；ii)、编码cd40蛋白的核酸、编码cd40l蛋白的核酸、编码icos蛋白的核酸或编码icosl蛋白的核酸中至少一种。2.根据权利要求1所述的分子标志物组合，其特征在于，所述cd40蛋白为homosapienschromosomex,grch38.p14primaryassembly，其pubmed登录号为nc_000023.11:136648158-136660390；所述cd40l蛋白为homosapienschromosome20,grch38.p14primaryassembly，其pubmed登录号为nc_000020.11:46118314-46129858；所述icos蛋白为homosapienschromosome2,grch38.p14primaryassembly，其pubmed登录号为nc_000002.12:203936763-203961577；所述icosl蛋白为homosapienschromosome21,grch38.p14primaryassembly.其pubmed登录号为nc_000021.9:c44240943-44216981。3.根据权利要求1所述的分子标志物组合，其特征在于，所述核酸为cdna或者mrna。4.以权利要求1～3任一项所述的分子标志物组合为标志物，在制备鼻窦炎分型诊断试剂中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述分型诊断包括区分嗜酸型慢性鼻窦炎与非嗜酸型慢性鼻窦炎。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述分型诊断的标准包括：嗜酸性粒细胞占总炎性细胞数量的百分比超过10％，则为嗜酸型慢性鼻窦炎；或者，样品满足cd40+＞22.3％，cd40l+＞39.2％，icos+＞30％或icosl+＞27％中至少一种则为嗜酸型慢性鼻窦炎。7.鼻窦炎分型诊断的试剂，其特征在于，包括检测权利要求1～3任一项所述分子标志物组合的试剂。8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述检测试剂中包括cd40抗体、cd40l抗体、icos抗体或icosl抗体中的至少一种。9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述试剂为免疫组化检测试剂、酶联免疫吸附法检测试剂、间接免疫吸附测定检测试剂、斑点酶免疫吸附法检测试剂或免疫印迹法检测试剂。10.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括样品前处理试剂，所述样品为鼻部组织。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及分子标志物组合及其在制备嗜酸型慢性鼻窦炎诊断试剂中的应用。研究表明，嗜酸型患者CD40，ICOS，ICOSL的表达水平显著高于非嗜酸型患者且CD40，CD40L，ICOS，ICOSL的表达水平与局部浸润以及外周循环嗜酸性粒细胞显著正相关，且ICOS和ICOSL还与疾病严重程度呈显著相关关系。系。


技术研发人员：焦晴晴 周爱娜 范煜辉 刘祉辰 解欢霞 王珏
受保护的技术使用者：苏州大学附属第一医院
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/24