细叶百合耐盐基因LpWRKY49及启动子的克隆与应用

细叶百合耐盐基因lpwrky49及启动子的克隆与应用
技术领域
1.本发明涉及基因技术领域，涉及一种细叶百合耐盐基因lpwrky49及启动子的克隆与应用。特别涉及一种细叶百合lpwrky49基因启动子的克隆、表达载体的构建、烟草的转化，以及所述基因在提高转基因烟草在盐胁迫抗性的应用。


背景技术：

2.wrky转录因子是植物中一类重要的转录因子，wrky转录因子可直接调控非生物胁迫相关基因的表达，参与植物生长发育、生物与非生物胁迫、激素信号传导通路和光信号通路等多种反应。以往的研究表明，wrky转录因子通过直接或间接参与植物响应盐、干旱、低温、高温等胁迫，在调节植物非生物胁迫过程中具有及其重要的地位。
3.细叶百合(lilium pumilum)又名山丹，百合科百合属多年生草本，其花大、钟状花形美观，花色红艳，具有很高的观赏价值，同时又有较强的抗病性和耐盐碱、耐干旱、耐寒等优良性状，是优质的百合种质资源。
4.本实验以细叶百合为研究对象，从细叶百合转录组中筛选出lpwrky49，用同源重组技术将其从细叶百合cdna中克隆出来，并借助fpni-pcr技术克隆其启动子，并分析启动子顺式作用元件，初步确定其潜在功能。进一步通过农杆菌介导的叶盘转化法得到转基因烟草，对其种子和幼苗进行耐盐功能验证，为进一步探究其响应高盐胁迫的分子机制奠定基础，同时为揭示细叶百合抗逆机理提供参考。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于筛选出一种细叶百合抗逆基因，并验证其耐盐功能。
6.为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：
7.提取细叶百合rna并反转录为cdna，克隆出一种细叶百合抗逆基因，其特征在于，该细叶百合抗逆基因含orf开放阅读框的部分，核苷酸序列长度为990bp，编码329个氨基酸。提取细叶百合基因组dna，用fpni-pcr技术克隆得到862bp lpwrky49启动子序列。
8.与现有技术相比，本发明的细叶百合抗逆基因带来的技术效果提升在于：
9.1、得到了细叶百合抗逆基因含orf开放阅读框的部分核苷酸序列，得到了lpwrky49的启动子序列。
10.2、根据申请人的实验可以证明，将该细叶百合lpwrky49基因转入烟草中，能够明显提高烟草的耐盐能力，可用于提高转基因植物的盐胁迫抗性。
11.通过以下步骤可以实现培育耐盐能力强的烟草品种：
12.1)从细叶百合盐胁迫转录组中筛选出一个wrky转录因子家族基因并命名为lpwrky49，用同源重组技术克隆lpwrky49基因并对其进行生物信息学分析；
13.2)使用fpni-pcr技术克隆其启动子序列并分析；
14.3)将构建的过表达载体质粒导入农杆菌eha105，通过农杆菌介导的叶盘法将lpwrky49基因转入烟草植株，利用潮霉素筛选阳性植株，采集阳性植株叶片提取dna和rna
进行分子水平鉴定；
15.4)将筛选得到的两个表达量高的转基因株系烟草株系的种子和野生型烟草种子接种于1/2ms培养基中，通过炼苗，移栽入土中，选取大小基本一致的烟草植株，进行300mmol/l的nacl盐胁迫处理，观察植物的生长状态，在0、7d、14d拍照并剪取相同部位的健康叶片并测定其生理指标。
附图说明
16.图1细叶百合rna提取电泳结果图；
17.图2-1细叶百合lpwrky49目的片段扩增电泳图，图2-2lpwrky49碱基及其编码的氨基酸序列；
18.图3细叶百合lpwrky49基因组dna内参基因电泳图；
19.图4细叶百合lpwrky49基因启动子序列的扩增，启动子克隆第二、三轮产物电泳图
20.图5细叶百合lpwrky49基因双元表达载体的构建，图5-1：lpwrky49加同源臂克隆产物电泳图；图5-2：植物表达载体gv1300双酶切产物电泳图；图5-3：重组质粒pcr电泳图
21.图6细叶百合lpwrky49基因转农杆后菌液pcr鉴定；
22.图7转基因烟草植株鉴定结果；a：转基因烟草t0代植株dna的pcr鉴定b：转基因烟草t0代植株rna的pcr鉴定；
23.图8为转基因烟草在盐胁迫处理后生理指标检测结果：其中，8-1为盐胁迫对转基因烟草光合指标的影响结果，8-2为盐胁迫后叶绿素含量的检测结果，8-3为盐胁迫对转基因烟草的抗氧化酶活性影响结果，8-4为盐胁迫对转基因烟草的脯氨酸、丙二醛含量和电导率含量的影响结果，8-5为盐胁迫对转基因烟草的过氧化氢和超氧阴离子含量的影响以及转基因烟草的nbt和dab组织染色定位分析；
24.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
25.实施例1细叶百合总rna的提取和cdna的合成
26.按照plant rna kit(omega)试剂盒说明书提取细叶百合总rna，琼脂糖凝胶电泳检测所提取rna质量，使用分光光度计检测rna浓度和纯度，电泳结果如图1所示。
27.按照revertra ace qpcr rt kit(toyobo)说明书将提取的rna反转录为cdna，反应程序为：37℃15min；98℃5min；4℃forever。反应产物保存于-20℃冰箱备用。
28.实施例2细叶百合lpwrky49基因引物设计与pcr扩增根据细叶百合基因的编码区序列，用primer premier 5设计特异性引物：lpwrky49-f：ccttatctccttccctctcaacactlpwrky49-r：acatttagtttgcttgcattctgtc；进行编码区序列的克隆：以细叶百合cdna为模板，按照高保真酶kod-plus-neo(toyobo)说明书进行pcr扩增反应，总反应体系50μl，其中：
pcr扩增程序如下：94℃预变性2min；95℃变性30sec，55.5℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃最终延伸5min，4℃forever。pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳，准确切取位置无误的目的条带，放置于1.5ml离心管，按照gel extraction kit(omega)试剂盒说明书对pcr产物进行纯化回收，取5μl胶回收产物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳观察条带位置是否正确，将检验合格的胶回收产物保存于-20℃冰箱备用。目的片段扩增电泳图结果如图2-1所示。
29.实施例3克隆载体的构建及大肠杆菌的转化将回收产物连接到transgen peasy-blunt cloning vector克隆载体上：根据说明书将4μl胶回收产物、1μl peasy-blunt cloning vector依次加入0.2ml的pcr管中。轻轻混合，在pcr仪器上控制温度为37℃，反应5min。反应结束后将连接产物置于冰上，按照trans-t1说明书进行大肠杆菌的转化：(1)将连接产物加入50μl刚刚解冻的感受态大肠杆菌中，冰上静止30min；(2)42℃水浴热激30s后立即置于冰上2min；(3)加入500μl预热(37℃)的无抗生素lb液体培养基，于37℃摇床中200rpm摇晃1h；(4)取出含有菌液的离心管，4500rpm离心1min，弃部分上清，保留150μl吹打混匀得到重悬菌液；(5)每个培养基吸取75μl重悬菌液涂于含50mg/l amp的lb固体培养基上，37℃倒置过夜。阳性克隆筛选与鉴定：次日于上一步过夜培养的培养基中挑取单克隆菌落于10μl ddh2o中，吸打混匀，并取出1μl重悬菌液，使用载体的通用引物m13及2
×
t5 super pcr mix(colony)进行pcr验证。条带正确的用载体通用引物m13测序，比对测序结果发现与转录组序列一致。证明用lpwrky49基因被成功克隆。lpwrky49基因orf长度为990bp，编码329个氨基酸，图2-2表示lpwrky49碱基其编码的氨基酸序列。总反应体系25μl，其中：
pcr扩增程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸15sec，循环35次；72℃最终延伸2min，4℃forever。pcr反应完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测并观察条带位置，将条带明亮、单一且位置正确的单克隆菌液，加入10ml含50mg/l amp的lb液体培养基中，37℃，200rpm，振荡过夜培养。菌液按照ezna plasmid mini kit i(omega)试剂盒说明书提取质粒，用分光光度计测量其浓度和纯度并记录，保存于-20℃备用。
30.实施例4细叶百合基因组dna的提取及lpwrky49基因启动子序列的扩增以细叶百合基因组dna为模板，使用lily actin基因进行pcr扩增，条带1-5、7-9单一且清晰明亮(图3)。经分光光度计检测所提取的细叶百合基因组dna质量和纯度，a20/a280大小在1.7-1.9之间，无蛋白质及酚类物质的污染。以上说明dna质量较好，可以用于后续实验。根据lpwrky49基因已知序列设计特异性引物，以细叶百合基因组dna为模板进行pcr扩增。经三轮pcr扩增后得到1000bp左右的片段(图4)，将fp3和fp6引物得到的第三轮pcr产物胶回收纯化后连接pmd-18t载体后，转化大肠杆菌，并测序。fp6引物得到的测序结果与lpwrky49基因已知序列对比有94bp重合部分，认为成功克隆出部分lpwrky49启动子序列，去除接头产物和简并引物序列后得到862bp的片段。由于第一次fpni-pcr扩增得到的序列较短，根据第一次扩增得到的序列设计特异性引物进行第二次扩增。将第二次fpni-pcr扩增得到的序列与已知序列进行比对，无新片段被克隆。两次克隆共得到了lpwrky49基因的5’端上游862bp的启动子序列。经在ncbi上的blast比对，未发现其同源片段，说明此次克隆得到了细叶百合lpwrky49基因中新的862bp核苷酸序列。
31.实施例5细叶百合lpwrky49双元表达载体的构建根据植物表达载体gv1300图谱以及lpwrky49基因orf序列，使用snapgene软件设计同源重组引物序列，扩增出带有同源臂的目的片段，引物序列如下所示：lpwrky49-ty-f ttgatacatatgcccgtcgacatggaggaagtagaaglpwrky49-ty-r cccttgctcaccatggatccgagaatgctagacag以克隆测序正确的质粒为模板，使用lpwrky49-ty引物和kod进行pcr扩增，扩增产物的电泳图如图所示，条带长度为1028bp(图5-1)，与预期长度一致，对目的片段胶回收后保存到-20℃冰箱备用。使用两种限制性内切酶sali和bamhi(taraka)将gv1300空载质粒进行双酶切，反应体系如下，使用pcr仪控制温度维持在37℃，20min。反应结束后将产物通过在1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图5-2。将目的条带进行胶回收保存于-20℃冰箱备用。总反应体系50μl，其中：
将线性化载体和插入片段质粒进行同源重组反应，重组产物转化大肠杆菌感受态dh5α，在lb固体培养基上过夜培养后挑取单克隆菌落进行菌液pcr验证，引物选取gv1300载体和目的片段的交叉引物。菌液pcr后电泳检测结果如图5-3所示。表明条带1-6中，目的基因片段成功连接至载体，命名为gv1300-lpwrky49-gfp。提取条带正确的阳性菌液的质粒，置于-20℃冰箱保存备用。总反应体系20μl，其中：
32.实施例5植物表达载体转化农杆菌使用冻融法将重组质粒转化到农杆菌感受态eh5105，在yep固体培养基培养36-48h后挑取单克隆菌落，使用gv1300载体引物，电泳结果如图6所示，获得1028bp的产物，与预期长度一致，说明重组质粒成功转化至农杆菌1、和3-10中。具体方法如下：(1)从-80℃冰箱中取出eha105农杆菌感受态细胞置于室温，当其部分融化处于冰水混合物时立即插入冰中；(2)将1μl3.2.1.3中的重组质粒加入100μleha105农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；(3)依次置于冰上静置5min，液氮速冻5min，37℃水浴热激5min，冰浴5min；(4)在离心管中加入700μl不含抗生素的yeb培养基，放入振荡培养箱中，28℃，200rpm，振荡培养2-3h；(5)6000rpm离心1min；弃部分上清，留250μl左右重悬菌体，将重悬液涂于yep固体培养基平板(含kana 50mg/l、rif 30mg/l)上，28℃倒置培养2-3天；(6)培养完成后，准确挑取单克隆菌落置于10ml yep液体培养基中(含50mg/l kana及25mg/l rif)，28℃，200rpm震荡培养12
ꢀ‑
16h。之后取1μl菌液为模板，使用lpwrky49-ty进行pcr验证。鉴定出阳性单克隆菌落后，将条带正确的菌液吸取500μl与50％的甘油等体积混合均匀，-80℃超低温冰箱保存备用。
33.实施例6烟草的转化及转基因阳性烟草的鉴定将构建好的过表达载体通过叶盘侵染法侵染烟草叶片，利用潮霉素筛选转基因烟草抗性植株，预培养完成的烟草叶片使用转化成功的农杆菌侵染后置于植物组织培养室，每隔2d观察形态变化。经农杆菌液侵染的试验组在含25mg/l的潮霉素培养基上则在侵染10d后左右部分开始分化出愈伤组织，在28d后分化出大量愈伤组织，并长出不定芽。一部分不定芽正常生长，还有一部分则黄化死亡。共11棵植株在筛选培养基上正常生长直至生根
的植株初步确认为阳性植株。提取转基因烟草和野生型烟草的dna后，以野生型烟草的dna和水为阴性，重组质粒为阳性对照，用gv1300载体引物和kod酶进行pcr反应，电泳结果如图7a，条带3-5、9-11的位置与菌液的位置一致，而野生型烟草和水中没有检测到lpwrky49基因。提取dna检测为阳性植株的rna并反转录为cdna，以野生型烟草的cdna和水为阴性对照，重组质粒为阳性对照，用gv1300载体引物和kod酶进行pcr反应，电泳结果如图7b，条带1、3-6的位置与菌液的位置一致，而野生型烟草和水中没有检测到lpwrky49基因。dna和rna检测均为阳性的植株确认为转细叶百合lpwrky49基因烟草，命名为oe-1到oe-5。为了进一步探究lpwrky49基因在盐胁迫中的作用，选择表达量最高的两个株系oe2和oe4进行后续的试验。
34.实施例7验证转基因植株耐盐性挑选饱满的烟草种子分别播在含有0mm、300mmnacl的1/2ms培养基中，每个培养基平均分为四份，分别播种野生型烟草种子、转gv1300空载体种子以及两个转细叶百合lpwrky49基因烟草种子20粒。每个处理重复三次，播种后置于植物培养室。在植物培养室继续培养2周后选取长势一致的烟草植株每隔一天使用100ml 300mm的nacl溶液进行盐胁迫。在盐处理的0d、7d、14d拍照，测量光合指标、进行dab及nbt染色、测定叶绿素含量和叶绿素荧光参数、测定抗氧化酶活性、测量电导率并取足量的健康叶片用锡纸包裹储存于-80℃超低温冰箱保存备用。结果分别如图8所示。
35.结果表明，转基因烟草植株具有较强的耐盐的能力。

技术特征：
1.一种细叶百合lpwrky49耐盐基因及其启动子的克隆和功能分析，其特征在于细叶百合耐盐基因用于提高转基因植物盐胁迫能力的应用，包括：(1)目的基因及启动子的克隆；(2)表达载体的构建；(3)转基因植株生理指标的检测。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，按以下步骤进行：1)选取野生型细叶百合(lilium pumilum)组培苗进行lpwrky49基因分离鉴定及其启动子克隆；2)将细叶百合耐盐基因和植物表达载体gv1300-gfp用双酶切后进行同源重组反应，构建烟草过表达载体；3)将烟草过表达载体质粒用电转化法导入农杆菌eha105中，利用农杆菌介导法侵染烟草叶片，利用潮素筛选阳性植株，采集阳性植株叶片提取dna和rna进行分子水平鉴定；4)将所筛选得到的烟草株系的种子和野生型烟草种子接种于1/2ms培养基中，通过炼苗，移栽入土中，选取大小基本一致的烟草植株，进行300mmol/l的nacl盐胁迫处理；5)观察经nacl盐胁迫处理烟草的生长状态，在0、7d、14d取样，测量光合指标、进行dab及nbt染色、测定叶绿素含量和叶绿素荧光参数、测定抗氧化酶活性、测量电导率。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于细叶百合lpwrky49基因在异源表达提高了转基因烟草盐胁迫中的抗性，所述细叶百合lpwrky49基因编码的蛋白质的氨基酸序列329个。

技术总结
本发明涉及基因技术领域，涉及一种细叶百合(Lilium pumilum)耐盐基因LpWRKY49及启动子的克隆与应用。包括以下步骤：(1)目的基因及启动子的克隆；(2)表达载体的构建；(3)转基因植株生理指标的检测。本项实验以细叶百合为研究对象，从细叶百合转录组中筛选出LpWRKY49，用同源重组技术将其从细叶百合cDNA中克隆出来，并借助FPNI-PCR技术克隆其启动子，并分析启动子顺式作用元件，初步确定其潜在功能。进一步通过农杆菌介导的叶盘转化法得到转基因烟草，对其种子和幼苗进行耐盐功能验证，为进一步探究其响应高盐胁迫的分子机制奠定基础，同时为揭示细叶百合抗逆机理提供参考。同时为揭示细叶百合抗逆机理提供参考。


技术研发人员：李徐斐 王依萍 张彦妮
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/24