一种同时检测两种新冠病毒突变体的双适配体传感器及其应用

1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测两种新冠病毒突变体的双适配体传感器及其应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.sars-cov-2的某些变异体危险性高，其中，sars-cov-2刺突蛋白上的关键突变d614g和l452r具有增强的病毒传染性、免疫逃避和抗体中和性。为了快速分离高风险或疫苗缺陷感染者，流行病学评估sars-cov-2的演变，并有效指导疫苗的使用和迭代开发，亟需开发一种对sars-cov-2病毒d614g和l452r突变的快速、简单的基因分型方法。
4.在目前的新冠病毒检测方法中，血清学方法廉价快速但通常面临假阴性结果的干扰。逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)是新冠病毒核酸检测的金标准，但需要精密的仪器和严格的温度控制，有时会面临假阳性信号的干扰。环介导等温扩增法(lamp)操作简便，特异性强，但需要复杂的序列设计。重组酶聚合酶扩增(rpa)在恒定低温下就可进行，但是当同时进行多个扩增反应时需要精心设计引物组合，对模板进行定量时需要调整反应条件，减慢反应速度。簇状规则间隔短回文重复序列(crispr)灵敏、廉价，但是预组装cas-crrna复合物可能导致高背景信号。此外，cas9和cas12a系统严格要求dsdna靶序列上具有原间隔基序(pam)，这限制了核酸分析的普遍性。重要的是，以上这些方法的共同缺点是对特定位点的检测特异性不够，不能很好的区分野生型和突变型，不能满足超灵敏检测新冠病毒rna特定位置基因突变的需求。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足，本发明提供一种同时检测两种新冠病毒突变体的双适配体传感器及其应用。具体的，本发明开发了一种基于滚环转录(rct)扩增法的rna适配体传感器，利用激活的两种rna适配体作为输出信号，对sars-cov-2关键突变d614g和l452r进行均相、无标记、超灵敏同时检测。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一个方面，提供一种同时检测两种新冠病毒突变体的双适配体传感器，所述双适配体传感器至少包括d614g线性挂锁探针以及l452r线性挂锁探针。
8.其中，所述新冠病毒突变体为含有d614g和/或l452r的新冠病毒突变体。
9.所述d614g线性挂锁探针包含t7启动子互补序列、d614g突变型rna和broccoli互补序列以及nb.bbvci切刻内切酶互补序列。
10.所述d614g挂锁探针的核苷酸序列如seq id no.13所示；
d614g(青色柱)、mis-2-d614g(绿色柱)、mis-3-d614g(橙色柱)、malat1(蓝色柱)、hotair(紫色柱)和d614g野生型rna(对照，灰色柱)的荧光强度。(b)测量l452r突变型rna(品红色柱)、mis-1-l452r(青色柱)、mis-2-l452r(绿色柱)、mis-3-l452r(橙色柱)、malat1(蓝色柱)、hotair(紫色柱)和l452r野生型rna(对照，灰色柱)的荧光强度。(c)同时检测d614g突变和l452r突变的特异性实验。红色表示d614g突变，绿色表示l452r突变。d614g和l452r挂锁探针的浓度均为1.2微摩尔每升，rna的浓度均为600纳摩尔每升。误差棒表示三次平行实验的标准偏差。
30.图5为本发明实施例评估该方法在混合物中区分d614g/l452r突变的能力。(a)混合物中区分d614g突变的能力。初始混合物中d614g突变型rna的浓度是1纳摩尔每升，d614g挂锁探针、splintr连接酶、exo i、exo iii、rnase h、ntps、t7启动子、ntps、t7 rna聚合酶、dfhbi-1t的浓度分别是1.2微摩尔每升，7.5u,10u,20u,0.5u,2.4微摩尔每升,30u和10微摩尔每升。激发和发射波长分别是470、507纳米。(b)混合物中区分d614g突变的能力。初始混合物中l452r突变型rna的浓度是1纳摩尔每升，l452r挂锁探针、splintr连接酶、exo i、exo iii、rnase h、t7 rna启动子、ntps、t7 rna聚合酶、to1-3peg-biotin的浓度分别是1.2微摩尔每升，7.5u,10u,20u,0.5u,2.4微摩尔每升,30u和100纳摩尔每升。激发和发射波长分别是495、535纳米。cm表示实际测得的混合物中d614g/l452r突变型rna的浓度，c表示混合物中总rna的浓度。
31.图6为本发明实施例实际样品检测。(a)sars-cov-2假病毒诱导的响应d614g突变的浓度依赖性荧光发射光谱。(b)响应d614g突变的荧光强度对sars-cov-2假病毒浓度的对数线性图。d614g突变型rna、d614g挂锁探针、splintr连接酶、exo i、exo iii、rnase h、t7启动子、ntps、t7 rna聚合酶、dfhbi-1t的浓度分别是600纳摩尔每升，1.2微摩尔每升，7.5u,10u,20u,0.5u,2.4微摩尔每升，30u和10微摩尔每升。激发和发射波长分别是470、507纳米。(c)sars-cov-2假病毒诱导的响应l452r突变的浓度依赖性荧光发射光谱。(d)响应l452r突变的荧光强度对sars-cov-2假病毒浓度的对数线性图。l452r突变型rna、l452r挂锁探针、splintr连接酶、exo i、exo iii、rnase h、t7启动子、ntps、t7 rna聚合酶、to1-3peg-biotin的浓度分别是600纳摩尔每升，1.2微摩尔每升，7.5u,10u,20u,0.5u,2.4微摩尔每升，30u和100纳摩尔每升。激发和发射波长分别是495、535纳米。误差棒表示三个独立实验的标准差。
32.图7为本发明实施例中检测咽拭子和食品包装中的新冠突变。(a)咽拭子中d614g突变的检测。(b)食品包装中d614g突变的检测。d614g突变型rna、d614g挂锁探针、splintr连接酶、exo i、exo iii、rnase h、t7启动子、ntps、t7 rna聚合酶、dfhbi-1t的浓度分别是600纳摩尔每升，1.2微摩尔每升，7.5u,10u,20u,0.5u,2.4微摩尔每升，30u和10微摩尔每升。激发和发射波长分别是470、507纳米。(c)咽拭子中l452r突变的检测；(d)食品包装中l452r突变的检测。l452r突变型rna、l452r挂锁探针、splintr连接酶、exo i、exo iii、rnase h、t7启动子、ntps、t7 rna聚合酶、to1-3peg-biotin的浓度分别是600纳摩尔每升，1.2微摩尔每升，7.5u,10u,20u,0.5u,2.4微摩尔每升，30u和100纳摩尔每升。激发和发射波长分别是495、535纳米。每个浓度进行5次重复实验(双尾学生t检验，**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001)。
具体实施方式
33.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
34.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
35.现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.如前所述，现有新冠病毒检测方法缺点是对特定位点的检测特异性不够，不能很好的区分野生型和突变型，不能满足超灵敏检测新冠病毒rna特定位置基因突变的需求。
37.有鉴于此，本发明提供了将两种新冠病毒突变型rna：d614g和l452r作为目标物，利用激活的西兰花(broccoli)和芒果(mango iii(a10u))适配体作为信号输出，结合t7 rna聚合酶辅助的滚环转录(rct)信号扩增，开发了一种基于“挂锁工艺”进行特异性识别的双适配体传感器，对新冠假病毒及血清样本、咽拭子和食品包装中的d614g和l452r点突变进行超灵敏检测。我们设计了针对d614g和l452r突变的两个线性挂锁探针，具有目标识别、rct反应和信号转导等功能。当靶标d614g突变型rna或l452r突变型rna存在时，d614g或l452r挂锁探针分别识别靶标d614g或l452r突变型rna，在splintr连接酶作用下环化，产生用于体外转录的环形探针模板。接下来消化处理，消除未连接挂锁探针的非特异性扩增。随后启动滚环转录，产生丰富的长链串联broccoli和mango iii的rna适配体重复序列，当分别与染料dfhbi-1t和to1-3peg-biotin以高亲和力结合后，染料被激活而产生明亮的荧光信号。rct作为一种等温扩增方法，不需要复杂的修饰/分离步骤，不需要逆转录，具有极高的灵敏度，对d614g突变型rna和l452r突变型rna的检出限分别为9.33
×
10-18
摩尔每升(相当于5.62拷贝每微升或56.2拷贝)和7.12
×
10-18
摩尔每升(相当于4.29拷贝每微升或42.9拷贝)。此外，对于sars-cov-2假病毒的检出限分别为4.71拷贝每微升(d614g)和4.51拷贝每微升(l452r)。该方法信噪比高(d614g信噪比358倍，l452r信噪比23倍)，特异性好，可以准确区分新冠病毒d614g/l452r的单核苷酸变异，也可以区分咽拭子和食品包装中的sars-cov-2感染及其单核苷酸变异。
38.因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种同时检测两种新冠病毒突变体的双适配体传感器，所述双适配体传感器至少包括d614g线性挂锁探针以及l452r线性挂锁探针；
39.其中，所述新冠病毒突变体为含有d614g和/或l452r的新冠病毒突变体。
40.所述d614g线性挂锁探针包含t7启动子互补序列、d614g突变型rna和broccoli互补序列以及nb.bbvci切刻内切酶互补序列；
41.所述l452r挂锁探针包含t7启动子互补序列、l452r突变型rna和mango iii互补序列以及nb.bbvci切刻内切酶互补序列。
42.本发明的又一具体实施方式中，所述双适配体传感器还包含t7启动子、splintr连接酶以及小分子染料。
43.其中，所述小分子染料包括dfhbi-1t和to1-3peg-biotin。
44.本发明的又一具体实施方式中，
45.所述d614g挂锁探针的核苷酸序列如seq id no.13所示；
46.所述l452r挂锁探针的核苷酸序列如seq id no.14所示。
47.本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒至少含有上述双适配体传感器。
48.本发明的又一具体实施方式中，所述检测试剂盒还含有酶、酶抑制剂、缓冲液、反应试剂等，在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒还含有atp、ntps、核糖核酸酶抑制剂、t4 rna连接酶反应缓冲液、核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶h、rnase h缓冲液以及tbe缓冲液中的一种或多种，在此不做具体限定。
49.本发明的又一具体实施方式中，提供上述双适配体传感器和/或检测试剂盒在同时检测两种新冠病毒突变体和/或制备同时检测两种新冠病毒突变体的产品中的应用。
50.所述两种新冠病毒突变体具体为含有d614g的新冠病毒突变体和含有l452r的新冠病毒突变体。
51.本发明的又一具体实施方式中，提供一种同时检测两种新冠病毒突变体的方法，所述方法包括采用上述双适配体传感器和/或检测试剂盒对待测样品进行检测。
52.所述待测样品可以为含有或疑似含有上述两种新冠病毒突变体的样品，包括但不限于离体生物样品(如咽喉液、肺泡灌洗液、唾液、痰液、血液、尿液和粪便等)以及环境样品(气体(如气溶胶)、水体(如生活废水)、商品(如食品)包装)等。
53.本发明的又一具体实施方式中，提供上述检测方法在如下任意一种或多种中的应用：
54.(a)新冠病毒以及由新冠病毒引发的相关疾病的基础研究；
55.(b)新冠病毒检测以及由新冠病毒引发的相关疾病的诊断；
56.(c)新冠病毒相关药物的制备和/或筛选。
57.需要说明的，本发明虽然以对新冠病毒突变体d614g和l452r的同时检测为例，提供双适配体传感器、检测试剂盒以及检测方法，但是基于本发明的构思，用于检测其他新冠病毒变体乃至其他病毒等也是容易想到的，因此理应属于本发明的保护范围。
58.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。同时，在本发明实施例中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
59.实施例
60.实验方法
61.环形探针的制备：d614g环形探针和l452r环形探针的制备包括连接反应和消化反应。其中，连接反应包括两个连续的步骤。首先，在8.7微升体系中，加入1.2微升10微摩尔每升的d614g线性挂锁探针、1.2微升10微摩尔每升的l452r线性挂锁探针、1微升d614g突变型rna、1微升l452r突变型rna以及20u的核糖核酸酶抑制剂(rri)，在1
×
t4 rna连接酶反应缓冲液(50毫摩尔每升tris-hcl、10毫摩尔每升氯化镁、1毫摩尔每升dtt，ph 7.5)中，95℃退
火5分钟，然后缓慢冷却至室温。然后，在反应溶液中加入7.5u的splintr dna连接酶和1微升100微摩尔每升的atp，形成10微升的混合溶液，在25℃下孵育30分钟进行连接反应。消化反应在20微升的体系中进行。10u的核酸外切酶i(exo i)、20u的核酸外切酶iii(exo iii)、2.5u的核糖核酸酶h(rnase h)，在1
×
rnase h缓冲液(50毫摩尔每升tris-hcl、75毫摩尔每升氯化钾、3毫摩尔每升氯化镁、10毫摩尔每升dtt，ph 8.3)中，37℃反应1小时，随后在80℃持续20分钟终止反应。
62.滚环转录：rct反应在42微升体系中进行。上述20微升d614g和l452r环形探针、2.4微升10微摩尔每升的t7启动子、2.4微升25毫摩尔每升核苷三磷酸(ntps)、30u的t7 rna聚合酶、20u的核糖核酸酶抑制剂(rri)、6微升100微摩尔每升的dfhbi-1t和6微升100纳摩尔每升的to1-3peg-biotin，在1
×
rna聚合酶反应缓冲液(40毫摩尔每升tris-hcl、1毫摩尔每升dtt、2毫摩尔每升亚精胺，ph 7.9)中，在37℃反应3小时，随后在80℃持续10分钟终止反应。
63.凝胶电泳和荧光检测：在1
×
tbe缓冲液(9毫摩尔每升tris-hcl，9毫摩尔每升硼酸，0.2毫摩尔每升edta，ph 7.9)中，以1
×
sybr gold作为指示剂，采用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)在室温下对连接产物进行分析。在1
×
tae缓冲液(40毫摩尔每升三乙酸乙酯、1毫摩尔每升edta，ph 8.0-8.6)中，以1
×
sybr gold作为指示剂，采用2％琼脂糖凝胶电泳在室温下对扩增产物进行分析。使用bio-rad chemidoc mp成像系统可视化凝胶图像。采用爱丁堡fls1000稳态/瞬态荧光光谱仪测量反应产物的荧光光谱，激发和发射狭缝均设置为5.0纳米。适配体broccoli/dfhbi-1t的激发波长为470纳米,光谱记录范围为485-650纳米,并将507纳米处的荧光强度用于d614g突变的定量分析；适配体to1-3peg-biotin的激发波长为495纳米，光谱记录范围为515-650纳米，并将535纳米处的荧光强度用于l452r突变的定量分析。
64.rna病毒检测：根据制造商说明使用beaverbeads
tm
的病毒dna/rna试剂盒从sars-cov-2-mt-b.1.617.2假病毒中提取rna。连接反应分两步进行。首先，在8.7微升体系中，0.6微升提取的假病毒rna与1.2微升10微摩尔每升的d614g线性挂锁探针、1.2微升10微摩尔每升的l452r线性挂锁探针、20u的核糖核酸酶抑制剂(rri)混合，在1
×
t4 rna连接酶反应缓冲液(50毫摩尔每升tris-hcl、10毫摩尔每升氯化镁、1毫摩尔每升dtt，ph 7.5)中，95℃退火5分钟，然后缓慢冷却至室温。然后，在反应溶液中加入7.5u的splintr dna连接酶和1微升100微摩尔每升的atp，形成10微升的混合溶液，在25℃下孵育30分钟进行连接反应。消化反应和rct反应与上述实验步骤一致。
65.咽拭子和食品包装上sars-cov-2假病毒的检测：阴性咽拭子样本取自zhang实验室的健康供体，并存放在200μl 1摩尔每升nano3处理液中。将sars-cov-2假病毒掺入咽拭子样本或涂抹在食品包装表面。使用洗涤缓冲液(200μl 1摩尔每升nano3)收集食品包装上的病毒。使用海狸(beaverbeads)病毒dna/rna试剂盒(70406-100，100rxns)提取咽拭子样本或洗涤缓冲液中的病毒rna。
66.实验结果
67.d614g/l452r突变的检测原理(图1)：反应系统由d614g和l452r线性挂锁探针、靶标d614g和l452r突变型rna、t7启动子组成。d614g挂锁探针包含t7启动子互补序列(绿色，图1)、d614g突变型rna和broccoli互补序列(宝蓝，图1)、nb.bbvci切刻内切酶互补序列(黄
色，图1)。l452r挂锁探针包含t7启动子互补序列(绿色，图1)、l452r突变型rna和mango iii互补序列(紫色，图1)、nb.bbvci切刻内切酶互补序列(黄色，图1)。本方法包括三个连续步骤:(1)d614g或l452r挂锁探针分别识别靶标d614g或l452r突变型rna，在splintr连接酶作用下环化，产生用于体外转录的环形探针模板；(2)消化未连接的探针，减少非特异性扩增；(3)滚环转录，扩增出具有串联重复序列的长链rna，长链rna自组装成broccoli或mango iii适配体结构，当加入小分子染料dfhbi-1t或to1-3peg-biotin时，染料嵌入发卡内部形成适配体-染料复合物，染料分子被激活产生增强的荧光信号。然而，当对照野生型d614g/l452r rna存在时，挂锁探针不会被特异性连接，也不会发生滚环转录，只有游离的dfhbi-1t和to1-3peg-biotin，因此几乎没有信号。
68.1、可行性实验
69.为了验证该方法的可行性，我们分别进行了凝胶电泳和荧光测定(图2)。图2a验证了连接反应和消化反应的成环产物。泳道1是一条37碱基的d614g突变型rna的条带(图2a，泳道1)。当靶标d614g突变型rna和d614g挂锁探针存在时，观察到130碱基对附近出现一条分子量较大的条带(图2a，泳道2)，表明d614g挂锁探针被连接为环形探针。而当d614g野生型rna存在时，未观察到d614g环形探针(图2a，泳道3)，说明未环化的d614g挂锁探针被消化完全。类似地，泳道4是一条37碱基的l452r突变型rna的条带(图2a，泳道4)。当l452r突变型rna和l452r挂锁探针存在时，观察到100碱基对附近出现一条明显的条带(图2a，泳道5)，表明l452r挂锁探针被连接为环形探针。而当l452r野生型rna存在时，未观察到l452r环形探针(图2a，泳道6),说明未连接的l452r挂锁探针被消化完全。此外，当d614g突变型rna、d614g挂锁探针、l452r突变型rna、l452r挂锁探针同时存在时，观察到d614g环形探针和l452r环形探针的两条亮带(图2a，泳道7)。然而，当d614g野生型rna、d614g挂锁探针、l452r野生型rna、l452r挂锁探针同时存在时，未观察到d614g环形探针和l452r环形探针的条带(图2a，泳道8)。
70.通过琼脂糖凝胶电泳验证了靶标rna引发的rct反应。当d614g野生型rna或l452r野生型rna存在时，没有观察到扩增现象(图2b，泳道2、4、6)。然而，当d614g突变型rna存在时，观察到一条宽的明亮条带，这说明发生了rct反应，产生具有串联重复序列的西蓝花(broccoli)长链rna(图2b，泳道1)。类似地，当l452r突变型rna存在时，观察到一条宽的明亮条带，说明发生了rct反应，产生具有串联重复序列的芒果(mango iii)长链rna(图2b，泳道3)。此外，当d614g突变型rna和l452r突变型rna同时存在时，也能观察到一条宽的明亮条带，说明同时发生两个rct反应，产生了具有broccoli和mango iii序列的rna条带(图2b，泳道5)。这些结果都证实了突变型病毒rna的识别过程和rct过程。
71.为了验证本方案同时检测d614g突变和l452r突变的可行性，进行了荧光检测。当存在600纳摩尔每升的d614g突变型rna时，在507纳米处产生了明显的荧光信号，而d614g野生型rna几乎没有信号产生，实验组产生的荧光信号是对照组的353倍(图2c)。当存在600纳摩尔每升的l452r突变型rna时，在535纳米处产生了明显的荧光信号，而l452r野生型rna几乎没有信号产生，实验组产生的荧光信号是对照组的23倍(图2d)。高信噪比来源于以下三方面：
72.(1)splintr连接酶的特异性连接；(2)消化过程大大降低了未连接挂锁探针的非特异性扩增；
73.(3)rct反应具有高扩增效率。
74.2、灵敏度检测
75.为了评价该方法的灵敏度，我们在优化的实验条件下测量了荧光强度对不同浓度d614g和l452r突变型rna的响应。如图3a所示，当d614g突变型rna的浓度从10阿摩尔每升到600纳摩尔每升，荧光强度也相应增加。此外在d614g突变型rna浓度从1
×
10-17
摩尔每升到1
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10-9
摩尔每升范围内，荧光强度与d614g突变型rna浓度呈对数性相关，回归方程f＝254.07lg c+7088.64(r2＝0.9994),其中c表示d614g突变型rna浓度(摩尔每升)，f代表荧光强度(图3b、c)。在对照信号加上三倍标准偏差的基础上，计算检出限为9.33
×
10-18
摩尔每升，相当于5.62拷贝每微升或56.2拷贝。如图3d所示，当l452r突变型rna的浓度从10阿摩尔每升到600纳摩尔每升，荧光强度也相应增加。此外在l452r突变型rna浓度从1
×
10-17
摩尔每升到1
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10
–8摩尔每升范围内，荧光强度与l452r突变型rna浓度呈对数性相关，回归方程f＝1938.81lg c+41324.57(r2＝0.9982)，其中c表示l452r突变型rna浓度(摩尔每升)，f代表荧光强度。在对照信号加上三倍标准偏差的基础上，计算检出限为7.12
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10-18
摩尔每升，相当于4.29拷贝每微升或42.9拷贝(图3e、3f)。
76.对于d614g突变，与基于双合成错配crispr/cas12a方法(6
×
108拷贝)相比，该方法的灵敏度提高了7个数量级。与基于四引物扩增突变系统(arms)-pcr结合双色荧光横向流分析(lfa)法(33.53拷贝每微升)相比，该方法的灵敏度提高了1个数量级。对于l452r突变，与纸基比色分析法(400拷贝每微升)相比，该方法的灵敏度提高了1个数量级。与基于多重pcr质谱微测序技术(400拷贝)相比，该方法的灵敏度提高了3.32倍。灵敏度的提高可归因于(1)splintr连接酶的特异性连接，(2)消化过程大大降低了对照的非特异性扩增，(3)滚环转录具有高扩增效率，(4)背景信号低，信噪比高。
77.3、特异性检测
78.为了评估该方法的特异性，我们使用了一个碱基错配的rna(mis-1-d614g和mis-1-l452r)、两个碱基错配的rna(mis-2-d614g和mis-2-l452)、三个碱基错配的rna(mis-3-d614g和mis-3-l452r)、长链非编码rna肺腺癌转移相关转录物1(malat1)和hox转录反义rna(hotair)作为干扰物。如图4a所示，在d614g突变型rna单独存在下，产生显著的荧光信号(图4a,品红色柱)；而mis-1-d614g(图4a，青色柱)、mis-2-d614g(图4a，绿色柱)、mis-3-d614g(图4a，橙色柱)、malat1(图4a，蓝色柱)、hotair(图4a、紫色柱)和对照d614g野生型rna(图4a、灰色柱)产生的荧光信号极低。d614g突变型rna产生的荧光强度分别比mis-1-d614g(图4a，青色柱)、mis-2-d614g(图4a，绿色柱)、mis-3-d614g(图4a，橙色柱)、malat1(图4a，蓝色柱)和hotair(图4a、紫色柱)产生的荧光强度高68倍、413倍、449倍、492倍和436倍。类似地，如图4b所示，在l452r突变型rna存在时，荧光信号非常高(图4b,品红色柱)；而mis-1-l452r(图4b，青色柱)、mis-2-l452r(图4b，绿色柱)、mis-3-l452r(图4b，橙色柱)、malat1(图4b，蓝色柱)、hotair(图4b、紫色柱)和对照d614g野生型rna(图4b、灰色柱)产生的荧光信号极低。l452r突变型rna产生的荧光强度分别比mis-1-l452r(图4b，青色柱)、mis-2-l452r(图4b，绿色柱)、mis-3-l452r(图4b，橙色柱)、malat1(图4b，蓝色柱)和hotair(图4b、紫色柱)的荧光强度高7倍、16倍、17倍、9倍和9倍。如图4c所示，在d614g突变型rna和l452r突变型rna同时存在时，在507纳米和535纳米处均产生显著的荧光信号，信号值并未受到影响，说明该方法能够同时检测新冠d614g和l452r突变，在单核苷酸分辨率水平上具
有良好的特异性。
79.4、在混合样品中识别sars-cov-2基因突变
80.d614g和l452r突变是存在于德尔塔病毒中的两种关键突变，这些突变与传染性增加和逃避保护性免疫响应相关。尽管已经有大量核酸检测方法用于诊断sars-cov-2，但很少有工具能用于解决sars-cov-2基因突变。为了评估该方法用于鉴别d614g突变和l452r突变的能力，将d614g/l452r突变型rna和d614g/l452r野生型rna以不同的比例混合，测试各自产生的荧光强度(图5a、b)。横坐标表示实验加入的混合物中突变型病毒rna的比例，纵坐标表示实际测得的混合物中突变型病毒rna的比例。如图5a所示，对于d614g突变，实际测得比例的对数值与实验加入比例的对数值呈现良好的线性关系，线性方程为lg y＝1.06lg x+0.0935(r2＝0.9901)。如图5b所示，对于l452r突变，实际测得比例的对数值与实验加入比例的对数值呈现良好的线性关系，线性方程为lg y＝0.9587lg x-0.0602(r2＝0.9910)。这些结果表明，该方法即使在高浓度野生型病毒rna存在的情况下，也能够准确识别新冠d614g和l452r突变。
81.5、在人血清中检测d614g/l452突变
82.为了研究所提出的方法用于分析复杂生物基质中新冠突变体(d614g/l452r)的可行性，向含有不同浓度靶标的连接反应混合物中加入10％的人血清，随后的反应过程和荧光检测都遵循上述步骤。回收率(r1)根据公式(1)计算：
83.(1)r1(％)＝(cn/c0)
×
l00％
84.其中cn和c0分别表示存在和不存在10％人血清时d614g/l452r突变型rna的浓度，cn由图3b的拟合方程计算得到。
85.表1：10％人血清中d614g突变型rna的回收率实验
[0086][0087]
表2：10％人血清中l452r突变型rna的回收率实验
[0088][0089]
6、实际样品检测
[0090]
我们使用sars-cov-2假病毒评估了该方法对实际病毒中d614g突变和l452r突变的检测能力。将同时包含d614g突变和l452r突变的假病毒从0稀释至6.02
×
105拷贝每微升，测试该方法对rna病毒突变体的灵敏度。如图6a、b所示，对于d614g突变，当sars-cov-2假病毒的浓度从0拷贝每微升到6.02
×
105拷贝每微升，荧光强度与假病毒的浓度呈对数性线性相关，线性方程为f＝249.25lg n+2599.09(r2＝0.9987)，其中n表示假病毒的浓度(拷贝每微升)，f代表荧光强度。在对照信号加上三倍标准偏差的基础上，计算检出限为4.71拷
贝每微升。如图6c、d所示，对于l452r突变，当sars-cov-2假病毒的浓度从0拷贝每微升到6.02
×
105拷贝每微升，荧光强度与假病毒的浓度呈对数性线性相关，线性方程为f＝1945.35lg n+6794.66(r2＝
[0091]
0.9987)，其中n表示假病毒的浓度(拷贝每微升)，f代表荧光强度。在对照信号加上三倍标准偏差的基础上，计算检出限为4.51拷贝每微升。这一结果与上述合成序列测得的结果基本一致。基于rna适配体作为信号输出的滚环转录策略，不需要核酸探针的逆转录过程和化学标记。此外，滚环转录在等温条件下进行，进一步避免使用昂贵的pcr仪器。特别地，该方法能够检测到sars-cov-2的单核苷酸变异。上述这些特征使得该方法有望在资源有限的环境中诊断sars-cov-2突变体。
[0092]
7、检测咽拭子和食品包装中的sars-cov-2
[0093]
为了证明该方法对实际样品分析的能力，我们测量了咽拭子和食品包装上的sars-cov-2基因突变。将sars-cov-2假病毒掺入健康人的咽拭子样本或涂抹在食品包装表面模拟病毒污染。如图7a-d所示，对于咽拭子和食品包装样本，当存在6.02拷贝每微升的假病毒时就会产生能与对照区分开的荧光响应；且随着咽拭子和食品包装上的sars-cov-2假病毒加入量的增加，荧光信号也逐渐增强。结果表明，该方法在临床诊断中具有广阔的应用前景。
[0094]
上述实施例中，使用相关探针等核苷酸序列信息如下表3所示：
[0095]
表3：核苷酸序列
[0096]
[0097][0098]
综上，本发明技术方案具有如下有益效果：
[0099]
1、splintr连接酶对sars-cov-2病毒rna单核苷酸突变位置进行特异性识别和连接，保证了该方法良好的特异性，能够准确鉴定新冠病毒d614g或l452r的单核苷酸突变，可以在混合样品中检测到0.001％的突变型靶标。
[0100]
2、消化过程降低了对照未连接挂锁探针的非特异性扩增，大大降低了背景信号，显著提高了信噪比(358倍(d614g)；23倍(l452r))。
[0101]
3、rct是一种等温酶促反应，具有高扩增效率，本发明巧妙设计了两个线性环形dna模板，将一种“挂锁”工艺与rct相结合，其中靶标核酸直接用作连接模板，从而实现在单
核苷酸分辨率水平上对d614g和l452r突变的同时检测，显著提高了sars-cov-2临床诊断的准确性。
[0102]
4、本发明设计简单，仅设计了2个线性挂锁探针，无缺口构建的rct产物可以保持dna/rna结构的完整性，避免了设计大量的核酸探针，无需荧光分子标记，无需rna逆转录。此外，通过合理设计线性环形dna模板，在rct过程中生成功能区域，例如g-四链体、dna折纸、纳米花、纳米管等，本发明有可能拓展到检测其他sars-cov-2基因突变。
[0103]
5、本方法成功用于实际样品的分析，可以区分假病毒、咽拭子和食品包装上的sars-cov-2病毒单核苷酸突变。
[0104]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种同时检测两种新冠病毒突变体的双适配体传感器，其特征在于，所述双适配体传感器至少包括d614g线性挂锁探针以及l452r线性挂锁探针；其中，所述新冠病毒突变体为含有d614g和/或l452r的新冠病毒突变体；所述d614g线性挂锁探针包含t7启动子互补序列、d614g突变型rna和broccoli互补序列以及nb.bbvci切刻内切酶互补序列；所述l452r挂锁探针包含t7启动子互补序列、l452r突变型rna和mango iii互补序列以及nb.bbvci切刻内切酶互补序列。2.如权利要求1所述的双适配体传感器，其特征在于，所述双适配体传感器还包含t7启动子、splintr连接酶以及小分子染料。3.如权利要求2所述的双适配体传感器，其特征在于，所述小分子染料包括dfhbi-1t和to1-3peg-biotin。4.如权利要求1所述的双适配体传感器，其特征在于，所述d614g挂锁探针的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述l452r挂锁探针的核苷酸序列如seq id no.14所示。5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒至少含有权利要求1-4任一项所述双适配体传感器。6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有酶、酶抑制剂、缓冲液和反应试剂。7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有atp、ntps、核糖核酸酶抑制剂、t4 rna连接酶反应缓冲液、核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶h、rnase h缓冲液和tbe缓冲液中的一种或多种。8.权利要求1-4任一项所述双适配体传感器和/或权利要求6-7任一项所述检测试剂盒在同时检测两种新冠病毒突变体和/或制备同时检测两种新冠病毒突变体的产品中的应用；进一步的，所述两种新冠病毒突变体具体为含有d614g的新冠病毒突变体和含有l452r的新冠病毒突变体。9.一种同时检测两种新冠病毒突变体的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-4任一项所述双适配体传感器和/或权利要求6-7任一项所述检测试剂盒对待测样品进行检测；进一步的，所述待测样品包括离体生物样品以及环境样品；所述两种新冠病毒突变体具体为含有d614g的新冠病毒突变体和含有l452r的新冠病毒突变体。10.权利要求9所述检测方法在如下任意一种或多种中的应用：(a)新冠病毒以及由新冠病毒引发的相关疾病的基础研究；(b)新冠病毒检测以及由新冠病毒引发的相关疾病的诊断；(c)新冠病毒相关药物的制备和/或筛选。

技术总结
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测两种新冠病毒突变体的双适配体传感器及其应用。具体的，本发明将两种新冠病毒突变型RNA：D614G和L452R作为目标物，利用激活的西兰花(Broccoli)和芒果(Mango III(A10U))适配体作为信号输出，结合T7RNA聚合酶辅助的滚环转录信号扩增，开发了一种基于“挂锁工艺”进行特异性识别的双适配体传感器，对新冠假病毒及血清样本、咽拭子和食品包装中的D614G和L452R点突变进行均相、无标记、超灵敏检测，从而表明该双适配体传感器以及检测方法在分子生物学和精确诊断中具有极佳的应用潜力。生物学和精确诊断中具有极佳的应用潜力。生物学和精确诊断中具有极佳的应用潜力。


技术研发人员：李琛琛 吕福慧 邢天蕴 张正昆 罗细亮
受保护的技术使用者：青岛科技大学
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/24