一种保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品及其制备方法与应用

1.本发明涉及一种保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.大量饮酒造成酒精性肝病是一个全球性问题，是全球肝脏相关死亡的最常见原因，占全球死亡总数的5.9％。当饮酒后，肝代谢酶系统将乙醇转化为乙醛，乙醛又被脱氢酶氧化生成乙酸，最后代谢为二氧化碳和水排至体外。大量饮酒的主要机制是酒精的大量摄入会使机体产生大量的活性氧自由基，导致机体内氧化水平升高，抗氧化水平降低，从而对肝脏造成损伤。
3.口服保健饮品是天然、安全、有效的干预疾病手段。乳酸菌发酵枸杞原浆具有比原浆更高的抗氧化功能，能够平衡大量酒精摄入导致的氧化应激，提高机体抗氧化水平。因此，利用乳酸菌发酵枸杞饮品保护酒精性肝损伤具有广阔的前景，该饮品兼具了保健和美味双重优势。
4.目前，轻中度酒精性肝损伤依旧采取药物治疗，药物治疗对人体的副作用大，而且长期的服药会给肝，肾器官增加一定的负担。因此，急需开发更多的能够预防和治疗酒精性肝损伤的益生菌产品。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供一种含有副干酪乳杆菌e10的发酵枸杞饮品，本发明了具有良好抗氧化能力的副干酪乳杆菌e10发酵的枸杞原浆，制备得到一种可以保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品。
6.本发明的第一个目的是提供一种保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品的制备方法，包括如下步骤：
7.s1、将枸杞原浆调节ph至6.5～7.5；
8.s2、将副干酪乳杆菌e10种子液以1～4％接种量接种至枸杞原浆中，35～38℃厌氧培养15～25h，得到第一发酵液；
9.s3、将副干酪乳杆菌e10种子液以0.5～2％接种量接种至第一发酵液中，35～38℃厌氧培养20～30h，得到枸杞原浆发酵液；
10.s4、将s3中得到的枸杞原浆发酵液于0～10℃放置15～25h，巴氏灭菌后得到乳酸菌发酵枸杞饮品；
11.其中，所述的副干酪乳杆菌e10于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.22744。
12.进一步地，所述副干酪乳杆菌e10种子液通过如下方法制备：
13.s01、将副干酪乳杆菌e10的冻存液进行活化；
14.s02、挑取活化的副干酪乳杆菌e10菌种于mrs固体培养基上划线，35～38℃培养40～50h获得副干酪乳杆菌e10单菌落；
15.s03、挑取副干酪乳杆菌e10单菌落，接种于mrs液体培养基中，35～38℃厌氧培养20～30h，得到初级种子液；
16.s04、将初级种子液以1～3％的接种量接种于液体mrs培养基中，35～38℃厌氧培养20～30h，得到种子液。
17.进一步地，所述枸杞原浆通过如下方法制备：取枸杞鲜果，除杂清洗干净，进行打浆和破碎，过滤枸杞籽及枸杞皮渣得到枸杞原浆。
18.进一步地，所述枸杞鲜果为宁夏枸杞。
19.进一步地，s3步骤得到的枸杞原浆发酵液中活菌数不低于1
×
108cfu/g。
20.进一步地，mrs固体培养基：胰蛋白胨8～12g/l；酵母粉4～6g/l；牛肉膏8～12g/l；葡萄糖15～25g/l；柠檬酸氢二胺1～3g/l；乙酸钠4～6g/l；k2hpo4·
3h2o 2.5～2.7g/l；mgso4·
7h2o 0.1～0.3g/l；mnso4·
4h2o 0.04～0.06g/l；吐温80 0.8～1.2ml/l；1.5～2％的琼脂粉。
21.进一步地，mrs液体培养基：胰蛋白胨8～12g/l；酵母粉4～6g/l；牛肉膏8～12g/l；葡萄糖15～25g/l；柠檬酸氢二胺1～3g/l；乙酸钠4～6g/l；k2hpo4·
3h2o 2.5～2.7g/l；mgso4·
7h2o 0.1～0.3g/l；mnso4·
4h2o 0.04～0.06g/l；吐温80 0.8～1.2ml/l。
22.本发明的第二个目的是提供所述制备方法制备得到的乳酸菌发酵枸杞饮品。
23.本发明的第三个目的是提供一种所述的乳酸菌发酵枸杞饮品在制备保护酒精性肝损伤的产品中的应用。
24.进一步地，所述的产品为药品。
25.本发明的有益效果是：
26.本发明采用副干酪乳杆菌e10发酵宁夏枸杞原浆得到发酵枸杞饮品。本发明的副干酪乳杆菌e10发酵的枸杞饮品能够显著降低血清中alt和ast的水平，降低肝脏中gst的水平，减轻肝脏的损伤。此外，增加肝脏中gsh及gsh-px的水平，提高了肝脏的抗氧化能力，恢复机体氧化与抗氧化的平衡，缓解酒精摄入造成的肝脏损伤，可以作为一种具有良好预防或治疗酒精性肝损伤的药品。
27.生物材料保藏：
28.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)e10，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.22744。
附图说明：
29.图1为小鼠血清中ast和alt的水平。###与正常组比较p＜0.001；***与模型组相比较，p＜0.001；**与模型组相比较，p＜0.01；*与模型组比较，p＜0.05；
30.图2为各组小鼠肝脏中gsh，gsh-px和gst水平的统计结果。###与正常组比较p＜0.001；***与模型组相比较，p＜0.001；**与模型组相比较，p＜0.01；*与模型组比较，p＜0.05；
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
32.宁夏枸杞原浆制备：取宁夏枸杞鲜果，除杂清洗干净，进行打浆和破碎，过滤枸杞籽及枸杞皮渣得到枸杞原浆。
33.mrs固体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；k2hpo4·
3h2o 2.6g；mgso4·
7h2o 0.2g；mnso4·
4h2o 0.05g；吐温80 1ml；1.5～2％的琼脂粉。ph调节6.8
±
0.2；定容至1l。
34.mrs液体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；k2hpo4·
3h2o 2.6g；mgso4·
7h2o 0.2g；mnso4·
4h2o 0.05g；吐温80 1ml。ph调节6.8
±
0.2；定容至1l。
35.实施例1：
36.一种保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌e10发酵枸杞饮品的制备方法如下：
37.(1)菌种的活化：将所述的副干酪乳杆菌e10取100μl冻存液涂布于mrs固体培养基中，37℃培养48h，活化菌种；
38.(2)单菌落的获取：挑取适量菌种于mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，获得菌株单菌落；
39.(3)种子液的制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌e10单菌落，接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到种子液；
40.(4)将种子液以2％的接种量接种于宁夏枸杞原浆中，37℃厌氧培养20h，得到发酵液；
41.(5)将(4)中得到的枸杞原浆发酵液于4℃放置12小时；
42.(6)制得的副干酪乳杆菌e10发酵的宁夏枸杞原浆巴氏灭菌后得到所述的保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品。
43.实施例2：
44.一种保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌e10发酵枸杞饮品的制备方法如下：
45.(1)菌种的活化：将所述的副干酪乳杆菌e10取100μl冻存液涂布于mrs固体培养基中，37℃培养48h，活化菌种；
46.(2)单菌落的获取：挑取适量菌种于mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，获得菌株单菌落；
47.(3)初级种子液的制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌e10单菌落，接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
48.(4)种子液的制备：将初级种子液以2％的接种量接种于液体mrs培养基中，37℃厌氧培养24h，得到种子液；
49.(5)将种子液以2％的接种量接种于宁夏枸杞原浆中，37℃厌氧培养20h，得到枸杞原浆发酵液；
50.(6)将(5)中得到的枸杞原浆发酵液于4℃放置12小时；
51.(7)制得的副干酪乳杆菌e10发酵的宁夏枸杞原浆巴氏灭菌后得到所述的保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品。
52.实施例3：
53.一种保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌e10发酵枸杞饮品的制备方法如下：
54.(1)菌种的活化：将所述的副干酪乳杆菌e10取100μl冻存液涂布于mrs固体培养基中，37℃培养48h，活化菌种；
55.(2)单菌落的获取：挑取适量菌种于mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，获得菌株单菌落；
56.(3)初级种子液的制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌e10单菌落，接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
57.(4)种子液的制备：将初级种子液以2％的接种量接种于液体mrs培养基中，37℃厌氧培养24h，得到种子液；
58.(5)将枸杞原浆用碳酸氢钠调节ph至7；
59.(6)将种子液以2％的接种量接种于宁夏枸杞原浆中，37℃厌氧培养20h，得到发酵液；
60.(7)将种子液以1％的接种量接种于(6)中得到的枸杞原浆发酵液中，37℃厌氧培养22h，得到枸杞原浆发酵液；
61.(8)将(7)中得到的枸杞原浆发酵液于4℃放置20小时；
62.(9)制得的副干酪乳杆菌e10发酵的宁夏枸杞原浆巴氏灭菌后得到所述的保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品。
63.对比例1：
64.一种副干酪乳杆菌cicc 20262发酵枸杞饮品的制备方法如下：
65.(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌cicc 20262取100μl冻存液涂布于mrs固体培养基中，37℃培养48h，活化菌种；
66.(2)单菌落的获取：挑取适量菌种于mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，获得菌株单菌落；
67.(3)种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌cicc 20262单菌落，接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
68.(4)种子液的制备：将初级种子液以2％的接种量接种于液体mrs培养基中，37℃厌氧培养24h，得到种子液；
69.(5)将枸杞原浆用碳酸氢钠调节ph至7；
70.(6)将种子液以2％的接种量接种于宁夏枸杞原浆中，37℃厌氧培养20h，得到发酵液；
71.(7)将种子液以1％的接种量接种于(6)中得到的枸杞原浆发酵液中，37℃厌氧培养22h，得到枸杞原浆发酵液；
72.(8)将(7)中得到的枸杞原浆发酵液于4℃放置12小时；
73.(9)制得的副干酪乳杆菌cicc 20262发酵的宁夏枸杞原浆巴氏灭菌后得到所述的保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品。
74.试验例：
75.保护酒精性肝损伤的应用性能
76.1实验方案
77.c57bl/6小鼠，5～6周雄性，60只。实施例1、实施例2、实施例3、对比例1的制得发酵枸杞饮品(由本单位生产)、无水乙醇。将小鼠随机分成6组，每组10只，分为正常组、模型组、给药组1、给药组2、给药组3、给药组4分别对应着，如表1所示。
78.表1分组及给药情况
[0079][0080]
小鼠在环境中适应7天。第1-7天正常饮食，正常组与模型组每天灌胃1g/ml生理盐水。给药组每天灌胃1g/ml本发明产品。再第7天模型组和给药组单次灌胃5g/kg b.w.的无水乙醇，禁食12后，进行麻醉后将小鼠脱颈处死，收集小鼠肝脏，血清，检测小鼠血清中的ast、alt及肝脏中的gsh，gsh-px及gst的水平。
[0081]
2、实验结果
[0082]
本实验测定了小鼠血清中肝功酶水平(alt、ast)。由图1可知，与正常组想比，模型组小鼠血清中的ast和alt的水平显著升高(p《0.001)。与模型组相比，实施例1，2产品处理组小鼠血清中alt的水显著降低(p《0.01)。实施例1，2产品处理组小鼠血清中ast的水显著降低(p《0.05；p《0.01)。发明实施例3产品处理组小鼠血清中ast和alt的水极显著降低(p《0.001)，表明实施例3产品比实施例1，2产品具有更加明显的保护酒精性肝损伤的作用。然而经过本发明对比例1产品处理组与模型组相比不具有显著性。
[0083]
进一步地，本实验检测了肝脏损伤指标gst及肝脏抗氧化指标gsh-px及gsh的水平。结果如图2所示，与正常组相比，模型组中gst水平显著升高(p《0.001)，表明肝脏出现明显的损伤。经过本发明实施例1，2，3产品处理，gst水平较模型组相比都有所升高，其中本发明实施例1，2产品处理，gst水平较模型组相比显著升高(p《0.01；p《0.05)，本发明实施例3产品处理较模型组相比极显著升高(p《0.001)效果最佳。与正常组相比，抗氧化指标gsh及gsh-px的水平在模型组中的水平显著降低(p《0.001)。与模型组相比，经过本发明实施例1，2产品处理，gsh及gsh-px的水平显著升高(p《0.01；p《0.05)。本发明实施例3产品处理后，gsh及gsh-px的水平极显著的升高(p《0.001)，表明保护酒精性肝损伤的效果最佳。本发明对比例1产品处理组小鼠肝脏中各指标水平与模型组相比不具有显著性。
[0084]
综上可知，本发明产品能够显著缓解酒精摄入造成的肝脏损伤，测定了血清中相关指标的水平，发现本发明产品显著降低酒精性肝损伤小鼠血清中ast、alt的含量，降低酒精性肝损伤小鼠肝脏中gst的水平，减轻肝细胞损伤。进一步，肝脏中抗氧化指标的结果中也可以看出本发明产品可显著增加gsh及gsh-px的水平，说明本发明产品可以显著提高肝脏内抗氧化水平，恢复机体氧化与抗氧化间的平衡，保护酒精性肝损伤。以上结果说明副干酪乳杆菌e10发酵枸杞饮品具有显著保护酒精性肝损伤的效果，可以作为一种具有良好保
护酒精性肝损伤效果的食品或药物。
[0085]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.一种保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、将枸杞原浆调节ph至6.5～7.5；s2、将副干酪乳杆菌e10种子液以1～4％接种量接种至枸杞原浆中，35～38℃厌氧培养15～25h，得到第一发酵液；s3、将副干酪乳杆菌e10种子液以0.5～2％接种量接种至第一发酵液中，35～38℃厌氧培养20～30h，得到枸杞原浆发酵液；s4、将s3中得到的枸杞原浆发酵液于0～10℃放置15～25h，巴氏灭菌后得到乳酸菌发酵枸杞饮品；其中，所述的副干酪乳杆菌e10于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.22744。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述副干酪乳杆菌e10种子液通过如下方法制备：s01、将副干酪乳杆菌e10的冻存液进行活化；s02、挑取活化的副干酪乳杆菌e10菌种于mrs固体培养基上划线，35～38℃培养40～50h获得副干酪乳杆菌e10单菌落；s03、挑取副干酪乳杆菌e10单菌落，接种于mrs液体培养基中，35～38℃厌氧培养20～30h，得到初级种子液；s04、将初级种子液以1～3％的接种量接种于液体mrs培养基中，35～38℃厌氧培养20～30h，得到种子液。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述枸杞原浆通过如下方法制备：取枸杞鲜果，除杂清洗干净，进行打浆和破碎，过滤枸杞籽及枸杞皮渣得到枸杞原浆。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述枸杞鲜果为宁夏枸杞。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s3步骤得到的枸杞原浆发酵液中活菌数不低于1
×
108cfu/g。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，mrs固体培养基：胰蛋白胨8～12g/l；酵母粉4～6g/l；牛肉膏8～12g/l；葡萄糖15～25g/l；柠檬酸氢二胺1～3g/l；乙酸钠4～6g/l；k2hpo4·
3h2o 2.5～2.7g/l；mgso4·
7h2o 0.1～0.3g/l；mnso4·
4h2o 0.04～0.06g/l；吐温80 0.8～1.2ml/l；1.5～2％的琼脂粉。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，mrs液体培养基：胰蛋白胨8～12g/l；酵母粉4～6g/l；牛肉膏8～12g/l；葡萄糖15～25g/l；柠檬酸氢二胺1～3g/l；乙酸钠4～6g/l；k2hpo4·
3h2o 2.5～2.7g/l；mgso4·
7h2o 0.1～0.3g/l；mnso4·
4h2o 0.04～0.06g/l；吐温80 0.8～1.2ml/l。8.一种权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的乳酸菌发酵枸杞饮品。9.一种权利要求8所述的乳酸菌发酵枸杞饮品在制备保护酒精性肝损伤的产品中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的产品为药品。

技术总结
本发明公开了一种保护酒精性肝损伤的乳酸菌发酵枸杞饮品及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。本发明采用副干酪乳杆菌E10发酵宁夏枸杞原浆得到发酵枸杞饮品。本发明的副干酪乳杆菌E10发酵的枸杞饮品能够显著降低血清中ALT和AST的水平，降低肝脏中GST的水平，减轻肝脏的损伤。此外，增加肝脏中GSH及GSH-Px的水平，提高了肝脏的抗氧化能力，恢复机体氧化与抗氧化的平衡，缓解酒精摄入造成的肝脏损伤，可以作为一种具有良好预防或治疗酒精性肝损伤的药品。损伤的药品。损伤的药品。


技术研发人员：耿燕 许正宏 王方舟 陆冉 段文慧 史劲松 张晓娟 丁玘颖
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/24