miR-222-3p在调节獭兔被毛黑色素沉积中的应用

mir-222-3p在调节獭兔被毛黑色素沉积中的应用
技术领域
1.本发明涉及mir-222-3p在调节獭兔被毛黑色素沉积中的应用，属于动物科学领域。


背景技术：

2.黑色素细胞色素沉积对于獭兔毛色的形成具有至关重要的作用。黑色素细胞由胚胎时期的神经嵴干细胞分化而来，在成熟黑色素细胞内通过一系列复杂的酶催化反应最终生成黑色素，从而决定动物的毛色和肤色。黑色素的生成过程复杂，受到一些转录因子、激素、信号通路分子协同调控。
3.microrna(mirna)在真核细胞中普遍存在，是一类长约19-25nt的内源性非编码rna。它主要通过抑制转录后的翻译过程来调控基因表达，最终影响动物机体的一系列生化活动，具有高度序列保守性、表达时序性和组织特异性。研究表明，mirna在黑色素的形成过程中作为一种调控因子发挥着重要作用。目前，关于microrna在黑色素沉积中的应用机制尚不完全清楚，因此本发明对mirna在黑色素形成过程中的应用进行研究。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p。
5.本发明还要解决的技术问题是提供一种mir-222-3p的模拟物和抑制物及其应用。
6.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p，所述mir-222-3p的序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p或其模拟物或抑制物在制备抑制或促进獭兔黑色素细胞增殖或凋亡的生物制剂中的应用。
8.本发明还提供了与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p或其模拟物或抑制物在制备促进或抑制獭兔黑色素生成的生物制剂中的应用。
9.本发明还提供了一种抑制所述的mir-222-3p表达的mir-222-3p-inhibitor，所述mir-222-3p-inhibitor的序列如seq id no.2所示。
10.本发明还提供了所述的mir-222-3p-inhibitor在制备促进獭兔黑色素细胞增殖的生物制剂中的应用。
11.本发明还提供了所述的mir-222-3p-inhibitor在制备抑制獭兔黑色素细胞凋亡的生物制剂中的应用。
12.本发明还提供了所述的mir-222-3p-inhibitor在制备促进獭兔黑色素生成的生物制剂中的应用。
13.本发明还提供了一种过表达所述的mir-222-3p的mir-222-3p-mimics，所述mir-222-3p-mimics的正义链序列如seq id no.3所示，反义链序列如seq id no.4所示。
14.本发明还提供了所述的mir-222-3p-mimics在制备抑制獭兔黑色素细胞增殖的生
物制剂中的应用。
15.本发明还提供了所述的mir-222-3p-mimics在制备促进獭兔黑色素细胞凋亡的生物制剂中的应用。
16.本发明还提供了所述的mir-222-3p-mimics在制备抑制獭兔黑色素生成的生物制剂中的应用。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、本发明首次发现了与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p；2、首次发现了过表达mir-222-3p能够有效抑制獭兔黑色素细胞的增殖，诱导其凋亡，降低黑色素细胞中的黑色素沉积；3、首次发现了抑制mir-222-3p的表达能有效促进獭兔黑色素细胞的增殖，降低其凋亡，增加黑色素细胞中的黑色素沉积。
附图说明
18.图1a为转染mir-222-3p-inhibitor后，mir-222-3p在獭兔黑色素细胞中的表达量；图1b为转染mir-222-3p-mimics后，mir-222-3p在獭兔黑色素细胞中的表达量；其中，**表示差异极显著(p《0.01)；
19.图2a为转染mir-222-3p-inhibitor后，獭兔黑色素细胞的增殖情况；图2b为转染mir-222-3p-mimics后，獭兔黑色素细胞的增殖情况；其中，*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)；
20.图3a为转染mir-222-3p-inhibitor后，獭兔黑色素细胞凋亡情况(mir-222-3p-inhibitor nc为阴性对照)；图3b为转染mir-222-3p-inhibitor后，獭兔黑色素细胞凋亡率；图3c为转染mir-222-3p-mimics后，獭兔黑色素细胞凋亡情况(mir-222-3p-mimics nc为阴性对照)；图3d为转染mir-222-3p-mimics后，獭兔黑色素细胞凋亡率；其中，*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)；
21.图4a为转染mir-222-3p-inhibitor后，獭兔黑色素细胞中的黑色素含量；图4b为转染mir-222-3p-mimics后，獭兔黑色素细胞中的黑色素含量；其中，**表示差异极显著(p《0.01)。
具体实施方式
22.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
23.实施例1设计mir-222-3p模拟物和抑制物并验证
24.1、獭兔原代黑色素细胞的分离培养
25.(1)本实验选用2月龄左右的黑色獭兔(由山东种兔繁育基地提供)，采用两步酶解法从獭兔背部皮肤组织(约1.5
×
1.5cm2)中分离獭兔原代黑色素细胞；
26.(2)使用眼科剪去除毛发和皮下脂肪组织，置于0.25％的dispase ii酶消化液(sigma公司)中，4℃消化16h；
27.(3)使用精细镊分离表皮和真皮层，得到的表皮组织使用0.25％胰酶(serana公司)在37℃，5％co2培养箱中消化8min；
28.(4)消化后的细胞在含有10％ fbs(gibco公司)的m254专用培养基(gibco公司)中培养，每2d更换一次培养基，观察细胞的生长状况。当细胞生长汇合度达90％时，用
1ml0.25％胰酶消化并收集獭兔黑色素细胞；
29.(5)将獭兔黑色素细胞在含1％hmgs(gibco公司)的m254完全培养基中按1：2的比例进行传代，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
30.2、设计mir-222-3p模拟物和抑制物并验证
31.(1)mir-222-3p的序列如下：
32.sense：agcuacaucuggcuacugggucuc，seq id no.1；
33.mir-222-3p-inhibitor的序列如下：
34.sense：gagacccaguagccagauguagcu，seq id no.2；
35.mir-222-3p-mimics的序列如下：
36.sense：agcuacaucuggcuacugggucuc，seq id no.3；
37.antisense：gagacccaguagccagauguagcu，seq id no.4；
38.mir-222-3p-mimicsnc的序列如下：
39.sense：uuuguacuacacaaaaguacug，seq id no.5；
40.antisense：caguacuuuuguguaguacaaa，seq id no.6；
41.mir-222-3p-inhibitornc的序列如下：
42.sense：caguacuuuuguguguaguacaa，seq id no.7；
43.以上序列均由广州锐博生物技术有限公司合成。
44.(2)将上述培养后的獭兔黑色素细胞(5
×
105个)接种于6孔培养板中，待獭兔黑色素细胞生长汇合度达70％后，分别将mir-222-3p-mimics、mir-222-3p-inhibitor、mir-222-3p-mimicsnc和mir-222-3p-inhibitornc转染至獭兔黑色素细胞内，具体转染步骤参照lipofectamine 2000说明书(invitrogen公司)，待转染完成后收集细胞进行后续实验；
45.(3)使用mircutemirnalsolation kit(北京天根生化科技有限公司)提取总rna，具体步骤参照说明书；
46.(4)使用mircute plus mirnacdna第一链合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司)合成对应的cdna，具体步骤参照说明书；
47.(5)使用mircute plus mirnaqpcr kit(北京天根生化科技有限公司)进行mirna的qrt-pcr检测，具体步骤参照说明书；
48.引物序列如下：
49.mir-222-3p
50.f：agctacatctggctactgggtctc，seq id no.8；
51.u6
52.f：caaggatgacacgcaaattcg，seq id no.9；
53.反应条件为：95℃15min；94℃20s，60℃34s，进行45个循环；
54.(6)最后，使用2-δδct
法计算相对表达量，实验得到的结果如图1所示。
55.从图1中可以看出，与阴性对照组相比，转染mir-222-3p-inhibitor后，mir-222-3p在獭兔黑色素细胞中的相对表达量极显著降低(p《0.01)；而转染mir-222-3p-mimics后，mir-222-3p在獭兔黑色素细胞中相对表达量极显著升高(p《0.01)。结果表明，转染mir-222-3p-mimics后有效的促进了mir-222-3p在獭兔黑色素细胞中的表达量，转染mir-222-3p-inhibitor后有效的抑制了mir-222-3p在獭兔黑色素细胞中的表达量。
56.实施例2过表达和抑制后mir-222-3p对獭兔黑色素细胞的增殖的影响
57.(1)使用1ml 0.25％胰酶(serana公司)分别对转染mir-222-3p-mimics、mir-222-3p-inhibitor和阴性对照(mir-222-3p-mimics nc和mir-222-3p-inhibitor nc)后的獭兔黑色素细胞进行消化并收集；
58.(2)按照100μl/孔均匀接种至96孔板中进行培养，每组设置4个时间点，分别为0h、24h、48h和72h；
59.(3)分别在培养0h、24h、48h和72h后每孔加入10μlcck-8溶液(beyotime公司)，放回37℃，5％ co2培养箱中继续培养2h；
60.(4)然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，以od值代表獭兔黑色素细胞的相对增殖水平，绘制细胞增殖曲线，实验得到的结果如图2所示。
61.从图2中可以看出，与阴性对照组相比，mir-222-3p-mimics组在48h和72h时，od值显著降低，即獭兔黑色素细胞增殖水平均显著降低(p《0.01)。然而，mir-222-3p-inhibitor组在24h、48h和72h时，od值显著升高，即獭兔黑色素细胞增殖水平均显著升高(p《0.01)。结果表明，过表达mir-222-3p能够有效的抑制獭兔黑色素细胞的增殖，而抑制mir-222-3p能够有效促进獭兔黑色素细胞的增殖。
62.实施例3过表达和抑制后mir-222-3p对獭兔黑色素细胞的凋亡的影响
63.(1)使用annexinv-fitc/pi apoptosis detection kit(vazyme公司)进行细胞凋亡检测；
64.(2)待mir-222-3p-mimics、mir-222-3p-inhibitor、mir-222-3p-mimic nc和mir-222-3p-inhibitor nc在獭兔黑色素细胞中转染完成后，使用1ml 0.25％胰酶消化并收集细胞；
65.(3)4℃，300g离心5min，并弃去上清液，使用pbs(biosharp公司)轻轻清洗两次后，根据说明书，加入100μl1
×
bindingbuffer轻轻吹打混匀使细胞重悬；
66.(4)加入5μlannexinv-fitc和5μlpi染色液，轻轻吹打混匀，室温避光孵育10min；再加入400μl1
×
bindingbuffer，轻轻吹打混匀；使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验结果如图3所示。
67.从图3可以看出，与阴性对照组相比，mir-222-3p-mimics组的獭兔黑色素细胞凋亡率显著升高(p《0.05)。而mir-222-3p-inhibitor组的獭兔黑色素细胞凋亡率显著降低于nc组(p《0.01)。结果表明，过表达mir-222-3p能够有效的促进獭兔黑色素细胞的凋亡，而抑制mir-222-3p的表达能够有效抑制獭兔黑色素细胞的凋亡。
68.实施例4过表达和抑制后mir-222-3p对獭兔黑色素生成的影响
69.(1)将獭兔黑色素细胞(5
×
105个)接种于6孔培养板中，待獭兔黑色素细胞生长融合度达70％后，进行细胞转染，具体转染步骤参照lipofectamine 2000说明书(invitrogen公司)；
70.(2)待转染完成后，使用pbs(biosharp公司)轻轻吹洗三次，使用1ml 0.25％胰酶消化并收集细胞；4℃，1000rmp离心10min，弃去上清液；
71.(3)在细胞团块中加入1ml naoh溶液(1mol/l)，充分混匀后，80℃水浴1h。酶标仪475nm处测定其吸光值。记录并分析实验数据，实验所得结果如图4所示。
72.从图4中可以看出，与阴性对照组相比，转染mir-222-3p-mimics后獭兔黑色素细
胞中的黑色素含量极显著降低(p《0.01)，转染mir-222-3p-inhibitor后獭兔黑色素含量极显著增加(p《0.01)。结果表明，过表达mir-222-3p能够有效的抑制獭兔黑色素生成，而抑制mir-222-3p能够有效的促进獭兔黑色素生成。

技术特征：
1.一种与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p，其特征在于，所述mir-222-3p的序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述的与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p或其模拟物或抑制物在制备抑制或促进獭兔黑色素细胞增殖或凋亡的生物制剂中的应用。3.权利要求1所述的与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的mir-222-3p或其模拟物或抑制物在制备促进或抑制獭兔黑色素生成的生物制剂中的应用。4.一种抑制权利要求1所述的mir-222-3p表达的mir-222-3p-inhibitor，其特征在于，所述mir-222-3p-inhibitor的序列如seq id no.2所示。5.权利要求4所述的mir-222-3p-inhibitor在制备促进獭兔黑色素细胞增殖或抑制獭兔黑色素细胞凋亡的生物制剂中的应用。6.权利要求4所述的mir-222-3p-inhibitor在制备促进獭兔黑色素生成的生物制剂中的应用。7.一种过表达权利要求1所述的mir-222-3p的mir-222-3p-mimics，其特征在于，所述mir-222-3p-mimics的正义链序列如seq id no.3所示，反义链序列如seq id no.4所示。8.权利要求7所述的mir-222-3p-mimics在制备抑制獭兔黑色素细胞增殖的生物制剂中的应用。9.权利要求7所述的mir-222-3p-mimics在制备促进獭兔黑色素细胞凋亡的生物制剂中的应用。10.权利要求7所述的mir-222-3p-mimics在制备抑制獭兔黑色素生成的生物制剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的miR-222-3p，所述miR-222-3p的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了与獭兔黑色素细胞色素沉积相关的miR-222-3p或其模拟物或抑制物在制备促进或抑制獭兔黑色素细胞增殖或凋亡的生物制剂中的应用。本发明首次公开了抑制miR-222-3p的表达能有效促进獭兔黑色素细胞的增殖，降低其凋亡，增加黑色素细胞中的黑色素沉积；首次公开了过表达miR-222-3p能够有效抑制獭兔黑色素细胞的增殖，诱导其凋亡，降低黑色素细胞中的黑色素沉积。降低黑色素细胞中的黑色素沉积。


技术研发人员：陈阳 薛瑜 卢婷婷 戴莹莹 赵博昊 吴信生
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/24