一种包含黄芩的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种包含黄芩的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用。


背景技术：

2.中药多为植物的干燥药用部分，由于复杂自然环境、社会状况以及我国历史上科技发展不平衡等多种原因，造成中药材在应用方面的复杂性。同一名称的中药材可能来自不同基原的植物，同一基原的中药材由于产地、采收季节和生长年限不同而存在差异，这就必然影响以其为原料生产制剂的化学组成，此外，制剂在生产过程中各工艺环节的稳定性等多种因素对制剂的化学组成也具有重要影响。
3.中药特征图谱是指供试品经适当处理后，采用一定的分析手段和仪器检测得到，能够标识其中各组分群体特征的共有峰图谱，是一种综合、可量化的鉴别手段，能够较全面的反应中药所含化学成分的种类与数量，其整体性与模糊性正好符合中药指控的要求，能较好的反映中药的质量和中医用药所体现的整体疗效，具有科学性和全面性。
4.目前，尚未见文献报道对包含黄芩的中药复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。
5.鉴于上述原因，建立准确有效且能整体表征中药复方内在质量的监控手段尤为重要，故对本技术的包含黄芩的中药复方的特征图谱进行研究，以方便更加客观的从整体上评价该中药复方的内在质量。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供一种包含黄芩的中药复方成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映上述中药复方中的化学成分，且各色谱峰分离较好，峰型好，重复性较好，基线平稳，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量，从而对其质量能够进行有效地监控，提高包含黄芩的中药复方的质量从而保证疗效。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种包含黄芩的中药复方的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
9.取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方包括黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草，该对照品包括栀子苷、橙皮苷和黄芩苷；
10.该检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；
流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm；
11.根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
12.进一步地，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草。
13.进一步地，该对照品进一步包括桑皮苷a。
14.进一步地，该中药复方供试品溶液的制备方法包括：在该中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过超声提取后，放冷，定容，摇匀，过滤得到该中药复方供试品溶液。
15.进一步地，该中药复方溶液通过以下方法获得：称取适量的该中药复方，置于适当体积的容量瓶中，以及添加适量的体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液。
16.进一步地，该中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取10～60分钟，例如约20分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤。
17.进一步地，该中药复方的取样量为6～14g，例如约10g。
18.进一步地，该超声提取的功率为约500w，频率为约40khz。
19.进一步地，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的栀子苷、橙皮苷和黄芩苷；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成每1ml含每个对照品20～800μg的该对照品溶液。
20.进一步地，每1ml的该对照品溶液包括栀子苷250μg、橙皮苷30～50μg、黄芩苷400～600μg。
21.进一步地，每1ml的该对照品溶液进一步包括桑皮苷a 40μg。
22.进一步地，该流速为0.8～1.2ml/min，该柱温为30～40℃，该检测波长为240～280nm。
23.进一步地，该对照品中栀子苷检测波长为240nm。
24.进一步地，该对照品中橙皮苷检测波长为280nm。
25.进一步地，该对照品中黄芩苷检测波长为280nm。
26.进一步地，该对照品对应的色谱峰的峰纯度的纯度角度大于纯度阈值。
27.进一步地，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于10000。
28.进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
29.进一步地，该色谱柱为hss t3色谱柱、atlantis
tm t3色谱柱或c
18
色谱柱。
30.进一步地，该色谱柱为hss t3色谱柱。
31.进一步地，该流动相a为乙腈。
32.进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
33.进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢
钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
34.进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液。
35.进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或冰乙酸水溶液。
36.进一步地，该酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液。
37.进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
38.进一步地，该缓冲盐水溶液的ph值不大于7.0。
39.进一步地，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为7％～19％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、0.5％～5％、0.5％～5％。
40.进一步地，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为约11.81％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约2.11％、约2.36％。
41.进一步地，该黄芩为去朽心的黄芩。进一步地，该桔梗为去芦的桔梗。进一步地，该茯苓为去皮的茯苓。进一步地，该橘红为去白的橘红。进一步地，该贝母为去心的浙贝母。进一步地，该天门冬为去心的天门冬。进一步地，该苦杏仁为去皮尖的苦杏仁。进一步地，该苦杏仁为燀苦杏仁。进一步地，该麦冬为去心的麦冬。进一步地，该中药复方进一步包括生姜和大枣。进一步地，该中药复方中生姜的重量占比为2％～6％，例如约4.22％。进一步地，该中药复方中大枣的重量占比为8％～18％，例如约12.65％。
42.进一步地，该对照品溶液为栀子苷250μg/ml、橙皮苷50μg/ml、黄芩苷600μg/ml的混合溶液。
43.根据本发明的另一个方面，提供了一种包含黄芩的中药复方的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：
44.供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过超声提取后，过滤得到该供试品溶液，其中该中药复方包括黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草；
45.对照品溶液的制备：称取苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵和五味子醇甲作为对照品，添加10％～100％甲醇制成每1ml含每个对照品20～800μg的该对照品溶液；
46.根据高效液相检测该供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
47.高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0％～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～
140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm。
48.进一步地，该高效液相检测的该流速为0.8～1.2ml/min，柱温为35℃，检测波长为220nm。
49.进一步地，该中药复方溶液通过以下方法获得：称取适量的该中药复方，置于适当体积的容量瓶中，以及添加适量的体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液。
50.进一步地，该中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取10～60分钟，例如约20分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤。
51.进一步地，该中药复方的取样量为6～14g，例如约10g。
52.进一步地，该超声提取的功率为约500w，频率为约40khz。
53.进一步地，该对照品对应的色谱峰的峰纯度的纯度角度大于纯度阈值。
54.进一步地，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于10000。
55.进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
56.进一步地，在该检测波长为220nm时，该指纹图谱包括1-18号峰，其中，1号峰为苦杏仁苷、2号峰为桑皮苷a、3号峰为栀子苷、4号峰为阿魏酸、5号峰为甘草苷、9号峰为橙皮苷、10号峰为黄芩苷作为参照峰、16号峰为汉黄芩苷、17号峰为甘草酸铵、18号峰为五味子醇甲，其保留时间分别为28.5
±
10％、30.0
±
10％、34.5
±
10％、47.0
±
10％、50.0
±
10％、65.5
±
10％、77.5
±
10％、95.5
±
10％、105.0
±
10％、110.0
±
10％。
57.进一步地，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为7％～19％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、0.5％～5％、0.5％～5％。
58.进一步地，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为约11.81％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约2.11％、约2.36％。
59.进一步地，该黄芩为去朽心的黄芩。进一步地，该桔梗为去芦的桔梗。进一步地，该茯苓为去皮的茯苓。进一步地，该橘红为去白的橘红。进一步地，该贝母为去心的贝母。进一步地，该天门冬为去心的天门冬。进一步地，该苦杏仁为去皮尖的苦杏仁。进一步地，该苦杏仁为燀苦杏仁。进一步地，该麦冬为去心的麦冬。进一步地，该中药复方进一步包括生姜和大枣。进一步地，该中药复方中生姜的重量占比为2％～6％，例如约4.22％。进一步地，该中药复方中大枣的重量占比为8％～18％，例如约12.65％。
60.进一步地，该对照品溶液为栀子苷250μg/ml、橙皮苷50μg/ml、黄芩苷600μg/ml的混合溶液。
61.进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
62.进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或
者邻苯二甲酸和盐酸。
63.进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液。
64.进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或冰乙酸水溶液。
65.进一步地，该酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液。
66.进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
67.进一步地，该缓冲盐水溶液的ph值不大于7.0。
68.进一步地，该色谱柱为hss t3色谱柱、atlantis
tm t3色谱柱或c
18
色谱柱。
69.进一步地，该色谱柱为hss t3色谱柱。
70.进一步地，该流动相a为乙腈。
71.进一步地，该指纹图谱在检测波长220nm下，包括18个共有指纹峰，以10号峰黄芩苷色谱峰为参比峰，其他17个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.37
±
10％、2号色谱峰0.39
±
10％、3号色谱峰0.45
±
10％、4号色谱峰0.61
±
10％、5号色谱峰0.65
±
10％、6号色谱峰0.66
±
10％、7号色谱峰0.72
±
10％、8号色谱峰0.76
±
10％、9号色谱峰0.85
±
10％、11号色谱峰1.06
±
10％、12号色谱峰1.11
±
10％、13号色谱峰1.14
±
10％、14号色谱峰1.17
±
10％、15号色谱峰1.20
±
10％、16号色谱峰1.23
±
10％、17号色谱峰1.35
±
10％、18号色谱峰1.42
±
10％。
72.根据本发明的另一个方面，提供了一种对照品组合物的标准指纹图谱的构建方法，该构建方法包括：称取适量的苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵和五味子醇甲作为对照品；以及添加10％～100％甲醇制成每1ml含每个对照品20～800μg的该对照品溶液；该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，该图谱中呈现10个色谱峰，以黄芩苷色谱峰为参比峰，苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲的相对保留时间分别为：0.37
±
10％、0.39
±
10％、0.45
±
10％、0.61
±
10％、0.65
±
10％、0.85
±
10％、1.23
±
10％、1.35
±
10％、1.42
±
10％。
73.进一步地，该高效液相色谱图谱的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm。
74.进一步地，构建该标准指纹图谱之后，按上述检测方法构建包含黄芩的中药复方的指纹图谱，然后将其与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
75.进一步地，建立该标准指纹图谱之后，将上述构建方法所构建的指纹图谱与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
76.根据本发明的另一个方面，提供了一种上述检测方法或上述构建方法在包含黄芩的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
77.本发明的有益效果：
78.本发明的方法能够实现多指标检测含量的同时检测，能够更加全面地监控和评价中药复方的质量，涉及多个药味的专属性且专属性强，该方法经过耐用性、溶液稳定性、仪器精密度、进样精密度、重复性和中间精密度试验考察，证明该方法适合本技术的中药复方的特征图谱的检测。
附图说明
79.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
80.图1为本技术的中药复方粉末的30批煎液指纹图谱。
81.图2为本技术的中药复方粉末的30批煎液指纹拟合图谱。其中，峰1：苦杏仁苷，峰2：桑皮苷a，峰3：栀子苷，峰4：阿魏酸，峰5：甘草苷，峰9：橙皮苷，s：黄芩苷，峰16：汉黄芩苷，峰17：甘草酸铵，峰18：五味子醇甲。
具体实施方式
82.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
83.说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
84.除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
85.在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
86.正如背景技术部分所描述的，尚未见文献报道对包含黄芩的中药复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。为了解决上述问题，本发明提供了一种包含黄芩的中药复方的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
87.取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方包括黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草，该对照品包括栀子苷、橙皮苷和黄芩苷；
88.该检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，
梯度洗脱程序为：0～12min，0～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm；
89.根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
90.在本发明中，比例、当量、浓度、波长、温度、流速、重量份或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“200～300”时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
91.在一种优选的实施方式中，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草。
92.在一种优选的实施方式中，该对照品进一步包括桑皮苷a。
93.在一种优选的实施方式中，该中药复方供试品溶液的制备方法包括：在该中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过超声提取后，放冷，定容，摇匀，过滤得到该中药复方供试品溶液。
94.在一种优选的实施方式中，该中药复方溶液通过以下方法获得：称取适量的该中药复方，置于适当体积的容量瓶中，以及添加适量的体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液。
95.在一种优选的实施方式中，该中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取10～60分钟，例如约20分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤。
96.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约20”包括20的
±
5％，即从19到21；“约75”包括75的
±
5％，即从71.25到78.75。
97.在一种优选的实施方式中，该中药复方的取样量为6～14g，例如约10g。
98.在一种优选的实施方式中，该超声提取的功率为约500w，频率为约40khz。
99.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约10”包括10的
±
5％，即从9.5到10.5；“约500”包括500的
±
5％，即从475到525；“约40”包括40的
±
5％，即从38到42。
100.在一种优选的实施方式中，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的栀子苷、橙皮苷和黄芩苷；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成每1ml含每个对照品20～800μg的该对照品溶液。
101.在一种优选的实施方式中，每1ml的该对照品溶液包括栀子苷250μg、橙皮苷30～50μg、黄芩苷400～600μg。
102.在一种优选的实施方式中，每1ml的该对照品溶液进一步包括桑皮苷a 40μg。
103.在一种优选的实施方式中，该流速为0.8～1.2ml/min，该柱温为30～40℃，该检测波长为240～280nm。
104.在一种优选的实施方式中，该对照品中栀子苷检测波长为240nm。
105.在一种优选的实施方式中，该对照品中橙皮苷检测波长为280nm。
106.在一种优选的实施方式中，该对照品中黄芩苷检测波长为280nm。
107.在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的峰纯度的纯度角度大于纯度阈值。
108.在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于10000。
109.在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
110.在一种优选的实施方式中，该色谱柱为hss t3色谱柱、atlantis
tm t3色谱柱或c
18
色谱柱。
111.为了获得更多的色谱峰且具有更好的色谱峰的分离度，在一种优选的实施方式中，该色谱柱为hss t3色谱柱。
112.为了使得图谱中的各色谱峰峰型、分离度均更为优异，在一种优选的实施方式中，该流动相a为乙腈。
113.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
114.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
115.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液。
116.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或冰乙酸水溶液。
117.为了使得图谱中的各色谱峰峰型、分离度均更为优异，在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液。
118.在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
119.在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液的ph值不大于7.0。
120.在一种优选的实施方式中，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为7％～19％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、0.5％～5％、0.5％～5％。
121.在一种优选的实施方式中，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为约11.81％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约2.11％、约2.36％。
122.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约11.81”包括11.81的
±
5％，即从11.22到12.40；“约7.86”包括7.86的
±
5％，即从7.47到8.25；“约5.50”包括5.50的
±
5％，即从5.23到5.78；“约2.11”包括2.11的
±
5％，即从2.00到2.22；“约2.36”包括2.36的
±
5％，即从2.24到2.48。
123.在一种优选的实施方式中，该黄芩为去朽心的黄芩。在一种优选的实施方式中，该桔梗为去芦的桔梗。在一种优选的实施方式中，该茯苓为去皮的茯苓。在一种优选的实施方式中，该橘红为去白的橘红。在一种优选的实施方式中，该贝母为去心的浙贝母。在一种优选的实施方式中，该天门冬为去心的天门冬。在一种优选的实施方式中，该苦杏仁为去皮尖的苦杏仁。在一种优选的实施方式中，该苦杏仁为燀苦杏仁。在一种优选的实施方式中，该麦冬为去心的麦冬。在一种优选的实施方式中，该中药复方进一步包括生姜和大枣。在一种优选的实施方式中，该中药复方中生姜的重量占比为2％～6％，例如约4.22％。在一种优选的实施方式中，该中药复方中大枣的重量占比为8％～18％，例如约12.65％。
124.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约4.22”包括4.22的
±
5％，即从4.00到4.43；“约12.65”包括12.65的
±
5％，即从12.02到13.28。
125.在一种优选的实施方式中，该对照品溶液为栀子苷250μg/ml、橙皮苷50μg/ml、黄芩苷600μg/ml的混合溶液。
126.根据本发明的另一个方面，提供了一种包含黄芩的中药复方的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：
127.供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过超声提取后，过滤得到该供试品溶液，其中该中药复方包括黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草；
128.对照品溶液的制备：称取苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵和五味子醇甲作为对照品，添加10％～100％甲醇制成每1ml含每个对照品20～800μg的该对照品溶液；
129.根据高效液相检测该供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
130.高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0％～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm。
131.在一种优选的实施方式中，该高效液相检测的该流速为0.8～1.2ml/min，柱温为35℃，检测波长为220nm。其中，波长为220nm色谱图色谱峰个数较多，成分较复杂，基线较平稳，各色谱峰的整体协调性较好，220mn的色谱峰信息明显优于其它波长。
132.在一种优选的实施方式中，该中药复方溶液通过以下方法获得：称取适量的该中药复方，置于适当体积的容量瓶中，以及添加适量的体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液。
133.在一种优选的实施方式中，该中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取10～60分钟，例如约20分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤。
134.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约20”包括20的
±
5％，即从19到21；“约75”包括75的
±
5％，即从71.25到78.75。
135.在一种优选的实施方式中，该中药复方的取样量为6～14g，例如约10g。
136.在一种优选的实施方式中，该超声提取的功率为约500w，频率为约40khz。
137.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约10”包括10的
±
5％，即从9.5到10.5；“约500”包括500的
±
5％，即从475到525；“约40”包括40的
±
5％，即从38到42。
138.在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的峰纯度的纯度角度大于纯度阈值。
139.在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于10000。
140.在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
141.在一种优选的实施方式中，在该检测波长为220nm时，该指纹图谱包括1-18号峰，其中，1号峰为苦杏仁苷、2号峰为桑皮苷a、3号峰为栀子苷、4号峰为阿魏酸、5号峰为甘草苷、9号峰为橙皮苷、10号峰为黄芩苷作为参照峰、16号峰为汉黄芩苷、17号峰为甘草酸铵、18号峰为五味子醇甲，其保留时间分别为28.5
±
10％、30.0
±
10％、34.5
±
10％、47.0
±
10％、50.0
±
10％、65.5
±
10％、77.5
±
10％、95.5
±
10％、105.0
±
10％、110.0
±
10％。其中，波长为220nm色谱图色谱峰个数较多，成分较复杂，基线较平稳，各色谱峰的整体协调性较好，220mn的色谱峰信息明显优于其它波长。
142.在一种优选的实施方式中，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为7％～19％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、0.5％～5％、0.5％～5％。
143.在一种优选的实施方式中，该中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为约11.81％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约2.11％、约2.36％。
144.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约11.81”包括11.81的
±
5％，即从11.22到12.40；“约7.86”包括7.86的
±
5％，即从7.47到8.25；“约5.50”包括5.50的
±
5％，即从5.23到5.78；“约2.11”包括2.11的
±
5％，即从2.00到2.22；“约2.36”包括2.36的
±
5％，即从2.24到2.48。
145.在一种优选的实施方式中，该黄芩为去朽心的黄芩。在一种优选的实施方式中，该桔梗为去芦的桔梗。在一种优选的实施方式中，该茯苓为去皮的茯苓。在一种优选的实施方式中，该橘红为去白的橘红。进一步地，该贝母为去心的贝母。在一种优选的实施方式中，该天门冬为去心的天门冬。进一步地，该苦杏仁为去皮尖的苦杏仁。在一种优选的实施方式中，该苦杏仁为燀苦杏仁。在一种优选的实施方式中，该麦冬为去心的麦冬。在一种优选的实施方式中，该中药复方进一步包括生姜和大枣。在一种优选的实施方式中，该中药复方中生姜的重量占比为2％～6％，例如约4.22％。在一种优选的实施方式中，该中药复方中大枣的重量占比为8％～18％，例如约12.65％。
146.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约4.22”包括4.22的
±
5％，即从4.00到4.43；“约12.65”包括12.65的
±
5％，即从12.02到13.28。
147.在一种优选的实施方式中，该对照品溶液为栀子苷250μg/ml、橙皮苷50μg/ml、黄
芩苷600μg/ml的混合溶液。
148.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
149.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
150.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液。
151.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或冰乙酸水溶液。
152.为了使得图谱中的各色谱峰峰型、分离度均更为优异，在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液。
153.在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
154.在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液的ph值不大于7.0。
155.在一种优选的实施方式中，该色谱柱为hss t3色谱柱、atlantis tm t3色谱柱或c
18
色谱柱。
156.为了获得更多的色谱峰且具有更好的色谱峰的分离度，在一种优选的实施方式中，该色谱柱为hss t3色谱柱。
157.为了使得图谱中的各色谱峰峰型、分离度均更为优异，在一种优选的实施方式中，该流动相a为乙腈。
158.在一种优选的实施方式中，该指纹图谱在检测波长220nm下，包括18个共有指纹峰，以10号峰黄芩苷色谱峰为参比峰，其他17个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.37
±
10％、2号色谱峰0.39
±
10％、3号色谱峰0.45
±
10％、4号色谱峰0.61
±
10％、5号色谱峰0.65
±
10％、6号色谱峰0.66
±
10％、7号色谱峰0.72
±
10％、8号色谱峰0.76
±
10％、9号色谱峰0.85
±
10％、11号色谱峰1.06
±
10％、12号色谱峰1.11
±
10％、13号色谱峰1.14
±
10％、14号色谱峰1.17
±
10％、15号色谱峰1.20
±
10％、16号色谱峰1.23
±
10％、17号色谱峰1.35
±
10％、18号色谱峰1.42
±
10％。其中，波长为220nm色谱图色谱峰个数较多，成分较复杂，基线较平稳，各色谱峰的整体协调性较好，220mn的色谱峰信息明显优于其它波长。
159.根据本发明的另一个方面，提供了一种对照品组合物的标准指纹图谱的构建方法，该构建方法包括：称取适量的苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵和五味子醇甲作为对照品；以及添加10％～100％甲醇制成每1ml含每个对照品20～800μg的该对照品溶液；该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，该图谱中呈现10个色谱峰，以黄芩苷色谱峰为参比峰，苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲的相对保留时间分别为：0.37
±
10％、0.39
±
10％、0.45
±
10％、0.61
±
10％、0.65
±
10％、0.85
±
10％、1.23
±
10％、1.35
±
10％、1.42
±
10％。
160.在一种优选的实施方式中，该高效液相色谱图谱的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0～5％a；12～
30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm。
161.在一种优选的实施方式中，构建该标准指纹图谱之后，按上述检测方法构建包含黄芩的中药复方的指纹图谱，然后将其与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
162.在一种优选的实施方式中，建立该标准指纹图谱之后，将上述构建方法所构建的指纹图谱与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
163.根据本发明的另一个方面，提供了一种上述检测方法或上述构建方法在包含黄芩的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
164.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
165.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本技术所要求保护的范围。
166.实施例
167.1仪器、试剂与对照品
168.本技术所使用的仪器和厂家如下所示。
169.高效液相色谱仪型号：waters 2695-996沃特世科技有限公司；
170.色谱柱型号：hss t3 4.6
×
150mm 3.5μm；序列号：01563113018792
171.色谱柱型号：atlantis
tm t3 4.6
×
150mm 3.0μm；序列号：01993111914043
172.色谱柱型号：c
18 4.6
×
150mm 3.5μm；序列号：02323128512437
173.本技术所使用的对照品如表1所示。
174.表1本技术所使用的对照品
[0175][0176]
甲醇、乙腈、磷酸、甲酸、冰醋酸来源于国药集团化学试剂有限公司。
[0177]
2中药复方粉末的制备方法
[0178]
黄芩(去朽心)5.60g，桔梗(去芦)、茯苓(去皮)、橘红(去白)、浙贝母片(去心)、桑白皮各3.73g，当归、天门冬(去心)、栀子、燀苦杏仁(去皮尖)、麦冬(去心)各2.61g，五味子1.00g，甘草1.12g，以上13味破碎成粗颗粒；加生姜片2.00g，大枣(破开)6.00g；合计重47.42g。置1l多功能煎药壶中，加水480ml(10倍量)，加盖，浸泡60分钟，武火(225v)加热至沸后，转文火(175v)保持微沸40分钟，120目滤网趁热滤过，即得。
[0179]
3洗脱条件摸索
[0180]
3.1洗脱条件1
[0181]
色谱条件及系统适用性参数以十八烷基键合硅胶为填充剂(色谱条件及系统适用性参数以十八烷基键合硅胶为填充剂(hss t3，3.5μm 4.6*150mm)；以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；紫外检测器检测，特征图谱检测波长220nm，含量全波长检测。
[0182]
表2中药复方煎液特征图谱色谱条件-梯度1
[0183][0184][0185]
供试品溶液制备取中药复方粉末约10g，置20ml容量瓶中，加75％甲醇适量，超声(500w，40khz)超声20分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0186]
参照物溶液制备取桑皮苷a、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含桑皮苷a40μg、栀子苷0.25mg、橙皮苷30μg、黄芩苷0.4mg的混合溶液，作为参照物溶液。
[0187]
测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0188]
结果表明，在梯度1条件下，中药复方粉末煎液供试品色谱图各峰分离较好，基本满足特征图谱的条件，但在出峰时间110～117min内峰信息较多，后续进行优化，设计梯度2。
[0189]
3.2洗脱条件2
[0190]
色谱柱为hss t3，3.5um 4.6*150mm；流动相为乙腈～0.1％磷酸溶液；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；紫外检测器全波长检测。梯度洗脱程序如表3所示。
[0191]
表3中药复方煎液特征图谱色谱条件-梯度2
[0192][0193][0194]
供试品溶液制备取中药复方粉末约10g，置20ml容量瓶中，加75％甲醇适量，超声(500w，40khz)超声20分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0195]
参照物溶液制备取桑皮苷a、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含桑皮苷a40μg、栀子苷0.25mg、橙皮苷30μg、黄芩苷0.4mg的混合溶液，作为参照物溶液。
[0196]
测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0197]
结果表明，在梯度2条件下，相对于梯度1，色谱峰更多，成分更复杂，且分离度更优。
[0198]
4柱温考察
[0199]
取3.2中所涉及的中药复方粉末供试品溶液过微孔滤膜滤1份进样，考察柱温25℃、30℃、35℃对梯度2特征图谱的影响。
[0200]
结果表明，中药复方粉末供试品溶液在梯度2不同柱温(25℃、30℃、35℃)下，其液相色谱图大体相似；随柱温的升高，各特征峰出峰时间略提前，其中柱温为35℃时，色谱更多且分离度更好，各色谱峰峰型更为优异。
[0201]
5流速考察
[0202]
取3.2中所涉及的中药复方粉末供试品溶液过微孔滤膜滤1份进样，考察流速0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min对梯度2特征图谱的影响。
[0203]
结果表明，中药复方粉末供试品溶液在梯度2不同流速(0.8ml/min、1.0ml/min、
1.2ml/min)下，其液相色谱图大体相似；随流速的升高，各特征峰出峰时间略提前，各特征峰分离间距增大；考虑色谱柱的耐用性，选定流速为1.0ml/min。
[0204]
6色谱柱考察
[0205]
取3.2中所涉及的中药复方粉末供试品溶液过微孔滤膜滤1份进样，考察色谱柱hss t3、atlantis
tm t3、c
18
对梯度2特征图谱的影响。
[0206]
结果表明，中药复方粉末供试品溶液在梯度2不同色谱柱(hss t3、atlantis
tm t3、c
18
)下，其液相色谱图大体相似，说明此色谱条件稳定，考虑实验的延续性，选定色谱柱为hss t3。
[0207]
7酸种类考察
[0208]
取3.2中所涉及的中药复方粉末供试品溶液过微孔滤膜滤1份进样，考察0.1％磷酸、0.1％甲酸、0.1％冰醋酸对梯度2特征图谱的影响。
[0209]
结果表明，在梯度2下，中药复方粉末供试品溶液在0.1％甲酸、0.1％冰醋酸下，其液相色谱图基线不稳；在0.1％磷酸下整体图谱较好，故确定0.1％磷酸作为色谱条件流动性b。
[0210]
8提取溶剂考察
[0211]
取中药复方粉末10份，分别考察纯水、10％甲醇、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇为提取溶剂对中药复方粉末供试品溶液样品含量测定的影响。
[0212]
取中药复方粉末10份，各约10g，精密称定，置20ml量瓶中，分别加纯水、10％甲醇、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇适量，超声(500w，40khz)处理20分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，进样。结果如表4所示。
[0213]
表4不同提取溶剂处理中药复方粉末供试品溶液含量检测信息汇总
[0214][0215][0216]
结果表明，中药复方粉末不同提取溶剂处理后，75％甲醇处理后其检测含量相对最大，故中药复方粉末含量测定的处理溶剂为75％甲醇。
[0217]
9取样量考察
[0218]
取中药复方粉末6份，分别考察取样量为6g、10g、14g对中药复方粉末供试品溶液样品含量测定的影响。
[0219]
取中药复方粉末6份，各6g、10g、14g，精密称定，置20ml量瓶中，加75％甲醇适量，超声(500w，40khz)处理20分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，进样，结果如表5所示。
[0220]
表5中药复方粉末不同取样量含量检测信息汇总
[0221][0222]
结果表明，中药复方粉末不同取样量经75％甲醇处理后，取样量为6～10g其检测含量相同，略大于取样量14g，说明取样量在6～10g范围内其检测方法稳定，色谱峰整体分布较好。考虑含量检测和特征图谱检测共用同一个方法，故确定取样量为10g。
[0223]
10检测方法确定
[0224]
色谱柱为hss t3，3.5um 4.6*150mm；流动相为乙腈～0.1％磷酸溶液；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；紫外检测器全波长检测。梯度洗脱程序如表6所示。
[0225]
表6梯度洗脱程序
[0226]
时间(min)乙腈(％)0.1％磷酸(％)0～120
→
5100
→
9512～305
→
1095
→
9030～4510
→
1590
→
8545～7515
→
2085
→
8075～9020
→
2380
→
7790～10523
→
4577
→
55105～11545
→
6055
→
40115～12560
→
8040
→
20125～13080
→
020
→
100130～1400100
[0227]
参照物溶液制备取桑皮苷a、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每栀子苷0.25mg、橙皮苷50μg、黄芩苷0.6mg、桑皮苷a 40μg的混合溶液，作为参照物溶液。
[0228]
供试品溶液制备取中药复方粉末10g，置20ml容量瓶中，加75％甲醇适量，超声
(500w，40khz)超声20分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0229]
取30批次的中药复方粉末。该中药复方粉末的制备方法如下：取黄芩(去朽心)5.60g，桔梗(去芦)、茯苓(去皮)、橘红(去白)、浙贝母片(去心)、桑白皮各3.73g，当归、天门冬(去心)、栀子、燀苦杏仁(去皮尖)、麦冬(去心)各2.61g，五味子1.00g，甘草1.12g，以上13味破碎成粗颗粒；加生姜片2.00g，大枣(破开)6.00g；合计重47.42g。置1l多功能煎药壶中，加水480ml(10倍量)，加盖，浸泡60分钟，武火(225v)加热至沸后，转文火(175v)保持微沸40分钟，120目滤网趁热滤过，即得。
[0230]
将该中药复方粉末进行供试品溶液制备并进行指纹图谱检测，结果如图1和图2所示。
[0231]
特征图谱检测——检测波长220nm。
[0232]
含量测定检测——栀子苷检测波长240nm，桑皮苷a、橙皮苷、黄芩苷检测波长280nm。
[0233]
测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0234]
11特征图谱峰归属
[0235]
本发明的中药复方粉末特征图谱色谱峰归属指认结果可知，如图1和图2的色谱图所示，主要呈现18个色谱峰，其中峰1归属于苦杏仁药味，为苦杏仁苷；峰2归属于桑白皮药味，为桑皮苷a；峰3归属于栀子药味，为栀子苷；峰4归属于当归药味，为阿魏酸；峰5、峰17归属于甘草药味，分别为甘草苷、甘草酸铵；峰6、峰7、峰10～16归属于黄芩药味，峰10为黄芩苷，峰16为汉黄芩苷；峰8、峰9归属于橘红药味，峰9为橙皮苷；峰18归属于五味子药味，为五味子醇甲。
[0236]
将空白溶剂、对照品溶液、中药复方粉末基准样品各药味阴性及单味对照溶液、中药复方粉末基准样品供试品溶液进样分析，在桑皮苷a、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷出峰位置及拟定特征峰出峰位置，空白溶剂及阴性对照溶液无干扰。其色谱图中具体色谱峰归属药味如表7和表8所示。
[0237]
表7色谱图中具体色谱峰归属药味-1
[0238]
[0239][0240]
表8色谱图中具体色谱峰归属药味-2
[0241]
[0242][0243]
中药复方粉末中含量测定峰桑皮苷a(检测波长280nm)、栀子苷(检测波长240nm)、橙皮苷(检测波长280nm)、黄芩苷(检测波长280nm)与单味药阴性煎液测定图谱对比无干扰，专属性强，故确定中药复方粉末中桑皮苷a、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷为其含量测定指标。
[0244]
12含量测定方法的方法学验证
[0245]
本发明的上述标准品的含量检测重复性、中间精密度、仪器精密度、准确度、耐用性、稳定性rsd≤3％，回收率rsd≤3％，回收率均在90％～108％范围内，线性良好，相关系数r2不小于0.9990。
[0246]
13特征图谱的方法学验证
[0247]
特征图谱的重复性、中间精密度、仪器精密度、耐用性、溶液稳定性的图谱的相似度都大于0.99。
[0248]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体构造及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
[0249]
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

技术特征：
1.一种包含黄芩的中药复方的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中所述中药复方包括黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草，所述对照品包括栀子苷、橙皮苷和黄芩苷；所述检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm；根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信息为根据所记录的所述中药复方供试品溶液的色谱图和所述对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述中药复方中以下成分中一种或多种的含量：黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草；优选地，所述对照品进一步包括桑皮苷a；优选地，所述中药复方供试品溶液的制备方法包括：在所述中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过超声提取后，放冷，定容，摇匀，过滤得到所述中药复方供试品溶液；优选地，所述中药复方溶液通过以下方法获得：称取适量的所述中药复方，置于适当体积的容量瓶中，以及添加适量的体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液；优选地，所述中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取10～60分钟，例如约20分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤；优选地，所述中药复方的取样量为6～14g，例如约10g；优选地，所述超声提取的功率为约500w，频率为约40khz；优选地，所述对照品溶液的制备方法包括：称取适量的栀子苷、橙皮苷和黄芩苷；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成每1ml含每个对照品20～800μg的所述对照品溶液；优选地，每1ml的所述对照品溶液包括栀子苷250μg、橙皮苷30～50μg、黄芩苷400～600μg；优选地，每1ml的所述对照品溶液进一步包括桑皮苷a 40μg；更优选地，所述流速为0.8～1.2ml/min，所述柱温为30～40℃，所述检测波长为240～280nm；又优选地，所述对照品中栀子苷检测波长为240nm；又优选地，所述对照品中橙皮苷检测波长为280nm；又优选地，所述对照品中黄芩苷检测波长为280nm；又优选地，所述对照品对应的色谱峰的峰纯度的纯度角度大于纯度阈值；特别优选地，所述对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于10000；
尤其优选地，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5；又尤其优选地，所述色谱柱为hss t3色谱柱、atlantis
tm t3色谱柱或c
18
色谱柱；最优选地，所述色谱柱为hss t3色谱柱。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相a为乙腈；优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液；更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或冰乙酸水溶液；更优选地，所述酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液；更优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；更优选地，所述缓冲盐水溶液的ph值不大于7.0；特别优选地，所述中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为7％～19％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、0.5％～5％、0.5％～5％；尤其优选地，所述中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为约11.81％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约2.11％、约2.36％；又优选地，所述黄芩为去朽心的黄芩；又优选地，所述桔梗为去芦的桔梗；又优选地，所述茯苓为去皮的茯苓；又优选地，所述橘红为去白的橘红；又优选地，所述贝母为去心的浙贝母；又优选地，所述天门冬为去心的天门冬；又优选地，所述苦杏仁为去皮尖的苦杏仁；又优选地，所述苦杏仁为燀苦杏仁；又优选地，所述麦冬为去心的麦冬；又优选地，所述中药复方进一步包括生姜和大枣；又优选地，所述中药复方中生姜的重量占比为2％～6％，例如约4.22％；又优选地，所述中药复方中大枣的重量占比为8％～18％，例如约12.65％；最优选地，所述对照品溶液为栀子苷250μg/ml、橙皮苷50μg/ml、黄芩苷600μg/ml的混
合溶液。4.一种包含黄芩的中药复方的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过超声提取后，过滤得到所述供试品溶液，其中所述中药复方包括黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草；对照品溶液的制备：称取苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵和五味子醇甲作为对照品，添加10％～100％甲醇制成每1ml含每个对照品20～800μg的所述对照品溶液；根据高效液相检测所述供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0％～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述高效液相检测的所述流速为0.8～1.2ml/min，柱温为35℃，检测波长为220nm；优选地，所述中药复方溶液通过以下方法获得：称取适量的所述中药复方，置于适当体积的容量瓶中，以及添加适量的体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液；优选地，所述中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取10～60分钟，例如约20分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为约75％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤；优选地，所述中药复方的取样量为6～14g，例如约10g；优选地，所述超声提取的功率为约500w，频率为约40khz；又优选地，所述对照品对应的色谱峰的峰纯度的纯度角度大于纯度阈值；特别优选地，所述对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于10000；尤其优选地，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5；更优选地，在所述检测波长为220nm时，所述指纹图谱包括1-18号峰，其中，1号峰为苦杏仁苷、2号峰为桑皮苷a、3号峰为栀子苷、4号峰为阿魏酸、5号峰为甘草苷、9号峰为橙皮苷、10号峰为黄芩苷作为参照峰、16号峰为汉黄芩苷、17号峰为甘草酸铵、18号峰为五味子醇甲，其保留时间分别为28.5
±
10％、30.0
±
10％、34.5
±
10％、47.0
±
10％、50.0
±
10％、65.5
±
10％、77.5
±
10％、95.5
±
10％、105.0
±
10％、110.0
±
10％；特别优选地，所述中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为7％～19％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、3％～13％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、1％～11％、0.5％～5％、0.5％～5％；尤其优选地，所述中药复方中黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀
子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草的重量占比为约11.81％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约7.86％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约5.50％、约2.11％、约2.36％；又优选地，所述黄芩为去朽心的黄芩；又优选地，所述桔梗为去芦的桔梗；又优选地，所述茯苓为去皮的茯苓；又优选地，所述橘红为去白的橘红；又优选地，所述贝母为去心的浙贝母；又优选地，所述天门冬为去心的天门冬；又优选地，所述苦杏仁为去皮尖的苦杏仁；又优选地，所述苦杏仁为燀苦杏仁；又优选地，所述麦冬为去心的麦冬；又优选地，所述中药复方进一步包括生姜和大枣；又优选地，所述中药复方中生姜的重量占比为2％～6％，例如约4.22％；又优选地，所述中药复方中大枣的重量占比为8％～18％，例如约12.65％；最优选地，所述对照品溶液为栀子苷250μg/ml、橙皮苷50μg/ml、黄芩苷600μg/ml的混合溶液。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述流动相a为乙腈；优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液；更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或冰乙酸水溶液；更优选地，所述酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液；更优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；更优选地，所述缓冲盐水溶液的ph值不大于7.0；又优选地，所述色谱柱为hss t3色谱柱、atlantis
tm t3色谱柱或c
18
色谱柱；又优选地，所述色谱柱为hss t3色谱柱特别优选地，所述指纹图谱在检测波长220nm下，包括18个共有指纹峰，以10号峰黄芩苷色谱峰为参比峰，其他17个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.37
±
10％、2号色谱峰0.39
±
10％、3号色谱峰0.45
±
10％、4号色谱峰0.61
±
10％、5号色谱峰0.65
±
10％、6号色谱峰0.66
±
10％、7号色谱峰0.72
±
10％、8号色谱峰0.76
±
10％、9号色谱峰0.85
±
10％、11号色谱峰1.06
±
10％、12号色谱峰1.11
±
10％、13号色谱峰1.14
±
10％、14号色谱峰1.17
±
10％、15号色谱峰1.20
±
10％、16号色谱峰1.23
±
10％、17号色谱峰1.35
±
10％、
18号色谱峰1.42
±
10％。7.一种对照品组合物的标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：称取适量的苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵和五味子醇甲作为对照品；以及添加10％～100％甲醇制成每1ml含每个对照品20～800μg的所述对照品溶液；所述标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，所述图谱中呈现10个色谱峰，以黄芩苷色谱峰为参比峰，苦杏仁苷、桑皮苷a、栀子苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲的相对保留时间分别为：0.37
±
10％、0.39
±
10％、0.45
±
10％、0.61
±
10％、0.65
±
10％、0.85
±
10％、1.23
±
10％、1.35
±
10％、1.42
±
10％。8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱图谱的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，0～5％a；12～30min，5％～10％a；30～45min，10％～15％a；45～75min，15％～20％a；75～90min，20％～23％a；90～105min，23％～45％a；105～115min，45％～60％a；115～125min，60％～80％a；125～130min，80％～0％a；130～140min，0％a；流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～300nm。9.根据权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，构建所述标准指纹图谱之后，按权利要求1至3中任一项所述的检测方法构建包含黄芩的中药复方的指纹图谱，然后将其与所述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90；可替换地，建立所述标准指纹图谱之后，将权利要求4至6中任一项所述的构建方法所构建的指纹图谱与所述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。10.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法或根据权利要求4至9中任一项所述的构建方法在包含黄芩的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。

技术总结
本发明公开了一种包含黄芩的中药复方的检测方法，该检测方法包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方包括黄芩、桔梗、茯苓、橘红、贝母、桑白皮、当归、天门冬、栀子、苦杏仁、麦冬、五味子和甘草，所述对照品包括栀子苷、橙皮苷和黄芩苷；以及根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。该方法专属性强；经耐用性、溶液稳定性、仪器精密度、进样精密度、重复性、中间精密度试验考察，证明该方法适合本申请的中药复方的特征图谱的检测。合本申请的中药复方的特征图谱的检测。合本申请的中药复方的特征图谱的检测。


技术研发人员：易跃能 朱亚文 王赞文 陈锋
受保护的技术使用者：湖南易能生物医药有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/24