一种帕金森病食蟹猴动物模型的建立方法

1.本发明属动物实验技术，具体涉及一种帕金森病食蟹猴动物模型的建立方法。


背景技术：

2.帕金森病(pd)是全球第二大神经退行性疾病，主要临床表现为静息性震颤，运动迟缓，肌肉强直以及步态不稳等运动症状，以及睡眠障碍、抑郁和认知变化等非运动症状。pd在65岁以上人群中患病率约为2％，随着人口老龄化的进程，该病发病率持续增加，已成为国家和家庭沉重的医疗和经济负担。pd(包括散发性和遗传性pd)典型病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元的进行性死亡和中枢神经系统中路易小体的形成。其中路易小体主要由α-syn的包涵体及其聚集体组成，因此pd被认为是一种a-突触核蛋白病。尽管目前对于pd的致病机制有很多假设和猜想，但是这些理论的准确性和可靠性依然有待考证。由于致病机制不清，在很大程度上限制了对疾病治疗方法的研究。为进一步深入研究pd的致病机制，开发效果显著能改变疾病进展的治疗措施，建立适合的动物模型很有必要。目前pd研究中最常用的是由药物6-ohda建立的啮齿类模型，但由于啮齿类在基因相似性、脑结构上与人类差距较大，以其为研究对象所获得的的实验数据对于临床指导意义有限。食蟹猴的脑解剖结构，生理功能，免疫和代谢系统都与人类更为接近，且食蟹猴与人类的基因同源性高度相似，具备高级脑功能，包括复杂的认知过程和情感表达。利用食蟹猴作为pd疾病机制研究、临床前药物研究等领域具有更高的价值。多年来，利用mptp建立的pd非人灵长类动物模型认被认为是金标准模型，但是mptp建立的pd模型不能复制pd的多系统病理表现，直接导致中脑多巴胺能神经元死亡，不能复制细胞内α-syn聚集体的形成，无法模拟临床病人的疾病进程，因此从病因学的角度建立食蟹猴pd模型能够模拟pd的发病过程，是进行治疗研究和临床前药物评价的迫切需要。将食蟹猴pd模型用于干细胞移植策略的研究中，可以更好模拟细胞移植进入病理状态的脑环境后p-a-syn的传播情况，以及细胞移植后在炎症环境下的存活情况，为临床转化提供更优的疾病模型，同时可以为疾病早期的神经保护药物筛选提供窗口。


技术实现要素：

3.本发明的目的是建立一种造模成功率高、具有病理、行为和影像学特征，能够更好用于治疗研究和药物评价的帕金森病食蟹猴动物模型的建立方法。
4.利用腺病毒(aav)过表达α-syn，脑中注射后会引起神经元丢失和α-syn的聚集，能在一定程度上模拟pd的病理特征(黑质多巴胺能神经元的死亡)，但是很难模拟出部分pd样的运动缺陷(如静息性震颤等)。在pd患者尸检大脑中发现存在parp-1，它的代谢产物par能够与α-syn的氨基端相互作用加速α-syn的纤维化，使α-syn转变为更耐蛋白酶k消化、毒性更强、更易传播和磷酸化程度更高的结构，通过注射a-syn纤维结合par能够加速小鼠的明显pd发病进程。因此，我们采用注射过表达α-syn的aav病毒同时联合注射par的方式建立pd猴模型，旨在能够快速且高效的获得具有临床病理、行为和影像特征的pd猴模型。目前这种
联合造模方法在食蟹猴中还没有相关报道，因此将其用于非人灵长类的造模还需要严格的实验研究。
5.本发明方法如下：以食蟹猴作为模型动物，采用脑立体定位方式，在黑质部位先注射aav-snca，注射总量为42-48μl；间隔85-95天，再对同样位置注射par，注射总量为23-27μl。
6.优选地，本发明方法按以下步骤：将食蟹猴深麻醉，固定头部剔除毛发，消毒，用手术刀暴露颅骨，通过定位仪确定ap0点位置，根据mri量取的纹状体位置确定颅骨表面的注射位置并进行标记，先注射aav于黑质部位，总量为45μl，之后注射托芬那酸,vetoquinol s.a，4mg/kg，i.m.；间隔3个月，再对相同位置注射par，总量为25μl，且手术结束后一样进行托芬那酸(4mg/kg，i.m.)的注射，病毒和par注射后，每只动物喂食专用饲料，自由饮水。
7.本发明的优点和积极效果是：
8.1.本发明动物模型的建立方法安全可靠，模拟了pd的病理、影像和行为结果，具有良好的应用前景。
9.2.通过建立aav+par诱导的pd食蟹猴模型，可以用来研究pd的发病机制和疾病进程，探究细胞移植后疾病环境对治疗的影响，筛选神经保护药物，进行临床前药物评价，具有十分重要的意义。
附图说明
10.图1为实施例的食蟹猴注射后的kurlan评分。
11.图2为实施例中的一只食蟹猴造模前后的影像学检查对比。图中的a为病毒和par注射前，纹状体左右两侧多巴胺转运体摄入量统计量无显著性差异，b为病毒和par注射在右侧黑质，注射18个月以后，右侧纹状体的多巴胺转运体摄入量相比造模前同侧显著性降低，相比未注射对侧显著性降低，表明多巴胺能神经元的死亡。
12.图3为实施例中的一只食蟹猴造模后脑组织黑质部位多巴胺能神经元免疫组化染色图，
13.图4为实施例中的一只食蟹猴造模后的脑组织黑质和纹状体路易小体的免疫组化染色图。
14.图5为实施例中的一只食蟹猴造模后的脑组织黑质纹状体神经胶质细胞免疫组化染色图。
15.以下结合附图对本发明做进一步说明，本发明包括但不限于实施例列举的内容。
具体实施方式
16.见下述实施例。
17.(一)模型的建立
18.选取老年雄性食蟹猴4只作为模型动物，体重6-8kg，模型动物在造模时采用脑立体定位方式注射aav-snca和par，在手术前，利用盐酸氯胺酮注射液(0.2ml/kg，i.m.)、盐酸阿托品注射液(0.02mg/kg，i.m.)、速眠新ⅱ注射液(2mg/kg，i.m.)将实验猴进行深度麻醉，同时注射青霉素(哈药集团，5
×
105单位，i.m.)，防止感染。待实验猴彻底麻醉后，实验猴转移至手术台，利用脑部定位仪将头部固定；随后使用手术刀将毛发剔除并进行消毒操作。使
用手术刀暴露颅骨，通过定位仪确定ap0点位置，再根据mri量取的纹状体位置确定颅骨表面的注射位置并进行标记，aav注射在黑质部位，注射位点分别为：sn1:前后18.4mm；旁开：45.86mm；深度：13.9
±
0.5mm(每隔0.5mm注射病毒量5μl)sn2：前后17.2mm；旁开：47mm；深度：13.4
±
0.5mm(每隔0.5mm注射病毒量5μl)
19.sn3：前后15.5mm；旁开：48.01mm；深度：14.6
±
0.5mm，aav-snca(brainvta,raav-hsyn-snca-p2a-egfp-3flag-wpre-hgh pa,9-3562-k210308,1.00e+14vg/ml)，在手术后进行注射托芬那酸(vetoquinol s.a，4mg/kg，i.m.)减少动物感染和减轻疼痛。手术后3个月，再进行par的注射，注射位置与注射病毒的位置完全相同，总量为25μl，且手术结束后一样进行托芬那酸(4mg/kg，i.m.)的注射。病毒和par注射后，每只动物喂食专用饲料，自由饮水。
20.(二)食蟹猴pd诊断评价及结果
21.包括行为学评价、影像学、病理组织学诊断。
22.1、行为学评价主要为pd库伦评分
23.见图1。造模后每3个月进行行为录像，录像的视频进行kurlan评分，评分结果显示：模型猴在造模后与造模前相比评分得分升高。图1的横坐标为时间(月)，纵坐标为分值。
24.2、影像学检查
25.见图2。在氯胺酮肌肉麻醉的条件下，使用spect对头部进行扫描，保存图片进行分析，结果显示：与造模前相比，模型猴造模侧脑中多巴胺转运体的数量呈现显著降低。
26.3、病理组织学分析
27.见图3-图5。选取一只实验猴安乐死后，剥离脑组织，进行固定脱水，采用免疫组织化学方式进行检测多巴胺能神经元的减少，以及路易小体的生成和胶质细胞增生情况。病理切片分析结果：
28.实验猴病毒注射侧的黑质多巴胺能神经元出现显著性丢失，伴随着路易小体的出现，同时引起持续性的炎症反应，小胶质细胞被激活并呈现浸润状态。

技术特征：
1.一种帕金森病食蟹猴动物模型的建立方法，其特征在于：以食蟹猴作为模型动物，采用脑立体定位方式，在黑质部位先注射aav-snca，注射总量为42-48μl；间隔85-95天，再对同样位置注射par，注射总量为23-27μl。2.如权利要求1所述的帕金森病食蟹猴动物模型的建立方法，其特征在于：将食蟹猴深麻醉，固定头部剔除毛发，消毒，用手术刀暴露颅骨，通过定位仪确定ap0点位置，根据mri量取的纹状体位置确定颅骨表面的注射位置并进行标记，先注射aav于黑质部位，总量为45μl，之后注射托芬那酸,vetoquinol s.a，4mg/kg，i.m.；间隔3个月，再对相同位置注射par，总量为25μl，且手术结束后一样进行托芬那酸(4mg/kg，i.m.)的注射，病毒和par注射后，每只动物喂食专用饲料，自由饮水。

技术总结
一种帕金森病食蟹猴动物模型的建立方法，属动物实验技术。以食蟹猴作为模型动物，采用脑立体定位方式，在黑质部位先注射AAV-SNCA，注射总量为42-48μl；间隔85-95天，再对同样位置注射PAR，注射总量为23-27μl。本发明动物模型的建立方法安全可靠，模拟了PD的病理、影像和行为结果，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：司维 王正波 刘书一 董文静 董为鑫 黄田庄
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/8/24