用于养护窖泥的混合菌液及其在窖泥改良方面的应用

1.本发明涉及酿酒技术领域，具体涉及一种用于养护窖泥的混合菌液制备办法及改良窖泥的方案。


背景技术：

2.中国浓香型白酒是通过在一个特殊的矩形坑中自发的固态发酵产生，窖泥(pm)是覆盖发酵坑内壁和底部的特定发酵粘土，通过为发酵微生物提供适宜的栖息地，在发酵过程中发挥重要作用。窖泥是浓香型、兼香型、芝麻香型等白酒生产的基础，只有富合多种优良菌种，具有良好微生态体系的窖泥才能生产出优质的基酒。但窖泥随着生产时间的延长会逐渐退化，导致窖泥酿造过程有损失。且不同窖泥理化性质的差异主要是由ph以及水分、有机物、腐殖酸、有效氮、有效磷和有有效钾的含量决定。我们通过扩培上述混合菌株从而实现对窖泥的养护和改良，并可以通过对上述理化因素进行规定数值、含量范围内的动态调控从而改良窖泥。


技术实现要素：

3.在浓香型白酒生产过程中，部分窖池在连续使用一段时间后,窖壁上会出现干枯起碱，并随之出现白色晶体，严重者甚至会出现板结不吸水，此时窖泥中功能微生物的数量及活力大幅下降，针对现有窖泥发酵的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于养护窖泥的混合菌液，将功能微生物的菌液应用于已老化窖泥的复壮，改良老化窖泥，使之更适合功能微生物栖息和生长繁殖，可以有效提高窖泥中功能微生物的数量，恢复并提高其在窖泥中的作用，同时提供一种对窖泥理化因素动态调控的思路。
4.为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
5.一种养护窖泥的混合菌液，所述混合菌液是将产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉菌液按体积比5:2:1:1:1:2:2:1的比例混合制成。
6.作为对上述混合菌液的进一步优化，所述产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉菌均为培养至对数期的菌液。更进一步地，每种菌的浓度控制在10
8-109cfu/ml。
7.作为对上述混合菌液的进一步优化，所述产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母，发酵培养基按照以下条件制备：麸皮5.0-10g/l，牛肉膏2-5g/l，酒糟3-8g/l，ph 5.5-7.0；接种菌液量为1％，在28℃、转速150r/min的条件下培养36h；所述甲烷菌液体培养基为：5.4％-7.2％葡萄糖、1.2％-1.4％的乙酸钠、0.02％-0.07％氯化镁、0.01％-0.4％氯化钠、0.05％-0.1％磷酸二氢钾、0.01％-0.06％的氯化铵、1.2％-1.6％硫化钠、0.9％-1.2％甲醇，ph 6.5-7.4；接种菌液量为8.0-10％，在30℃、通入80％氮气+20％二氧化碳的混合气培养30天；
所述丙酸嗜蛋白菌发酵培养基按照以下条件制备：酵母粉10-12g/l，蛋白胨5-8g/l，肉汤5-10g/l，nahco
3 0.4-0.5g/l，nacl 0.08-0.15g/l，k2hpo
4 0.02-0.1g/l，kh2po
4 0.02-0.1g/l，mgso
4 0.02-0.1g/l和cacl
2 0.1-0.3g/l，半胱氨酸溶液0.5-1g/l，氯化血红素溶液0.5-1.0g/l，ph 7.0-8.0；接种菌液量为10-12％，于35-37℃厌氧培养3-4h；所述己酸菌发酵培养基按照以下条件制备：蛋白胨8.0-10.0g/l，牛肉粉8.0-10.0g/l，酵母粉2.0-3.5g/l，葡萄糖1.0-6.0g/l，可溶性淀粉1.0-2.0g/l，氯化4.0-6.0g/l，醋酸钠3.0-6.0g/l，半胱氨酸盐酸盐0.5-1.0g/l，抗坏血酸0.2-1.0g/l，琼脂0.5-2,5g/l，ph 6.0-6.5；接种量12-15％，快速放入厌氧培养袋中于32℃培养12天；所述凝结芽孢杆菌发酵培养基按照以下条件制备：葡萄糖7.0-10.0g/l、水溶性淀粉8.0-11.0g/l、酵母浸膏8.0-10.0g/l、棉籽粉6.0-10.0g/l、kcl 0.7-0.8g/l、mgso
4 0.5-1.0g/l、kh2po
4 0.5-1.5g/l，调初始ph至6.0-7.0；接种菌液量为3％，在37℃、转速180r/min的条件下培养30h；所述米曲霉发酵培养基按照以下条件制备：麸皮1.0-2.0％,蛋白胨1.0-2.0％，尿素0.5-1.0％，硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钠0.1-0.4％；接种量为5-8％，ph为5.0-6.5，转速为150r/min，40℃培养50h。
8.一种窖泥养护方法，是采用上述的混合菌液灌淋窖池。具体地，在灌淋前先打扫窖池，除去窖壁及窖底的底糟，并在窖壁四周打孔，小孔排列应呈耙齿状，并呈“品”字形排列，孔径为6mm～10mm、孔距70mm～80mm、孔深30mm～50mm；窖壁上的孔径45
°
倾斜；灌淋时让每个孔内灌满混合菌液，待菌液被窖泥吸收后，抹平窖壁；窖底养护操作与窖壁相同。
9.上述混合菌液或窖泥养护方法在窖泥改良方面的应用。
10.采用上述窖泥养护方法养护的窖泥在白酒发酵中的应用。进一步地，监测影响窖泥质量的理化因素有：ph、含水量、有机质、腐殖酸、有效氮、有效磷、有效钾；动态调控窖泥ph维持在5-7之间，含水量维持在45-55之间，有机质含量维持在大于10％以上，腐殖酸含量维持在大于5.2％0以上，有效氮含量维持在大于200mg/100g干土以上，有效磷含量维持在大于200mg/100g干土以上，有效钾含量维持在400mg/100g干土以上。
11.本发明可以为窖泥补充提供有益功能菌，促进新窖老熟，和改良老化窖泥，扩大窖内优势菌群，使之更适合功能微生物栖息和生长繁殖，形成良好的微生态体系。采用本法生产的浓香型原酒，使四大酯比例协调，发酵力增强。香味更加突出，口感更加醇厚，使得所制备的浓香型白酒的品质得到有效地提高与改善。
12.本发明为窖泥通过筛选获得的功能混合菌液养护窖泥后，结合动态调控ph、含水量等参数，以有机质、腐殖酸、有效氮、有效磷、有效钾等理化指标为窖泥品质评价依据，结合改良后窖泥微生物群落组成结构及相关性分析，和hs—spme与gc—ms联用的方法分析窖池改良前后不同空间位置的窖泥样品中的挥发性组分差异，为窖泥养护和改良技术提供了新方法。
具体实施方式
13.一种用于养护窖泥的混合菌液制备办法，包括以下步骤：将产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉菌液按体积比5:2:1:1:1:2:2:1的比例制成混合菌液。
14.所述的制备方法，产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉菌种的扩大培养及复配路线如下：试管培养
→
250ml三角瓶培养
→
3l发酵罐培养
→
复配20l窖泥养护液
15.所述养护方法包括以下步骤：
16.打扫窖池，除去窖壁及窖底的底糟。在窖壁四周打孔，小孔排列应呈耙齿状，并呈“品”字形排列，孔径为6mm～10mm，孔距70mm～80mm，孔深30mm～50mm。窖壁上的孔径45
°
倾斜。打好孔后把配制的窖泥养护液搅拌均匀，从上往下灌淋，以保证窖池水分、营养始终保持良好的状态，使窖池中的微生物始终保持旺盛的生长、繁殖状态。让每个孔内灌满，待菌液被窖泥吸收后，抹平窖壁。窖底养护操作与窖壁相同。
17.所述的窖泥养护技术在如下至少一种的应用：培养产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉；制备养护窖泥的混合菌液；窖泥的养护；延缓窖泥退化；制备人工窖泥。
18.本发明探索出一套调控窖泥理化因素改良窖泥的方案。
19.根据上述方法养护窖泥后，监测影响窖泥质量的理化因素有：ph、含水量、有机质、腐殖酸、有效氮、有效磷、有效钾；
20.根据上述方法养护窖泥后，在使用窖泥进行白酒发酵时，动态调控窖泥ph维持在5-7之间；
21.根据上述方法养护窖泥后，在使用窖泥进行白酒发酵时，动态调控窖泥含水量维持在45-55之间；
22.根据上述方法养护窖泥后，在使用窖泥进行白酒发酵时，测定窖泥有机质含量维持在大于10％以上；
23.根据上述方法养护窖泥后，在使用窖泥进行白酒发酵时，测定窖泥腐殖酸含量维持在大于5.2％0以上；
24.根据上述方法养护窖泥后，在使用窖泥进行白酒发酵时，测定窖泥有效氮含量维持在大于200mg/100g干土以上；
25.根据上述方法养护窖泥后，在使用窖泥进行白酒发酵时，测定窖泥有效磷含量维持在大于200mg/100g干土以上；
26.根据上述方法养护窖泥后，在使用窖泥进行白酒发酵时，测定窖泥有效钾含量维持在400mg/100g干土以上；
27.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，所用试剂均为市售，由于不涉及发明点,故不对其步骤进行详细描述。
28.其中，凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans cgmcc 9951)，其余菌种均为常规市售菌种。
29.本发明实施实例中：
30.将从上述产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉配成菌液，按体积比为5:2:1:1:1:2:2:1的比例混合，每种菌的浓度控制在10
8-109cfu/ml。
31.所述产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母发酵培养基按照以下条件制备：麸皮5.0-10g/
l,牛肉膏2-5g/l，酒糟3-8g/l，ph 5.5-7.0，接种菌液量为1％，在28℃、转速150r/min的条件下培养36h。所述产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母的浓度为10
8-109cfu/ml。
32.所述甲烷菌培养方法，其特征在于所述液体培养基为：5.4％-7.2％葡萄糖、1.2％-1.4％的乙酸钠、0.02％-0.07％氯化镁、0.01％-0.4％氯化钠、0.05％-0.1％磷酸二氢钾、0.01％-0.06％的氯化铵、1.2％-1.6％硫化钠、0.9％-1.2％甲醇，ph 6.5-7.4，接种菌液量为8.0-10％，在30℃、通入80％氮气+20％二氧化碳的混合气培养30天。所述甲烷菌的浓度为10
8-109cfu/ml。
33.所述丙酸嗜蛋白菌发酵培养基按照以下条件制备：酵母粉10-12g/l，蛋白胨5-8g/l，肉汤5-10g/l，nahco30.4-0.5g/l，nacl 0.08-0.15g/l，k2hpo40.02-0.1g/l，kh2po40.02-0.1g/l，mgso40.02-0.1g/l和cacl20.1-0.3g/l，半胱氨酸溶液0.5-1g/l，氯化血红素溶液0.5-1.0g/l，ph 7.0-8.0，接种菌液量为10-12％，于35-37℃厌氧培养3-4h。所述丙酸嗜蛋白菌浓度为10
7-108cfu/ml。
34.所述己酸菌发酵培养基按照以下条件制备：蛋白胨8.0-10.0g/l，牛肉粉8.0-10.0g/l，酵母粉2.0-3.5g/l，葡萄糖1.0-6.0g/l，可溶性淀粉1.0-2.0g/l，氯化，4.0-6.0g/l，醋酸钠3.0-6.0g/l，半胱氨酸盐酸盐0.5-1.0g/l，抗坏血酸0.2-1.0g/l，琼脂0.5-2，5g/l，ph 6.0-6.5，接种量12-15％，快速放入厌氧培养袋中于32℃培养12天。所述己酸菌的浓度为10
8-109cfu/ml。
35.所述凝结芽孢杆菌发酵培养基按照以下条件制备：葡萄糖7.0-10.0g/l、水溶性淀粉8.0-11.0g/l、酵母浸膏8.0-10.0g/l、棉籽粉6.0-10.0g/l、kcl0.7-0.8g/l、mgso40.5-1.0g/l、0.5-1.5g/l。调初始ph至6.0-7.0，接种菌液量为3％，在37℃、转速180r/min的条件下培养30h。所述凝结芽孢杆菌的浓度为10
8-109cfu/ml。
36.所述米曲霉发酵培养基按照以下条件制备：麸皮1.0-2.0％，蛋白胨1.0-2.0％，尿素0.5-1.0％，硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钠0.1-0.4％，接种量为5-8％，ph为5.0-6.5，转速为150r/min，40℃培养50h。所述米曲霉菌的浓度为10
8-109cfu/ml。
37.所述的制备方法，产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉菌种的扩大培养及复配路线如下：试管培养
→
250ml三角瓶培养
→
3l发酵罐培养
→
复配20l窖泥养护液
38.将制备的混合菌液灌淋于窖池，菌液要搅拌均匀，从上往下灌淋，以保证窖池水分、营养始终保持良好的状态，使窖池中的微生物始终保持旺盛的生长、繁殖状态。在灌淋前先打扫窖池，除去窖壁及窖底的底糟。并在窖壁四周打孔，小孔排列应呈耙齿状，并呈“品”字形排列，孔径为6mm～10mm,孔距70mm～80mm,孔深30mm～50mm。窖壁上的孔径45
°
倾斜。灌淋时让每个孔内灌满混合菌液，待菌液被窖泥吸收后，抹平窖壁。窖底养护操作与窖壁相同。
39.以有机质、腐殖酸、有效氮、有效磷、有效钾等理化指标为窖泥品质评价依据，结果如表1-3所示。窖泥ph值改良后整体上呈弱酸性，窖泥空间位置越低，窖泥ph越趋近于中性。已有研究指出浓香型白酒窖泥整体呈弱酸性条件，而优质窖泥底层微生物群落越发稳定，具有较好的酸缓冲能力，其ph更近于7。通过本发明的功能混合菌液改良的窖泥ph较改良前更接近中性，窖泥质量相对较高。窖泥中的水分是维持窖泥微生态的重要因素之一，窖泥含水量过高会影响窖池强度，导致垮塌；改良后窖泥含水量位于46％-55％之间，较改良前有
一定的降低，有助于维持窖池强度。窖泥有机质和腐殖酸含量关联密切，并且对窖泥品质有显著影响，改良后窖泥有机质含量整体显著高于改良前，并且随着空间位置由上至下的改变，出现了有机质含量递增的规律，分析原因主要是由于功能混合菌液改良大大增加了窖泥微生物量，有利于生产白酒的品质。窖泥有效氮、有效磷、有效钾是指窖泥中能够被微生物吸收利用的氮、磷、钾成分，其含量都对白酒品质有所影响，同一位置窖泥有效钾含量＞有效磷含量＞有效氮含量，改良后有效氮、有效磷、有效钾含量都呈显著升高趋势，这和有机质等营养成分变化趋势一致。由于有效氮、有效磷等成分主要来源于有机物的腐化，所以造成该规律性变化的原因可能来自窖泥有机质的规律性变化。
40.窖泥含水量的测定采用烘干法，将新鲜窖泥置于105℃
±
2℃条件下烘干6h至恒重测得窖泥水分含量。
41.窖泥ph的测定采用ph计法，将新鲜窖泥与去离子水按1:3(w/v)混匀静置，使用ph计测得窖泥ph值。
42.窖泥有机质含量的测定采用重铬酸钾外加热法，使用过量的重铬酸钾-浓硫酸溶液在170℃
–
180℃油浴条件下处理窖泥样品，在反应完全之后使用硫酸亚铁滴定剩余重铬酸钾，得出消耗碳含量，从而测得窖泥有机质含量。
43.窖泥腐殖酸含量的测定采用焦磷酸钠提取重铬酸钾法，用焦磷酸钠碱液浸提腐殖酸，将过滤之后所得滤液通过测定土壤有机质的外加热法处理，从而测得窖泥腐殖酸含量。
44.窖泥有效氮含量的测定采用碱解扩散法，将窖泥置于扩散皿中在碱性条件下水解扩散24h
±
0.5h，其有效氮成分扩散后被硼酸吸收，而后通过标准硫酸溶液滴定硼酸测得窖泥有效氮含量。
45.窖泥有效磷含量的测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法，使用碳酸氢钠溶液浸提有效磷成分，而后进行钼锑抗反应，最终通过分光光度计对照磷标准曲线测得窖泥有效磷含量。
46.窖泥有效钾含量的测定采用原子吸收分光光度法，使用乙酸铵溶液浸提有效钾成分，浸提液通过原子分光光度计进行测定，并对照钾标准曲线测得窖泥有效钾含量。
47.窖泥样品中的挥发性组分采用hs—spme与gc—ms联用方法。
48.表1窖泥改良前后ph、含水量变化。
50.表2窖泥改良前后有机质、腐殖酸、有效氮、有效磷、有效钾含量变化。
51.表3窖泥改良前后挥发性化合物含量变化。
52.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种养护窖泥的混合菌液，其特征在于：所述混合菌液是将产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉菌液按体积比5:2:1:1:1:2:2:1的比例混合制成。2.根据权利要求1所述的混合菌液，其特征在于：所述产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉菌均为培养至对数期的菌液。3.根据权利要求2所述的混合菌液，其特征在于：每种菌的浓度控制在10
8-109cfu/ml。4.根据权利要求1所述的混合菌液，其特征在于：所述产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母，发酵培养基按照以下条件制备：麸皮5.0-10 g/l，牛肉膏2-5 g/l，酒糟3-8 g/l，ph 5.5-7.0；接种菌液量为1%，在28℃、转速150r/min的条件下培养36h；所述甲烷菌培养方法，液体培养基为：5.4%-7.2%葡萄糖、1.2%-1.4%的乙酸钠、0.02%-0.07%氯化镁、0.01%-0.4%氯化钠、0.05%-0.1%磷酸二氢钾、0.01%-0.06%的氯化铵、1.2%-1.6%硫化钠、0.9%-1.2%甲醇，ph 6.5-7.4；接种菌液量为8.0-10%，在30℃、通入80%氮气+20%二氧化碳的混合气培养30天；所述丙酸嗜蛋白菌，发酵培养基按照以下条件制备：酵母粉10-12g/l，蛋白胨5-8g/l，肉汤5-10g/l，nahco
3 0.4-0.5 g/l，nacl 0.08-0.15 g/l，k2hpo
4 0.02-0.1 g/l，kh2po
4 0.02-0.1 g/l，mgso
4 0.02-0.1 g/l和cacl
2 0.1-0.3 g/l，半胱氨酸溶液0.5-1 g/l，氯化血红素溶液0.5-1.0 g/l，ph 7.0-8.0；接种菌液量为10-12%，于35-37℃厌氧培养3-4h；所述己酸菌，发酵培养基按照以下条件制备：蛋白胨8.0-10.0g/l，牛肉粉8.0-10.0g/l，酵母粉2.0-3.5g/l，葡萄糖1.0-6.0g/l，可溶性淀粉1.0-2.0g/l，氯化4.0-6.0g/l，醋酸钠3.0-6.0g/l，半胱氨酸盐酸盐0.5-1.0g/l，抗坏血酸0.2-1.0g/l，琼脂0.5-2,5g/l，ph 6.0-6.5；接种量12-15%，快速放入厌氧培养袋中于32℃培养12天；所述凝结芽孢杆菌，发酵培养基按照以下条件制备：葡萄糖7.0-10.0g/l、水溶性淀粉8.0-11.0g/l、酵母浸膏8.0-10.0g/l、棉籽粉6.0-10.0g/l、kcl 0.7-0.8g/l、mgso
4 0.5-1.0g/l、kh2po
4 0.5-1.5g/l，调初始ph至6.0-7.0；接种菌液量为3%，在37℃、转速180r/min的条件下培养30h；所述米曲霉，发酵培养基按照以下条件制备：麸皮1.0-2.0％,蛋白胨1.0-2.0%，尿素0.5-1.0%，硫酸镁0.1-0.3%，磷酸二氢钠0.1-0.4%；接种量为5-8%，ph为5.0-6.5，转速为150r/min，40℃培养50h。5.一种窖泥养护方法，其特征在于：是采用权利要求1所述的混合菌液灌淋窖池。6.根据权利要求5所述的一种一种窖泥养护方法，其特征在于：在灌淋前先打扫窖池，除去窖壁及窖底的底糟，并在窖壁四周打孔，小孔排列应呈耙齿状，并呈“品”字形排列，孔径为6mm～10mm、孔距70mm～80mm、孔深30mm～50mm；窖壁上的孔径45
°
倾斜；灌淋时让每个孔内灌满混合菌液，待菌液被窖泥吸收后，抹平窖壁；窖底养护操作与窖壁相同。7.权利要求1-4任意一种所述的混合菌液或权利要求5-6任意一种所述的窖泥养护方法在窖泥改良方面的应用。8.采用权利要求5-6所述的窖泥养护方法养护的窖泥在白酒发酵中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：监测影响窖泥质量的理化因素有：ph、含水量、有机质、腐殖酸、有效氮、有效磷、有效钾；动态调控窖泥ph维持在5-7之间，含水量维持
在45-55之间，有机质含量维持在大于10%以上，腐殖酸含量维持在大于5.2%0以上，有效氮含量维持在大于200mg/100g干土以上，有效磷含量维持在大于200mg/100g干土以上，有效钾含量维持在400mg/100g干土以上。

技术总结
本发明涉及用于养护窖泥的混合菌液及其窖泥改良方面的应用，属于酿酒技术领域，所述混合菌液是将产酯酵母、球拟酵母、啤酒酵母、甲烷菌、丙酸嗜蛋白菌、己酸菌、凝结芽孢杆菌和米曲霉等菌液按体积比混合，制成窖泥养护功能性混合菌液。在每完成3-5次发酵后对窖池灌淋养护菌液加以养护，并在发酵过程中控制窖池环境的pH、含水量等理化因素，改良窖泥的优质状态，实现白酒发酵的可持续酿造，并提升白酒发酵的品质。品质。


技术研发人员：邢嘉乐 吴影 韦玉琼 牛雨婷 单帅博 古绍彬 赵丽娜 李璇 铁珊珊 李玉婉
受保护的技术使用者：河南科技大学
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/8/24