一种具有抑菌能力的朱鹮源植物乳杆菌及应用方法

1.本发明属于微生物领域，特别涉及一种具有抑菌能力的朱鹮源植物乳杆菌及应用方法。


背景技术：

2.乳酸菌是能够将碳水化合物发酵产生大量乳酸的一类细菌的总称，是最早被认可且能作为饲料添加剂的优良菌种之一。基于社会公众呼吁和职能管理部门要求，饲料生产企业开始停止生产含有促生长类药物的商品饲料。因此，寻找无抗饲料添加剂或开发高效安全的饲用抗生素替代品成为饲料行业的研究热点。
3.植物乳杆菌是目前应用最广泛的乳酸菌之一，它来源较多，能够通过改变肠道的微生物菌群产生改变肠道屏障功能的蛋白，提高动物的免疫反应与抗病能力来发挥益生作用，促进动物健康生长。植物乳杆菌的作用机理有别于抗生素，在替代饲用抗生素方面有着重要作用与良好前景。在生产动物日粮中的应用方式，主要是通过加入菌体或菌体发酵液，以及制作青贮饲料。
4.植物乳杆菌拥有丰富的生理功能，但是作为饲料添加剂仍然存在许多问题。其原因是，益生菌一般需要到达肠道后的活菌数不低于在106～107cfu/g，才能够发挥益生作用。大多数植物乳杆菌抗逆性差，在遭遇胃肠道中的胃酸与胆盐的刺激环境后，存活率会降低，真正到达肠道的益生菌其实数量并不多。所以寻找具有抗酸、抗胆盐能力的植物乳杆菌显得尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种具有抑菌能力的朱鹮源植物乳杆菌及应用方法。
6.为解决技术问题，本发明的解决方案是：
7.提供一种具有抑菌能力的朱鹮源植物乳杆菌，该植物乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏名称为植物乳杆菌lpzj2101，拉丁名lactobacillus plantarum，保藏编号为cgmcc no.26228。
8.作为本发明的优选方案，所述植物乳杆菌的16s rdna基因序列如seq id no：1所示。
9.本发明进一步提供了前述植物乳杆菌在制备能够抑制肠道病原菌生长的饲料添加剂中的应用方法。
10.作为本发明的优选方案，所述饲料添加剂是发酵液，其制备方法具体包括：
11.将植物乳杆菌lpzj2101的单菌接种至液体培养基中，37℃静置培养10-12h；然后将所得液体培养物以1％(v/v)接种到新鲜液体培养基中，继续37℃静置培养16-18h；取出培养液，在12000r/min离心2min；保留上清菌液，过滤后得到发酵液。
12.本发明还提供了利用前述方法中制备获得的发酵液的应用方法，包括：调节发酵
液的菌落形成单位为1
×
107cfu/ml，然后以1％(v/v)的添加量添加到动物饮水中；或者，调节发酵液的菌落形成单位为2
×
107cfu/ml，然后以2％(v/v)的添加量添加到动物日粮中，直接进行混合饲喂。
13.作为本发明的优选方案，所述饲料添加剂是冻干粉，其制备方法具体包括：
14.(1)将植物乳杆菌lpzj2101的单菌接种至液体培养基中，37℃静置培养10-12h；然后将所得液体培养物以3％(v/v)接种到新鲜液体培养基中，并在此基础上添加8％(v/v)的胡萝卜汁、8％(v/v)的番茄汁和0.75％(v/v)的caco3，继续37℃静置培养24h；
15.(2)取出培养液，在4000r/min离心10min，弃上清，得到菌体；
16.(3)将菌体重悬于等体积的10％(v/v)脱脂乳水溶液中混匀，得到混悬液；取1ml该混悬液，与1ml冻干保护剂一并加入冻干瓶中；在真空下冷冻干燥后，得到冻干粉。
17.本发明还提供了利用前述方法中制备获得的冻干粉的应用方法，是下述的任意一种：
18.(1)将2ml的mrs肉汤培养基注入冻干瓶中与冻干粉混匀，然后按1％(v/v)的添加量接种到新鲜的mrs肉汤培养基中；37℃静置培养16-18h，重新得到菌体发酵液；
19.调节发酵液的菌落形成单位为1
×
107cfu/ml，然后以1％(v/v)的添加量添加到动物饮水中；或者，调节发酵液的菌落形成单位为2
×
107cfu/ml，然后以2％(v/v)的添加量添加到动物日粮中，直接进行混合饲喂；
20.(2)将冻干粉按1％(v/v)的添加量添加到动物日粮中，直接进行混合饲喂。
21.作为本发明的优选方案，所述液体培养基为mrs肉汤培养基，含有：蛋白胨10g/l、牛肉粉8g/l、酵母粉4g/l、葡萄糖20g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸氢二胺2g/l、乙酸钠5g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.04g/l、吐温-80 1g/l。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.1、本发明的植物乳杆菌lpzj2101的原始菌株是由健康朱鹮的新鲜粪便中分离获得，具有一定抗酸、抗胆盐能力与抑菌作用；经纯化处理后的菌体能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等肠道病原菌生长。
24.2、该植物乳杆菌携带细菌素基因plnc8αβ、plnjk和plnef，具有一定的抗酸、抗胆盐与抑菌能力，即便经ph中和仍具有抑菌作用。因此，不仅能够作为常规饲料添加剂用于调节动物胃肠道环境、促进动物健康生长，还能够用作珍稀濒危野生动物的饲料添加剂候选菌株。
25.3、该植物乳杆菌能够制成发酵液或冻干粉，方便保存、运输和使用，适于产业推广。
附图说明
26.图1为植物乳杆菌lpzj2101菌落形态(mc培养基)；
27.图2为植物乳杆菌lpzj2101镜检形态；
28.图3为植物乳杆菌lpzj2101全基因组系统发生树；
29.图4为植物乳杆菌lpzj2101生长曲线；
30.图5为植物乳杆菌lpzj2101抗酸试验结果；
31.图6为植物乳杆菌lpzj2101抗胆盐试验结果；
32.图7为植物乳杆菌lpzj2101细菌素牛津杯试验结果。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例子，对本发明的实现方式进行详细描述。
34.本发明所述的植物乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，该中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏名称为植物乳杆菌为lpzj2101，拉丁文名称lactobacillus plantarum。保藏号为cgmcc no.26228，保藏日期为2022年12月25日。
35.一、菌株的分离、培养及形态观察
36.以无菌工具采集新鲜的朱鹮粪便样本，4℃保存。在实验室中，选取10-3
、10-4
两个梯度，以无菌pbs对样本进行梯度稀释。吸取200μl稀释液，涂布在分离培养基上，37℃培养18-24h后，挑取有明显透明的溶钙圈、菌落边缘整齐、表面光滑湿润、圆形有凸起、呈乳白色的单菌落(图1)到新的分离培养基上，进行进一步的分离纯化。
37.其中，分离培养基为改良mc培养基，含有：大豆蛋白胨5g/l、牛肉浸粉3g/l、酵母浸粉3g/l、葡萄糖20g/l、乳糖20g/l、碳酸钙10g/l、琼脂15g/l、中性红0.05g/l，多粘菌素e 20μl/ml(25℃，ph＝6.0
±
0.1)。
38.在37℃继续培养18-24h，待菌形成后进行革兰染色，初步在显微镜下对菌体颜色与形态进行观察。观察到菌体呈阳性、短粗杆状、单个散在或形成链状、无运动性、无芽孢和鞭毛的菌体(图2)，可初步鉴定为乳杆菌。
39.二、菌株的基因序列测定
40.挑取单菌落至液体培养基中，37℃静置培养8-10h后,使用细菌16s rrna通用引物，进行pcr，取5μl pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察片段结果在1500bp左右。将pcr产物进行16s rrna序列分析，将测得基因序列在ncbi上进行blast比对，确定属种为植物乳杆菌，并进行全基因组系统发生树比对(见图3)，将该菌命名为lpzj2101。
41.本发明所用的液体培养基为mrs肉汤培养基，配制条件：25℃，ph＝5.7
±
0.2。液体培养基中含有：蛋白胨10g/l、牛肉粉8g/l、酵母粉4g/l、葡萄糖20g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸氢二胺2g/l、乙酸钠5g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.04g/l、吐温-80 1g/l。
42.细菌16s rrna通用引物：
43.上游引物的序列如seq id no：2所示：5
’‑
agagtttgatcmtggctcag-3’；
44.下游引物的序列如seq id no：3所示：5
’‑
tacg-gytaccttgttacgactt-3’。
45.三、菌种的生理生化特征试验
46.1、抗酸、抗胆盐试验
47.将植物乳杆菌lpzj2101单菌落从分离培养基中挑出，放入液体培养基中，37℃振荡培养12h后，以1％(v/v)的接种量，分别接种于等量未调整过ph(ph＝5.7)、ph＝3.0、ph＝7.0和胆盐浓度为0％、0.15％、0.30％(含有胆盐的液体培养基ph＝7.0，此ph值下胆盐可溶)的六种液体培养基中，分别于0h、2h、4h、6h进行点板计数，计算存活数量，结果见图5、6。
48.从结果可见，在ph为3.0、7.0和胆盐浓度为0.15％、0.30％的环境下，植物乳杆菌存活数量依旧能够达到106cfu/ml甚至更高。
49.2、mic试验(最小抑菌浓度测定)
50.以camhb肉汤作为mh肉汤培养基，含有：牛肉浸粉3g/l、酸水解酪蛋白17.5g/l、可
溶性淀粉1.5g/l、氯化钙0.05g/l(25℃，ph＝7.3
±
0.1)。
51.将活化后的指示菌(单核细胞增生李斯特菌、atcc 25922、atcc 25923)，接种于mh肉汤培养基中，37℃培养12h，调节d
600
至0.5，备用。
52.将植物乳杆菌lpzj2101单菌落从分离培养基中挑出，放入液体培养基中，37℃静置培养48h后，12000r/min离心2min，保留上清菌液，过滤备用。
53.取96孔板，每孔加入50μl mh肉汤培养基，在第一排a孔内加入50μl菌液，用移液枪吹打混匀后，吸取50μl菌液，加入下一排b孔内，以此类推，即按照a孔为加入全部原液、b孔为加入1/2原液、c孔为加入1/4原液、d孔为加入1/8原液、e孔为加入1/16原液、f孔为加入1/32原液的方式，依次分组混合至第六排f孔，并吸取50μl菌液弃去，以保证每个孔内菌液体积均为50μl；另以g孔为阳性对照(菌液)，h孔为阴性对照(mh肉汤培养基)。
54.将96孔板的每3列分为1组(每组3个重复)，用一组内加入同一种指示菌菌液。将调节好浓度的指示菌菌液，用mh肉汤稀释100倍，振荡混匀，加入相应分组的a-f孔内，每孔加入50μl。
55.结果显示，植物乳杆菌lpzj2101针对各指示菌(单核细胞增生李斯特菌、atcc 25922、atcc 25923)的mic(最小抑菌浓度)为1/2(原液稀释一倍)。
56.3、基因分析
57.通过全基因组测序，使用center for genomic epidemiology网站(center for genomic epidemiology http://www.genomicepidemiology.org/)对植物乳杆菌lpzj2101进行耐药与毒力基因比对，未发现耐药或毒力基因。
58.使用bagel4网站(bagel4 http://bagel4.molgenrug.nl/index.php)对细菌素进行预测，结果显示植物乳杆菌lpzj2101携带plnc8αβ、plnjk、plnef细菌素基因。这些基因赋予了植物乳杆菌lpzj2101一定的抗酸、抗胆盐与抑菌能力，使其即便经ph中和仍具有抑菌作用。
59.植物乳杆菌lpzj2101的16s rdna基因序列如seq id no：1所示。
60.4、细菌素抗菌试验
61.将活化后的指示菌(单核细胞增生李斯特菌、atcc 25922、atcc 25923)，接种于bhi肉汤培养基中，37℃培养12h，调节d
600
至0.5，备用。
62.将植物乳杆菌lpzj2101单菌落从分离培养基中挑出，以1％(v/v)接种量接种于bhi肉汤培养基中，37℃静置培养24h后，10000r/min离心3min，保留上清菌液。按照75％硫酸铵沉淀法进行细菌素粗提，依照51.6g/100ml的标准称取硫酸铵，缓慢加入菌液中并搅拌，直至将硫酸铵全部加入，4℃静置12h。将液体于4℃10000r/min离心20min，弃上清收集沉淀，将沉淀用pbs缓冲液重新溶解，溶解后的液体为粗提得到的细菌素。
63.使用活化后的指示菌与上述得到的细菌素液体进行mic试验与牛津杯抑菌试验。mic试验结果显示，粗提获得的植物乳杆菌lpzj2101细菌素原液针对指示菌(单核细胞增生李斯特菌、atcc 25922、atcc 25923)有抑菌作用，牛津杯抑菌试验显示有明显抑菌环产生(见图7)。
64.四、菌种的应用方法
65.1、发酵液的制作及应用
66.(1)将植物乳杆菌lpzj2101的单菌接种至液体培养基中，37℃静置培养10-12h；然
后将所得液体培养物以1％(v/v)接种到新鲜液体培养基中，继续37℃静置培养16-18h；取出培养液，在12000r/min离心2min；保留上清菌液，过滤后得到发酵液。
67.(2)发酵液的应用方法：
68.调节发酵液的菌落形成单位为1
×
107cfu/ml，然后以1％(v/v)的添加量添加到动物饮水中。或者，调节发酵液的菌落形成单位为2
×
107cfu/ml，然后以2％(v/v)的添加量添加到动物日粮中直接进行混合饲喂。
69.2、冻干粉的制作及应用
70.(1)发酵培养：
71.将植物乳杆菌lpzj2101的单菌接种至液体培养基中，37℃静置培养10-12h；然后将所得液体培养物以3％(v/v)接种到新鲜液体培养基中，并在此基础上添加8％(v/v)的胡萝卜汁、8％(v/v)的番茄汁和0.75％(v/v)的caco3，继续37℃静置培养24h；
72.(2)取出培养液，在4000r/min离心10min，弃上清，得到菌体；
73.(3)冻干粉制备：
74.(3)将菌体重悬于等体积的10％(v/v)脱脂乳水溶液中混匀，得到混悬液；取1ml该混悬液，与1ml冻干保护剂一并加入冻干瓶中；在真空下冷冻干燥后，得到冻干粉。
75.(4)冻干粉的应用方法：
76.①
按配制成发酵液的方法进行使用：
77.将2ml的mrs肉汤培养基注入冻干瓶中与冻干粉混匀，然后按1％(v/v)的添加量接种到新鲜的mrs肉汤培养基中；37℃静置培养16-18h，重新得到菌体发酵液；
78.调节发酵液的菌落形成单位为1
×
107cfu/ml，然后以1％(v/v)的添加量添加到动物饮水中；或者，调节发酵液的菌落形成单位为2
×
107cfu/ml，然后以2％(v/v)的添加量添加到动物日粮中直接进行混合饲喂；
79.②
将冻干粉按1％(v/v)的添加量添加到动物日粮中，直接进行混合饲喂。
80.以上两种应用方法，择一即可。
81.最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种具有抑菌能力的朱鹮源植物乳杆菌，其特征在于，该植物乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏名称为植物乳杆菌lpzj2101，拉丁名lactobacillus plantarum，保藏编号为cgmcc no.26228。2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌的16s rdna基因序列如seq id no：1所示。3.权利要求书1所述植物乳杆菌在制备能够抑制肠道病原菌生长的饲料添加剂中的应用方法。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述饲料添加剂是发酵液，其制备方法具体包括：将植物乳杆菌lpzj2101的单菌接种至液体培养基中，37℃静置培养10-12h；然后将所得液体培养物以1％(v/v)接种到新鲜液体培养基中，继续37℃静置培养16-18h；取出培养液，在12000r/min离心2min；保留上清菌液，过滤后得到发酵液。5.权利要求4所述方法中制备获得的发酵液的应用方法，其特征在于，包括：调节发酵液的菌落形成单位为1
×
107cfu/ml，然后以1％(v/v)的添加量添加到动物饮水中；或者，调节发酵液的菌落形成单位为2
×
107cfu/ml，然后以2％(v/v)的添加量添加到动物日粮中，直接进行混合饲喂。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述饲料添加剂是冻干粉，其制备方法具体包括：(1)将植物乳杆菌lpzj2101的单菌接种至液体培养基中，37℃静置培养10-12h；然后将所得液体培养物以3％(v/v)接种到新鲜液体培养基中，并在此基础上添加8％(v/v)的胡萝卜汁、8％(v/v)的番茄汁和0.75％(v/v)的caco3，继续37℃静置培养24h；(2)取出培养液，在4000r/min离心10min，弃上清，得到菌体；(3)将菌体重悬于等体积的10％(v/v)脱脂乳水溶液中混匀，得到混悬液；取1ml该混悬液，与1ml冻干保护剂一并加入冻干瓶中；在真空下冷冻干燥后，得到冻干粉。7.权利要求6所述方法中制备获得的冻干粉的应用方法，其特征在于，是下述的任意一种：(1)将2ml的mrs肉汤培养基注入冻干瓶中与冻干粉混匀，然后按1％(v/v)的添加量接种到新鲜的mrs肉汤培养基中；37℃静置培养16-18h，重新得到菌体发酵液；调节发酵液的菌落形成单位为1
×
107cfu/ml，然后以1％(v/v)的添加量添加到动物饮水中；或者，调节发酵液的菌落形成单位为2
×
107cfu/ml，然后以2％(v/v)的添加量添加到动物日粮中，直接进行混合饲喂；(2)将冻干粉按1％(v/v)的添加量添加到动物日粮中，直接进行混合饲喂。8.根据权利要求4或6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为mrs肉汤培养基，含有：蛋白胨10g/l、牛肉粉8g/l、酵母粉4g/l、葡萄糖20g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸氢二胺2g/l、乙酸钠5g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.04g/l、吐温-80 1g/l。

技术总结
本发明涉及微生物领域，旨在提供一种具有抑菌能力的朱鹮源植物乳杆菌及应用方法。该植物乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏名称为植物乳杆菌LpZJ2101，拉丁名Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC NO.26228。该植物乳杆菌具有一定抗酸、抗胆盐能力与抑菌作用；经纯化处理后的菌体能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等肠道病原菌生长；能够作为常规饲料添加剂用于调节动物胃肠道环境、促进动物健康生长；能够制成发酵液或冻干粉，方便保存、运输和使用，适于产业推广。适于产业推广。适于产业推广。


技术研发人员：杨永春 季艺 宋厚辉 张辉 刘建勋 白敬华 施伟斌 邱国强 白洪青
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/8/24