含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统

1.本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统。


背景技术：

2.含酸性基团类生物大分子具有广泛的用途。例如，透明质酸又称玻尿酸，最早于2003年被fda批准可用于皮肤除皱治疗，是目前医美行业中广泛使用的美容填充剂，通常以注射方式进入真皮层，发挥保湿润滑及塑型的作用，在微整形领域可作为隆鼻、下巴充盈、丰唇和抗皱等填充剂，或作为保湿水光针的注射产品。未经修饰的天然直链透明质酸易被酶降解，在皮肤、眼部、关节等部位的半衰期约1～21天不等，且易扩散到其它部位，限制了透明质酸在医美行业的应用。利用交联剂和交联技术将透明质酸化学交联成三维网状结构高分子凝胶，可有效减缓其酶解的速率，解决透明质酸在组织内半衰期短、易被降解和扩散的缺点。肝素和硫酸软骨素、海藻酸钠、藻酸双酯钠等类肝素可用于抗血栓、降低血黏度、扩张外周血管，抑制动静脉内血栓的形成，从而有效地改善微循环等功效。
3.但是，这些生物大分子材料的特点使其都无法渗透皮肤和其它上皮组织。因此，透明质酸及其纳米凝胶必须利用皮下注射方式注射到所需部位用于塑形。目前交联透明质酸在体内也只维持半年到一年时间，通常需要每半年或一年再次进行填充维持塑性效果；注射后还有可能出现像动脉栓塞(张磊等，透明质酸酶降解动脉内透明质酸的实验研究，中华整形外科杂志,2017,33(z1):115-121)、纤维化、局部血肿甚至感染、病人的焦虑及异物感等副作用。肝素等含酸性基团生物材料必须通过静脉注射用于溶血栓治疗。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，该透皮递送系统无需皮下注射，通过涂抹或者面覆皮肤后，有效穿过皮肤角质层进入皮下，起到良好的矫正皱纹与褶皱等的医美效果，或透皮递送肝素类用于溶栓等治疗，或用于递送药物。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：一种含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，是在含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶上键合含氧化三级胺基团的聚合物(pno)形成；所述含氧化三级胺基团的聚合物(pno)具有式i-式iii中任意一种结构式：其中，r1和r2均选自c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；
r3和r4均选自氢、卤素、氰基、烷氧基、c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基。
6.其中，取代烷基的取代基可为卤素、羟基、烷氧基、胺基、氰基中的一种或几种；取代芳香基的取代基可为卤素、羟基、烷氧基、胺基、氰基中的一种或几种；取代烷基的烷基指c
1-c6的烷基。
7.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：一种含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，是由含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶与含氧化三级胺基团的聚合物(pno)混合形成复合物；所述含氧化三级胺基团的聚合物(pno)具有式i-式iii中任意一种结构式：其中，r1和r2均选自c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；r3和r4均选自氢、卤素、烷氧基、氰基、c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基。
8.其中，取代烷基的取代基可为卤素、羟基、烷氧基、胺基、氰基中的一种或几种；取代芳香基的取代基可为卤素、羟基、烷氧基、胺基、氰基中的一种或几种；取代烷基的烷基指c
1-c6的烷基。
9.发明人发现，pno的氧负离子能够被含酸基的化合物的酸基质子化，从而可与透明质酸、肝素等或其交联纳米凝胶等含酸性基团分子通过静电相互作用形成复合物。
10.发明人进一步研究发现，pno具有高渗透功能：它与皮肤角质层的磷脂和酸性脂质分子具有较强相互作用，从而富集在角质层细胞的间隙，并通过这些间隙渗透进入表皮层下层或真皮层。将pno与含酸基生物分子的键合物或复合物涂抹到皮肤上后，pno能够起“火车头”的作用吸附在皮肤表层、富集并穿过角质细胞间隙将其递送到真皮层内，实现小分子和分子量高达200万的大分子透明质酸、肝素等、甚至100多纳米的透明质酸纳米凝胶等的透皮给药，从而完全突破了透明质酸等生物材料的现有常规用法—只能皮下注射的应用瓶颈。复合物皮下解离，将透明质酸等生物材料留在真皮层维持塑型。pno键合到透明质酸、肝素等生物材料分子上形成的键合物，在pno的作用下，键合物在透过角质层和真皮层后还可以进入循环系统，实现全身给药。
11.作为优选，所述酸性基团选自羧酸基、磺酸基、硫酸基、磷酸基中的一种或多种。
12.作为优选，所述含酸性基团生物材料包括天然和半天然高分子、合成高分子；天然和半天然高分子包括透明质酸、肝素、类肝素、硫酸软骨素、海藻酸钠、藻酸双酯钠、羧基化多糖、多糖硫酸酯；合成高分子包括聚谷氨酸、聚天冬氨酸及天冬氨酸-谷氨酸共聚物。
13.作为优选，所述含酸性基团生物材料的分子量在200da-2000kda。进一步的，所述透明质酸的分子量在500da-1000kda。
14.作为优选，所述含酸性基团生物材料纳米凝胶是由含酸性基团生物材料中的一种或多种经化学交联或物理交联形成的凝胶。
15.作为优选，含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶上的羧基、羟基、胺基通过化学键键合含氧化三级胺基团的聚合物，所述的化学键包括酰胺键、酯键、醚键、脲基、硫脲基、胺基甲酸酯基。
16.作为优选，含氧化三级胺基团的聚合物的氧化三级胺基团为饱和或不饱和三级胺的氧化物，所述三级胺选自n,n-二甲基胺基,n,n-二乙基胺基,n,n-二丙基胺基,n,n-甲基乙基胺基,n-吡咯烷基，n-哌啶基，n-吗啉基及吡啶基中的一种。
17.作为优选，所述含氧化三级胺基团的聚合物为聚(甲基)丙烯酸酯类、聚(甲基)丙烯酸酰胺类、聚氨基酸类、聚酯类或聚乙烯亚胺类。pno可通过聚合物领域常用的制备方法先制备含三级胺基团的聚合物，然后用过氧化氢或过氧化乙酸等氧化剂将三级胺氧化为n-氧化物；或先制备含氧化三级胺的单体，再通过常规聚合方法聚合制备聚合物。
18.作为优选，所述含氧化三级胺基团的聚合物为均聚物或共聚物；聚合物结构为线性或支化型。
19.作为优选，所述含氧化三级胺基团的聚合物的分子量为300da-50kda。
20.作为优选，含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶与含氧化三级胺基团的聚合物的质量比在1:10
ꢀ‑
10:1。
21.含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统作为制备应用于医美产品的皮肤渗透型材料的用途。
22.含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统作为制备应用于皮肤护理、修复和药物递送的皮肤渗透型医用辅料的用途。
23.本发明的有益效果是：本发明能够高效渗透穿过皮肤和其它上皮组织进入皮下组织，无需皮下注射即可实现透皮给药，实现简单方便的无损性透皮递送，从而达到良好和持久的医美效果和递药效果。
附图说明
24.图1为实施例1.1-1.16中端基功能化pno的制备及代表性结构：opdma-nh2的合成及由其制备opdma-nhs、opdma-ma和opdma-sh的路线；利用不含保护胺基的引发剂聚合可制备端基没有功能化的常规opdma；图2是实施例1.21中odma与2-(boc胺基)乙基甲基丙烯酸酯无规共聚制备侧链含胺基或马来酰亚胺基的opdma；图3是实施例1.25-1.28中制备的代表性含三级胺氧化物的聚氨基酸(e，酯；a，酰胺)；图4是实施例1.29中表面氧化三级胺基团功能化的树枝状大分子举例；图5是pno修饰透明质酸及其纳米凝胶的路径；图6是实施例2.5中制备的纳米凝胶光散射测的粒径分布和电镜图(a,b)；实施例2.7中制备的opdma(分子量5000da)修饰的纳米凝胶的光散射测粒径分布和电镜图(c,d)；图7是透明质酸与opdma复合物在不同ph下的稳定性；在ph2-4酸性条件下形成复
合物，在较高ph下解离；图8是实施例4.1中透明质酸纳米凝胶和opdma-键合的透明质酸纳米凝胶涂抹皮肤4小时后，皮肤切片的激光共聚焦显微图：(a)cy5标记的实施例2.5中制备的纳米凝胶处理皮肤4小时后的切片；(b)cy5标记的实施例2.8中制备的opdma(分子量5000da)键合的纳米凝胶处理皮肤4小时后的切片。左，明场成像；中，cy5荧光通道成像；右，前两者叠加图；可以看到，键合物可以快速渗透到达皮下组织，而透明质酸本身没有能力渗透皮肤；图9是实施例4.1中cy5标记的透明质酸(a:分子量5000da)或cy5标记的透明质酸与opdma的复合物(实施例3.1(b)，3.3(c)，3.4(d))或与其他聚合物的复合物(实施例3.16(e)，3.17(f))，涂抹皮肤4小时后，皮肤切片的激光共聚焦显微图片；左，明场成像；中，cy5荧光通道成像；右，前两者叠加图。可以看到cy5标记的透明质酸钠本身无法渗透进入皮肤，而与opdma或其它pno形成的复合物后，大量的cy5标记的透明质酸钠进入了真皮层；图10是透明质酸/opdma(5:1；透明质酸浓度为0.5mg/ml)涂于小鼠皮肤后，不同时间测得的小鼠皮肤内透明质酸含量的增加值；图11是每日将200微升的透明质酸/opdma复合纳米凝胶悬液(透明质酸浓度为0.5mg/ml)涂抹小黑鼠背部皮肤两次，拍照记录的每天皮肤变化情况；图12是犀牛皮鼠涂抹透明质酸/opdma复合纳米凝胶悬液(透明质酸浓度为0.5mg/ml)后皮肤情况和皮肤形貌分析。每日取400微升的透明质酸水溶液或复合纳米凝胶悬液(透明质酸浓度为0.5mg/ml)，用生物敷贴固定湿敷小鼠背部粗糙皮肤过夜(10h)，记录湿敷处皮肤变化情况；图13是负载米诺地尔的透明质酸/opdma复合纳米凝胶透皮递送米诺地尔。以透明质酸:opdea:米诺地尔的5：1：2质量比构建复合纳米凝胶。用其湿敷小鼠背部皮肤4小时后，提取皮肤组织并分离真皮层。组织匀浆后用hplc分析米诺地尔的含量。可以看到真皮层中含有米诺地尔；而涂覆米诺地尔溶液的皮肤真皮层中不含米诺地尔；图14是opdma与cy5-标记的肝素或硫酸软骨素形成的复合物纳米凝胶，涂于小鼠皮肤2小时后的明场成像(左)、荧光显微成像(中)及其叠加图(右)。肝素或硫酸软骨素在皮肤下层大量富集；图15是pno与含酸性基团大分子形成复合物的机理；图16是透明质酸
cy5
/opdea涂于小鼠皮肤表面2小时后的荧光显微成像和明场成像的叠加图，透明质酸
cy5
/opdea在角质层细胞间隙大量富集。
具体实施方式
25.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
26.本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。特别说明的是，本实施例中说明了含功能化基团的pno的制备应用于键合物的合成或标记pno用于实验。制备复合物时pno上不需要含有这些功能基团，其制备方法除了用不含功能基团的引发剂和没有脱保护步骤外，其它制备步骤都一样。
27.一、含氧化三级胺基团的聚合物的制备(图1)1.含有反应性基团的含氧化三级胺基团的聚合物的制备
实施例1.1以端基为伯胺的聚[2-(n-氧化-n,n-二甲基胺基)乙基甲基丙烯酸酯](opdma-nh2)为例进行说明：端基含保护胺基的聚甲基丙烯酸-2-(n,n-二甲基胺基)乙酯(pdma-n-boc)的制备：称取125毫克的raft链转移剂[2-(n-叔丁氧羰基胺基)]乙基-2
′‑
(丁基三硫代碳酸酯基)-2
′‑
甲基丙烯酸酯，4.1毫克的偶氮二异丁腈(aibn)，以及2.35克甲基丙烯酸-2-(n,n-二甲基胺基)乙酯(dma)于100毫升的圆底烧瓶中，加入20毫升无水的四氢呋喃溶液。在65℃下反应12小时后终止反应，浓缩后用冰正己烷沉淀。收集得到的沉淀，真空干燥得到pdma-n-boc。用凝胶色谱(gpc)测得聚合物的分子量为5100da。用类似条件，用不同单体进行聚合反应，可制备分子量从1000到50000da的聚合物。具体见下表实施例1.2-1.7。
[0028]
取1克上述得到的聚合物pdma-n-boc于25毫升烧瓶中，加入10毫升的30％的双氧水，室温搅拌3个小时后透析，冻干透析液即得到pdma-n-boc的胺基氧化后的聚合物opdma-n-boc。
[0029]
上述得到的opdma-n-boc，溶入5毫升的二氯甲烷/5毫升三氟乙酸。在室温下反应两个小时，用乙醚沉淀，得到端基为氨基活性基团的聚合物opdma-nh2。
[0030]
2.利用opdma-nh2制备其它反应活性端基的opdma实施例1.8.称取1克opdma-nh2溶解于1毫升ph 7.4的pbs中，加入100毫克bmps(n-β-马来酰亚胺基丙酰n-琥珀酰亚胺基酯，n-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester)和三乙胺的dmso溶液，并在室温下搅拌反应2小时。然后用超滤管纯化反应混合物，即得端基为马来酰亚胺的opdma聚合物，opdma-ma。
[0031]
类似地，opdma-nh2与含有巯基、异硫氰酸酯、环氧基、二乙烯基砜、活化酯基等的分子反应可制备端基为异硫氰酸酯、巯基、环氧基、乙烯基砜或活化酯基的opdma。具体见下表实施例1.9-1.13。实施例反应分子举例聚合物端基聚合物实施例1.9对苯二异硫氰酸酯异硫氰酸酯opdma-itc实施例1.102-亚胺基硫烷盐酸盐巯基opdma-sh实施例1.11环氧氯丙烷或bdde环氧基opdma-ep实施例1.12二乙烯基砜dvs乙烯基砜opdma-vs实施例1.13丁二酰二-(n-琥珀酰亚胺基酯)nhs活化酯opdma-nhs
[0032]
3.其它含氧化三级胺基团的聚合物的制备：用上述一样的步骤可制备氧化三级胺上含有其它取代基的聚合物：具体见下表实施例1.14-1.16，包括聚[2-(n-氧化-n,n-二甲基胺基)乙基甲基丙烯酰胺](opdmaa)、聚[4-乙烯基(n-氧化)吡啶](opvp)、聚[2-(n-氧化-n-吡咯烷基)乙基甲基丙烯酸酯](oppya)等。
[0033]
利用实施例1.1的引发剂体系直接聚合含氧化三级胺的单体，随后进行脱保护，可直接制备端基为胺基的其它氧化三级胺的聚合物，具体见下表实施例1.17-1.19。
实施例含氧化三级胺单体聚合物实施例1.172-(n-氧化-n,n-二乙基胺基)乙基甲基丙烯酸酯opdea-nh2实施例1.184-乙烯基-n-氧化吡啶opvp-nh2实施例1.191-乙烯基-1h-3-氧化咪唑聚[1-乙烯基-1h-3-氧化咪唑](opvi-nh2)
[0034]
实施例1.20.按实施例1.1的引发剂和条件引发dma(20毫摩尔)和2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)(hema，10毫摩尔)进行聚合，可制备相应dma和hema的无规高聚物,聚[dma-co-hema]。gpc测定的分子量为5500da。将该聚合物按实施例1中的条件和方法的进行氧化并随后脱保护，制备得到端基为胺基的含氧化三级胺的共聚物，聚[odma-co-hema]-nh2。
[0035]
实施例1.21.侧链含反应基团的聚合物的制备(图2)以opdma聚合物为例：odma(2.5克)，2-(boc胺基)乙基甲基丙烯酸酯(142毫克)，溴化亚铜(17.66毫克)，n,n,n
′
,n
″
,n
″
五甲基二乙烯三胺(21.52毫克)及2-溴-2-甲基丙酸乙酯(24.26毫克)(摩尔比100:5:1:1:1)溶于甲醇4毫升，30℃反应3小时，后用去离子水透析至透析液中不含铜离子，冻干得到分子量为12.5kda的共聚物。
[0036]
将上述聚合物溶于30ml氯仿/15ml三氟乙酸混合溶液，搅拌反应4小时后旋蒸除去三氟乙酸和溶剂，再用丙酮洗涤3次，真空干燥后得到侧链含5％(摩尔)nh2的opdea(opdma/5％nh2)。
[0037]
将opdma/5％nh2溶于入少量dmf，加入200微升三乙胺和50毫克bmps，搅拌反应过夜，用dmf：水＝1：1的溶液以及去离子水透析、冷冻干燥，制备得到侧链含5％(摩尔)马来酰亚胺基的opdma(opdma/5％ma)。
[0038]
通过控制2-(boc胺基)乙基甲基丙烯酸酯(x)的量，可调控nh2或ma在侧链中的含量。
[0039]
按文献方法(athanasiou v等，synthesis and characterization of the novel n
ε-9-fluorenylmethoxycarbonyl-l-lysine n-carboxy anhydride：synthesis of well-defined linear and branched polypeptides.polymers(basel).2020，12:2819)，利用含保护胺基的引发剂引发氨基酸的n-羧基环内酸酐(nca)开环聚合,脱去它们的侧链羧基或胺基保护基团，即得到它们相应的端基功能化的聚氨基酸，具体见下表实施例1.21-24。
[0040]
实施例1.25.聚谷氨酸与2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙醇(或胺)在缩合剂(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)的催化下的酯化或酰胺化反应,即得到侧链含氧
化三级胺的聚[谷氨酸2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙基酯(opgae)或酰胺(opgaa)。
[0041]
实施例1.26.聚天冬氨酸与2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙醇(或胺)在缩合剂的催化下的酯化或酰胺化反应,即得到含氧化三级胺的聚[天冬氨酸2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙基酯(或酰胺)](opaa)。
[0042]
实施例1.27.聚赖氨酸与过量的1,1
′‑
羰基二咪唑(1:5)反应过夜，除去未反应的1,1
′‑
羰基二咪唑和副产物后，再加入2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙醇(或胺)反应(1:3)反应48小时，纯化后得到侧基含氧化三级胺类的聚{n
ε-[2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙氧羰基赖氨酸}或聚{nε-[2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙胺羰基赖氨酸}(opll)。
[0043]
实施例1.28.利用实施例27的类似条件，聚丝氨酸与1,1
′‑
羰基二咪唑反应后再与2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙醇(或胺)反应，可制备相应的侧基含氧化三级胺类的聚{o-[2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙氧羰基丝氨酸}或聚{o-[2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙胺羰基丝氨酸}(ops)。
[0044]
图3是实施例1.25-1.28中制备的代表性含三级胺氧化物的聚氨基酸。用实施例1.9-1.13的反应可将巯基、马来酰亚胺基、异硫氰酸酯基、nhs活化酯基反应基团引入到聚合物端基或侧链。
[0045]
实施例1.29.表面氧化三级胺功能化的树枝状大分子(图4)。类似地，利用实施例1.25的实验条件，将谷氨酸的树枝状大分子与2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙醇(或胺)在缩合剂的催化下的酯化或酰胺化反应,即得到表面含2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙基酯或酰胺的聚谷氨酸树枝状大分子(odga)。利用实施例1.26的反应条件，聚天冬氨酸树枝状大分子与2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙醇(或胺)在缩合剂的催化下的酯化或酰胺化反应,即得到表面含2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙基酯(或酰胺)]的聚天冬氨酸树枝状大分子(odaa)。利用实施例1.27的反应条件，聚赖氨酸树枝状大分子与过量的1,1
′‑
羰基二咪唑(1:5)反应过夜，除去未反应的1,1
′‑
羰基二咪唑和副产物后，再加入2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙醇(或胺)反应(1:3)反应48小时，纯化后得到表面含2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙氧羰基或2-(n-氧化-n,n-二甲基)乙胺羰基的聚赖氨酸树枝状大分子(odll)。
[0046]
二、pno键合到含酸基团生物材料上制备键合物：以透明质酸为例(图5)实施例2.1水溶液中羧基活化法制备opdma修饰透明质酸：透明质酸1克，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)10毫克、n-羟基丁二酰亚胺(nhs-oh)10毫克，以及opdma-nh2(分子量5000da)132毫克溶于50毫升去离子水中，室温搅拌16小时后，体系升温至50℃反应1小时。降温至室温，乙醚洗涤并进一步纯化，加入弱酸性阳离子交换树脂调节ph至7.0，透析后冻干得到羧基上接有opdma(修饰比例约为1％透明质酸单元)的透明质酸，opdma-ha。
[0047]
实施例2.2有机溶剂中羧基活化法制备opdma修饰的透明质酸：将3.79克透明质酸、n,n'-二环己基碳二亚胺25毫克、nhs-oh 15毫克，以及15毫克4-二甲氨基吡啶(dmap)溶于50毫升无水二甲基亚砜(dmso)中，室温下反应24小时；之后加入600mg opdma-nh2充分搅拌并置于室温下反应24小时，透析纯化后冻干，即得到opdma修饰比例约为1％(透明质酸单元)的透明质酸，opdma-ha。
[0048]
实施例2.3有机溶剂中丁二醇二缩水甘油醚(bdde)法制备opdma修饰的透明质酸：opdma-nh2(100毫克)溶于5毫升乙醇中，加入10毫克bdde并搅拌5小时，用丙酮多次沉淀洗
涤。将其加入到溶有3.79克透明质酸、200毫克碳酸锂的50毫升dmso的溶溶中，反应24小时后透析、冻干得到以醚键为连接键、opdma修饰比例为0.2％透明质酸单元的opdma-ha。
[0049]
实施例2.4二乙烯基砜(dvs)法制备opdma修饰的透明质酸：opdma-sh(100毫克)溶于5毫升乙醇中，加入10毫克dvs并搅拌1小时，用丙酮多次沉淀洗涤后溶于5毫升去离子水中，将该溶液加入到溶有3.79克透明质酸的50毫升0.2m naoh溶液中，反应1小时后透析、冻干得到以dvs形成硫醚及醚键为连接键、opdma修饰比例为0.2％透明质酸单元的opdma-ha。
[0050]
实施例2.5bdde交联透明质酸凝胶的制备：透明质酸1克溶于浓度为0.2m的氢氧化钠溶液25ml，加入bdde100毫克，室温搅拌16小时后，体系升温至50℃反应1小时。降温至室温，乙醚洗涤并纯化，加入弱酸性阳离子交换树脂调节ph至7.0，制备得到bdde交联的凝胶。图6表明形成的凝胶在微米级别。
[0051]
实施例2.6dvs交联透明质酸凝胶的制备：透明质酸1克溶于浓度为0.2m的氢氧化钠溶液25毫升，加入dvs 25毫克，室温搅拌1小时后，加入弱酸性阳离子交换树脂调节ph至7.0，制备得到dvs交联的凝胶。
[0052]
实施例2.7opdma修饰的交联透明质酸纳米凝胶(方法1)：实施例2.5中的交联透明质酸加入opdma-nh2(质量比5：1)，升温至50℃搅拌3小时，opdma-nh2与交联透明质酸上未反应的环氧基团反应得到opdma修饰的透明质酸纳米凝胶。图6表明，与未修饰的原交联透明质酸不同，修饰后的纳米凝胶粒径比较均一，且粒径从微米级变为150纳米左右，表明opdma的胺基能够有效地与交联透明质酸上残留的环氧基团反应，有效地分散了纳米凝胶。
[0053]
实施例2.8opdma修饰的交联透明质酸纳米凝胶(方法2)：实施例2.6中的交联透明质酸加入opdma-nh2(或opdma-sh，质量比5：1)，搅拌3小时，opdma-nh2(或sh)与纳米凝胶上未反应的乙烯基砜反应得到opdma修饰的透明质酸纳米凝胶。
[0054]
实施例2.9opdma修饰的交联透明质酸纳米凝胶(方法3)：opdma-nh
2 100毫克溶于5毫升甲醇中，加入10毫克bdde并搅拌5小时或dvs 10毫克搅拌1小时，用丙酮沉淀洗涤多次，得到端基含有环氧或乙烯亚砜的opdma。将其加入含透明质酸1克的0.2m的氢氧化钠溶液中，搅拌1小时后加入bdde或dvs 25毫克，再室温搅拌1小时后，加入弱酸性阳离子交换树脂调节ph至7.0，得到opdma修饰的透明质酸纳米凝胶。
[0055]
表一、不同条件下制备的透明质酸纳米凝胶
[0056]
实施例2.10：荧光标记透明质酸或透明质酸纳米凝胶向交联透明质酸或其纳米凝胶中加入edc，nhs-oh，室温搅拌8小时，加入含有一个胺基的cy5荧光染料(cy5-nh2)(质量比1％)，避光室温搅拌24h。反复加水稀释并超滤离心等除去未反应的edc，nhs-oh，和cy5，直至滤出液无色为止。
[0057]
三、pno与含酸基生物材料制备复合物的制备实施例3.1opdma与透明质酸或透明质酸纳米凝胶复合物的制备：分别配备1mg/ml的opdma水溶液和不同分子量的透明质酸水溶液，按照opdma与透明质酸的质量比进行混合即可制得其复合物。复合物的粒径有nanozs粒度仪测定。
[0058]
表二、pno与透明质酸等含酸基生物大分子形成的复合物
实施例pno、分子量(da)含酸基大分子及其分子量(da)质量比复合物粒径(纳米)3.1opdma、0.5万透明质酸、0.5万1:101713.2opdma、0.5万透明质酸、0.5万1:51583.3opdma、0.5万透明质酸、20万1:52083.4opdma、0.5万透明质酸、200万1:5约1000，不均一3.5opdma、0.1万透明质酸、20万1:51843.6opdma、2.5万透明质酸、20万1:51623.7opdma、0.5万透明质酸、20万3:11783.8opdma、0.5万透明质酸、20万10:1不均一3.9opdma、0.5万肝素、0.5万1:4863.10opdma、0.5万肝素、1.5万1:41253.11opdma、0.5万海藻酸钠、约5万1:51563.12opdma、0.5万硫酸软骨素、约10万1:51833.13opdma、0.5万聚γ-谷氨酸(pga)、5万1:5401
3.14oppya、0.5万透明质酸、20万1:51453.15opvp、0.5万透明质酸、20万1:51383.16opga、1.5万透明质酸、20万1:51443.17odga(第5代)透明质酸、20万1:51673.18odll(第5代)透明质酸、20万1:51553.19opdma、0.5万透明质酸纳米凝胶1:3155
。
[0059]
实施例3.2opdma/透明质酸复合物的ph-稳定性评估配备1mg/ml的opdea/透明质酸(1:5)复合物水溶液，精确调节其ph值在1.45-5.4范围内，分别测定各ph值下溶液在600纳米的光吸收(od
600
)，以此评估opdma/透明质酸复合物的ph-稳定性。图7所示，opdma/透明质酸在酸性ph2-4下形成，而在ph4以上或ph2以下时解离。
[0060]
四、pno与含酸基生物材料的键合物和复合物的透皮能力评估荧光标记交联透明质酸纳米凝胶的透皮评估选用balb/c小鼠进行脱毛处理，对小鼠脱毛区域涂抹pno的键合物或复合物溶液，4小时后处死小鼠，取皮肤组织用4％多聚甲醛进行固定，然后进行冰冻切片，用激光共聚焦显微镜对皮肤切片进行荧光分析。
[0061]
图8发现，不管多大分子量的透明质酸、透明质酸凝胶，都无法透过皮肤，只能停留在表皮层。但是，opdma键合修饰的低分子量透明质酸、分子量200万da的透明质酸甚至纳米凝胶，能够渗透过皮肤到达真皮层。同样，其它含氮氧聚合物修饰的透明质酸和纳米凝胶也能有效渗透皮肤。
[0062]
图9所示，分子量0.5-200万da的透明质酸或其纳米凝胶颗粒，与opdma及其他pno型聚合物形成的复合物，涂抹在皮肤上后也能够高效渗透过皮肤角质层进入真皮组织。
[0063]
涂于皮肤后，皮肤内的透明质酸含量随时间延长而逐渐增加，8小时可将皮肤内的透明质酸含量增加60％(图10)。每日将200微升的复合物悬液(透明质酸浓度为0.5mg/ml)涂抹小鼠背部皮肤两次，可以看到皮肤逐渐变为饱满(图11)。进一步用皮肤天然皱褶的犀牛皮鼠模型进行试验，每日将400微升的透明质酸水溶液或其与opdma复合的(5：1)纳米凝胶悬液(透明质酸浓度为0.5mg/ml)，湿敷小鼠背部粗糙皮肤过夜(10h)，记录湿敷处皮肤变化情况，用imagej测定皮肤粗糙度，可以发现，涂抹opdma复合的(5：1)纳米凝胶悬液可显著降低皮肤的粗糙度(图12)。
[0064]
透明质酸与pno形成的复合物，可进一步携带药物，将药物透皮递送至皮下。以递送米诺地尔为例，用透明质酸/opdea/米诺地尔的质量比为5:1:2制备含药复合纳米凝胶。于小鼠背部湿敷4小时后，取皮肤组织并分离真皮层，匀浆后用通过hplc分析米诺地尔含量。可以看到，真皮层中含有米诺地尔(图13)。而直接涂覆米诺地尔溶液的皮肤真皮中没有发现米诺地尔，表面透明质酸/opdea复合物可以携带米诺地尔渗透皮肤，进行药物递送。
[0065]
其它含酸性基团大分子或合成的聚合物如肝素、硫酸软骨素、聚(γ-谷氨酸)等也与pno形成纳米颗粒，涂于皮肤上后也能快速透过角质层进入真皮，如图14所示。
[0066]
若将皮肤先用ph3左右的水溶液处理，可进一步促进复合物的透皮能力。
[0067]
五、pno介导含酸基生物材料的透皮机理
pno的≡n
+
—o-基团含被酸性基团的大分子质子化为≡n
+
—oh，因此能够与去质子化的带负电荷的酸根产生静电相互作用而形成复合物(图15)。升高ph，pno变为电中性，复合物解离(图7)。因皮肤表面呈弱酸性，平均ph值约5.8，而皮肤角质层含有大量的角质，即一种含16至18个碳的羟基脂肪酸。因而pno以图15所示机理在角质上富集，并携带与其复合的含酸基大分子在角质上富集(图16)。富集在角质上的复合物穿过角质层间隙而向皮下渗透。到达表皮下层或真皮层后，ph接近生理中性值，复合物散开而将透明质酸等大分子留在表皮下层或真皮层，而pno进一步进入血液而排出体外。但pno-生物大分子的键合物，因pno的作用可进入血液而进入体循环。
[0068]
六、聚合物修饰透明质酸及其纳米凝胶对酶稳定性的评估取透明质酸及其聚合物修饰的透明质酸或复合物0.5克，加0.5u/毫升的透明质酸酶，37℃保温降解24小时，取0.2毫升加无水乙醇4.8毫升，高速离心后取上层清液1毫升溶液用pbs稀释至5毫升，作为甲液。另取透明质酸凝胶0.5克于0.5摩尔/升的硫酸溶液10毫升，沸水浴水解15分钟，冷却后定容至100毫升，作为乙液。用改良的咔唑法测定两溶液中糖醛酸的质量浓度，降解率＝甲液糖醛酸的质量浓度/乙液糖醛酸的质量浓度。实验发现，该条件下24小时内透明质酸有60％被降解，opdma修饰的透明质酸和其形成的纳米复合物的降解只有20％作用，并随聚合物链的增加而进一步变慢，表明聚合物修饰或复合的确能使透明质酸抵御酶解。
[0069]
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

技术特征：
1.一种含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，是在含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶上键合含氧化三级胺基团的聚合物形成；所述含氧化三级胺基团的聚合物具有式i-式iii中任意一种结构式：其中，r1和r2均选自c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；r3和r4均选自氢、卤素、氰基、烷氧基、c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基。2.一种含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，是由含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶与含氧化三级胺基团的聚合物混合形成复合物；所述含氧化三级胺基团的聚合物具有式i-式iii中任意一种结构式：其中，r1和r2均选自c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；r3和r4均选自氢、卤素、烷氧基、氰基、c
1-c6的烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基。3.根据权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述酸性基团选自羧酸基、磺酸基、硫酸基、磷酸基中的一种或多种。4.根据权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述含酸性基团生物材料包括天然和半天然高分子、合成高分子；天然和半天然高分子包括透明质酸、肝素、类肝素、硫酸软骨素、海藻酸钠、藻酸双酯钠、羧基化多糖、多糖硫酸酯；合成高分子包括聚谷氨酸、聚天冬氨酸及天冬氨酸-谷氨酸共聚物。5.根据权利要求4所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述含酸性基团生物材料的分子量在200da-2000kda。6.根据权利要求4所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述透明质酸的分子量在500da-1000kda。7.根据权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述含酸性基团生物材料纳米凝胶是由含酸性基团生物材料中的一种或多种经化学交联
或物理交联形成的凝胶。8.根据权利要求1所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶上的羧基、羟基、胺基通过化学键键合含氧化三级胺基团的聚合物，所述的化学键包括酰胺键、酯键、醚键、脲基、硫脲基、胺基甲酸酯基。9.根据权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，含氧化三级胺基团的聚合物的氧化三级胺基团为饱和或不饱和三级胺的氧化物，所述三级胺选自n,n-二甲基胺基,n,n-二乙基胺基,n,n-二丙基胺基,n,n-甲基乙基胺基,n-吡咯烷基，n-哌啶基，n-吗啉基及吡啶基中的一种。10.根据权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述含氧化三级胺基团的聚合物为聚(甲基)丙烯酸酯类、聚(甲基)丙烯酸酰胺类、聚氨基酸类、聚酯类或聚乙烯亚胺类。11.根据权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述含氧化三级胺基团的聚合物为均聚物或共聚物；聚合物结构为线性或支化型。12.根据权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，所述含氧化三级胺基团的聚合物的分子量为300da-50kda。13.根据权利要求2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，其特征在于，含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶与含氧化三级胺基团的聚合物的质量比在1:10-10:1。14.如权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统作为制备应用于医美产品的皮肤渗透型材料的用途。15.如权利要求1或2所述的含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统作为制备应用于皮肤护理、修复和药物递送的皮肤渗透型医用辅料的用途。

技术总结
本发明公开了一种含酸性基团生物材料的高效透皮递送系统，是在含酸性基团生物材料或含酸性基团生物材料纳米凝胶上键合或者物理复合含氧化三级胺基团的聚合物形成。本发明无需皮下注射，通过涂抹或者面覆皮肤后，有效穿过皮肤角质层进入皮下，起到良好的矫正皱纹与褶皱等的医美效果；或透皮递送肝素类用于溶栓治疗或递送药物等作用。治疗或递送药物等作用。治疗或递送药物等作用。


技术研发人员：申有青 孙瑞 冯伟伟
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.01.17
技术公布日：2023/8/24