包含编码外来抗原的遗传物质的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物或药盒的制作方法

1.本技术要求基于2020年10月23日提交的韩国专利申请no.10-2020-0138615的优先权，并且相应申请的说明书和附图中公开的全部内容并入本技术。本发明涉及用于减小靶组织的尺寸或体积的药物组合物，其包含编码外来抗原的遗传物质以诱导免疫应答，并且特别地，涉及用于预防和/或治疗肥胖的治疗的疫苗组合物。更特别地，本发明涉及用于通过抗原基因的免疫治疗来诱导构成靶部位的细胞死亡的组合物。


背景技术：

2.肥胖是指“体内积聚过量体脂的病症”，而不是简单的超重，并且被认为是提高多种慢性疾病例如代谢疾病，包括糖尿病、心血管疾病、癌症等的发生率的风险因素。定义为脂肪过度积聚的肥胖伴随有脂肪组织的代谢、内分泌和免疫功能的丧失，并且这种脂肪组织的病理学重塑作为主要代谢疾病的病理生理学因素正引起关注。
3.作为用于治疗肥胖的药物治疗，使用了脂肪分解酶抑制剂“奥利司他”，其发挥将体内一些脂肪排出体外的作用，并且副作用包括腹泻和脂肪泻等。另外，在用于治疗肥胖的药物的情况下，它们不仅具有许多副作用，而且还可分解女性身体中不期望部位的脂肪。目前，没有可安全使用的食欲抑制剂，并且在患有并发症的严重肥胖患者的情况下，胃肠道减重术可以是有帮助的。


技术实现要素：

4.技术问题
5.为了解决上述问题，本发明提供了新的方法或药物组合物，其可通过施用到靶组织中来减小靶组织的尺寸或体积。更特别地，所述方法或药物组合物可局部施用于期望部位并杀伤肥大细胞。另一个实施方案是提供新的肥胖治疗剂或用于治疗的疫苗。疫苗组合物可在至少一种初级疫苗施加于对象之后施加。
6.本发明待解决的一个问题是提供新型肥胖治疗剂或用于治疗的疫苗，其可解决局部肥胖并完成平滑的身体线条。
7.本发明待解决的一个问题是提供新的用于减少脂肪细胞的组合物，其在免疫系统攻击表达抗原蛋白的脂肪细胞时杀伤脂肪细胞以帮助脂肪细胞死亡，但不影响不期望部位的脂肪细胞。
8.技术方案
9.本发明的一个实施方案提供了用于减小组织的尺寸或体积的药物组合物(优选地，疫苗组合物)的新概念，其中将编码来源于人体外部的抗原的遗传物质施用到靶组织中，并且当抗原基因通过所施用的遗传物质在构成靶组织的细胞中表达时，针对其，预先存在的免疫力(pre-existing immunity)发挥作用并杀伤相应的细胞，并且更特别地，本发明的一个实施方案提供了用于预防或治疗肥胖的疫苗或者用于除去皮下脂肪细胞的组合物。
10.本发明的一个实施方案提供了用于减小组织的尺寸或体积的方法的新概念，将编码来源于人体外部的抗原的遗传物质施用到靶组织中，并且当抗原基因通过所施用的遗传物质在构成靶组织的细胞中表达时，针对其，预先存在的免疫力发挥作用并杀伤相应的细胞。
11.本发明的发明人已确定，可通过使用免疫应答杀伤构成靶部位的细胞来减小由所述细胞构成的组织，从而完成本发明。特别地，通过实验已确定，本发明可实现有效除去和/或减少脂肪细胞，并且通过这一点，可显示出体形矫正和肥胖治疗作用。
12.本发明的一个实例是用于通过施用到靶组织中来减小所述组织的药物组合物，并且所述组合物包含编码外来抗原的遗传物质。本发明的一个实例提供了编码外来抗原的遗传物质杀伤靶细胞和减小靶组织的用途，并且更特别地，其提供了该遗传物质减小局部脂肪组织的用途。优选地，编码外来抗原的遗传物质包含选自黄热病病毒、水痘带状疱疹病毒和风疹病毒的一种或更多种病毒；或其表位。一个实施方案可提供病毒或其表位杀伤靶细胞或减小靶组织的用途。对组织没有特别限制，并且例如，其包括由选自脂肪细胞、肌细胞、骨细胞、软骨细胞、皮肤细胞、分泌细胞和血细胞的一种或更多种细胞组成的组织，并且优选地，所述组织可以是脂肪组织或肌组织，并且更优选地，其可以是皮下脂肪组织。所述组合物可诱导分布在脂肪细胞，特别是皮下脂肪中的脂肪细胞的减少或死亡。
13.本发明的发明人提供了组合物或药盒，其与常规吸脂、药物等相比具有更少的副作用，并且仅靶向局部靶部位(例如，特定部位的脂肪组织)，并因此可预期体形矫正作用。本发明提供了药物组合物，其用于使用针对靶部位发挥局部作用的免疫治疗来减小靶组织的尺寸或体积。本发明提供了药物组合物、疫苗组合物或用于治疗的疫苗组合物，其优选地诱导脂肪细胞，特别是皮下脂肪细胞的死亡。
14.本说明书中使用的“靶组织或靶部位”意指具有用于减小尺寸或体积的结构和功能的细胞群。“身材矫正或体形矫正”意指通过杀伤或减少积聚在不期望部位的构成组织(例如，脂肪组织)的细胞来减小组织的尺寸或体积而具有外部瘦身作用。本说明书中使用的“局部作用”意指基于注射施用部位，在10cm、9cm、8cm、7cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm、1cm的半径内引起细胞死亡或者减小组织的尺寸或体积的作用，并且优选地，其可在3cm的范围内引起所述作用。
15.当对象暴露于抗原时，免疫细胞在功能上执行吞噬和抗原呈递的功能。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可在通过有意或无意地浸润外来物质例如蛋白质抗原或其表位等而产生免疫环境之后施用以诱导免疫应答。通过另一个实例，药物组合物可在体内重复施用。在另一个实例中，施用本发明药物组合物中包含的遗传物质以诱导预先存在的免疫力，并随后在重复施用所述组合物的情况下，体内通过经免疫作用分泌的物质(例如单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、一种淋巴细胞、细胞毒性t细胞免疫细胞、生理活性物质、抗体、补体等)来呈递抗原的脂肪细胞死亡，并且因此，脂肪组织的尺寸或体积可减小。所述组合物可用作身材矫正或体形矫正的用途，并且其可用作在局部部位的体形矫正的用途。另外，所述组合物可施用于肌组织并用作皮肤皱纹改善的作用(例如肉毒杆菌素)、通过肌收缩进行身材矫正的用途等。此外，其可用于除去良性或恶性肿瘤、或除去皮肤上的疣。
16.药物组合物包含编码一种或更多种抗原的遗传物质，并且遗传物质不仅包括dna和/或rna，还包括与遗传物质相关的反义核苷酸、mrna、ssrna(单链rna)、cdna等。抗原是引
起免疫应答以产生抗体的物质，并且可包括肿瘤抗原、病毒、细菌、蛋白质或抗原表位。可无限制地包括抗原，只要其可诱导免疫力即可，并且抗原不限于此，但可以是选自本领域公知的以下中的一种或更多种：非人来源的抗原、病毒来源的抗原、细菌来源的抗原、真菌来源的抗原、原生动物来源的抗原、藻类来源的抗原、寄生虫来源的抗原、支原体来源的抗原和植物来源的抗原，并且抗原可表示为肽或完整蛋白质或其一部分。特别地，病毒的一些非限制性实例包括逆转录病毒科(retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如hiv-1；小核糖核酸病毒科(picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(calciviridae)(例如，引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(flaviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(coronoviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(rhabdoviridae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副黏病毒科(paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(bungaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、和白蛉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(birnaviridae)；嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(herpesviridae)(单纯疱疹病毒(hsv)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒；痘病毒科(poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)。细菌来源的抗原的一些非限制性实例可包括巴斯德菌(pasteurella)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococcus)、大肠杆菌(escherichia coli)、假单胞菌(pseudomonas)物种和沙门氏菌(salmonella)物种。感染性细菌的一些非限制性实例可非限制性地包括来源于以下的抗原：幽门螺杆菌(helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(mycobacteria spp)(例如，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansaii)、戈登分枝杆菌(m.gordonae))、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(meningitides)、单核细胞增生性李斯特菌(listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(链球菌pyogenes)(a群链球菌)、无乳链球菌(agalactiae)(b群链球菌)、链球菌(草绿色群)、粪链球菌(faecalis)、牛链球菌(bovis)、链球菌(厌氧属)、肺炎链球菌(pneumonia)、致病性弯曲杆菌属(campylobacter sp.)、肠球菌属(enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(bacillus antracis)、白喉杆菌(corynebacterium diphtheria)、棒状杆菌属、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringers)、破伤风梭菌(tetani)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德菌(pasturella multocida)、拟杆菌属(bacteroides sp.)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、念珠链状杆菌(streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(treponema pallidium)、极细密螺旋体(pertenue)、钩端螺旋体
(leptospira)、立克次体(rickettsia)和以色列放线菌(actinomyces israelli)。本发明中使用的细菌病原体的一些非限制性实例可包括：肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎衣原体、嗜肺军团菌或百日咳鲍特菌或所有在肺中致病的细菌。真菌来源的抗原的一些非限制性实例可以是来源于以下的抗原：烟曲霉、芽生菌属、粗球孢子菌、波萨达斯球孢子菌、新型隐球菌、格特隐球菌、镰刀菌属、荚膜组织胞浆菌、拟青霉属、巴西副球孢子菌、马尔尼菲青霉菌、杰氏肺孢子虫、波氏假性阿利什霉、尖端赛多孢子菌、根霉属、毛霉属、犁头霉属、小克银汉霉属、多育赛多孢、纸葡萄穗霉、长梗木霉、丝孢酵母属等。可包含寄生虫来源的抗原组分，并且其一些实例可包括来源于以下的抗原：绦虫(绦虫)、牛带绦虫、猪带绦虫、裂头绦虫物种、微小膜壳绦虫、缺陷微小膜壳绦虫、犬复孔绦虫、线虫(蛔虫)、似蚓蛔线虫、粪类圆线虫、美洲板口线虫、十二指肠钩口线虫、犬钩口线虫、毛首鞭形线虫、菲律宾毛细线虫、毛圆线虫物种、旋毛虫物种、美洲板口线虫、异尖线虫和相关物种、哥斯达管圆线虫、蠕形住肠线虫、吸虫(吸虫)、布氏姜片吸虫、异形吸虫物种、棘口吸虫物种、华支睾吸虫、后睾吸虫物种、片形吸虫物种、横川后殖吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、间插血吸虫、棘口吸虫物种和并殖吸虫物种。优选地，其可包含至少一种选自黄热病病毒、水痘带状疱疹病毒和风疹病毒、流感病毒、流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒的病毒，并且优选地，其可包含麻疹病毒。优选地，编码抗原的遗传物质可包含具有seq id no:1所示核酸序列的核酸分子。否则，遗传物质可包含编码具有seq id no:5或6的肽的核酸分子。
17.另外，遗传物质可包含具有与seq id no:1具有至少85％序列同源性的核酸序列的多核苷酸，并且可减小靶组织的尺寸或体积(换言之，本发明可实现该目的)。序列同源性可包括85％或更多、90％或更多、95％或更多、和99％或更多的序列同源性。另外，其可包含具有与编码seq id no:5或6的肽的核酸分子具有至少85％或更多序列同源性的核酸序列的多核苷酸，并且可减小靶组织的尺寸或体积(换言之，本发明可实现该目的)。序列同源性可包括85％或更多、90％或更多、95％或更多、和99％或更多的序列同源性。
18.组合物还可包含编码至少一种细胞因子的遗传物质，所述细胞因子选自il-12、il-2、il-4、il-5、ifn-γ、il-10、il-1、il-6、inf-α、inf-β、tnf-α和tnf-β，并且其优选地包含il-12以进一步使由遗传物质表达的抗原的免疫刺激作用最大化。
19.组合物可通过将遗传物质包含在递送至动物细胞的载体中来提供。核酸可包含在表达载体例如质粒等中来提供，并且优选地，核酸可包含适合于在哺乳动物细胞例如人细胞中表达的转录元件。本发明中使用的“载体”可转运待在细胞中施用的遗传物质。载体可包含与表达调节序列可操作地连接的编码序列。
20.在一个优选的实施方案中，组合物可包含对应于质粒中黄热病病毒(17d)基因的结构蛋白的基因，所述质粒能够在动物细胞中表达蛋白(例如gwiz
tm
载体)。可无限制地使用黄热病病毒，并且例如，黄热病病毒可包括17d毒株，但不限于此。质粒可包含编码病毒或其片段、变体或类似物的核酸分子。例如，其可包含seq id no:1或其片段、变体或类似物。
21.在一个优选的实施方案中，组合物可包含对应于质粒中风疹病毒基因的结构蛋白的基因，所述质粒能够在动物细胞中表达蛋白(例如gwiz
tm
载体)。可无限制地使用风疹病毒，并且例如，风疹病毒可包括ra27/3毒株，但不限于此。编码病毒的基因可包括编码刺突糖蛋白的基因。刺突糖蛋白的实例可包括e2-e1杂合子。例如，其可包含编码seq id no:5的
蛋白质或其片段、变体或类似物的核酸分子。
22.在一个优选的实施方案中，组合物可包含对应于质粒中水痘带状疱疹病毒基因的结构蛋白的基因，所述质粒能够在动物细胞中表达蛋白(例如gwiz
tm
载体)。可无限制地使用水痘带状疱疹病毒，并且例如，水痘带状疱疹病毒可包括oka毒株，但不限于此。编码病毒的核酸分子可包括编码表面蛋白ge蛋白的核酸病毒。例如，其可包含编码seq id no:6的蛋白质或其片段、变体或类似物的核酸分子。
23.本文中，“其片段、变体或类似物”可被理解为意指蛋白质、肽、核酸、核酸分子或基因的一部分，其实现了待由本发明的蛋白质、肽、核酸、核酸分子或基因实现的目的，并且可具有85％或更多、90％或更多、95％或更多、或者99％或更多的序列同源性。例如，包含片段、变体或类似物的意思可理解为意指其不排除在本发明的范围之外，只要可实现可通过seq id no:1的核酸分子、编码seq id no:5的核酸分子或编码seq id no:6的核酸分子；或由所述核酸分子编码的蛋白质所实现的目的即可。
24.本技术的外来遗传物质可优选地包括来源于病毒的遗传物质，并且病毒可优选地包括黄热病病毒、风疹病毒和/或水痘带状疱疹病毒。病毒可具有使靶组织优选脂肪细胞死亡并减小组织尺寸的优异作用。另外，所述作用可快速表现出，而且几乎没有副作用。此外，即使作为注射剂长期储存，也几乎没有劣化的风险。
25.在另一个实施方案中，通过包含能够增强细胞免疫应答的免疫增强剂，组合物还可增强脂肪细胞死亡或减小靶组织的作用。组合物还可包含编码能够改善免疫增强作用的免疫增强剂的遗传物质，例如编码白介素12(il-12)的辅助遗传物质。辅助遗传物质可通过例如将编码区插入到psf-cmv-cmv-sbfl载体中来提供。
26.本发明的组合物不仅可与细胞因子、编码所述细胞因子的基因或其他免疫佐剂一起使用，还可与本领域广泛使用的药物载体或赋形剂一起使用。组合物可被配制成用于人或兽医用途，并以多种途径施用。作为施用途径，可使用经口、经皮、肌内、腹膜、静脉内、皮下或鼻内途径，但不限于此。更优选地，可使用经皮、肌内、腹膜或皮下途径。另外，组合物可通过其中活性物质可移动至靶细胞的任何装置或途径来施用，并且施用方法不受特别限制，只要本发明的组合物或组合物中包含的遗传物质可被递送至靶组织或构成所述组织的细胞即可。例如，其可被配制成注射剂、微针贴片等并且作为注射剂、微针贴片等提供。例如，当用作注射剂时，该注射剂可使用以下来制备：水性溶剂例如生理盐水溶液、林格溶液等，非水性溶剂例如植物油、高级脂肪酸酯(例如油酸乙基等)、醇类(例如，乙醇、苄醇、丙二醇、甘油等)等，在不阻碍遗传物质作用的范围内，并且可包含药物载体，例如用于阻止劣化的稳定剂(例如抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、bha、生育酚、edta等)、乳化剂、用于调节ph的缓冲剂、用于阻止微生物生长的防腐剂(例如，苯基硝酸汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苄醇等)等。当用作微针贴片时，微针可包括不溶性和可溶性微针二者。
27.另外，组合物中包含的遗传物质和/或辅助遗传物质可根据本领域中常用的基因递送方法来递送到体内。作为非限制性实例，基因递送方法例如物理递送方法例如电穿孔或基因枪以及化学递送方法例如脂质-基因复合物(脂质-dna复合物：lipoplex)、聚合物-基因复合物(聚合物-dna复合物：polyplex)、脂质体、树枝状聚合物、纳米粒或其他合适的转移载体都可使用。
28.本发明的组合物以药学有效剂量施用。术语“药学有效剂量”是指足以使组合物表
现出治疗、改善或预防作用或者表现出疫苗作用的量，并且另外，其意指足以不引起副作用或者严重或过度免疫应答的量。由于诱导免疫应答和诱导细胞死亡的目的的特征，本发明的组合物可与遗传物质一起施用，并且优选以2至3天的间隔施用其4至8次，优选5次。当如上所述施用时，可通过靶部位的细胞死亡获得组织的减少或减小的作用。当组合物大量或多次施用时，组合物在细胞死亡作用方面可具有差异，并且可通过调整针对各部位的适当剂量来使用。
29.本发明的另一个实施方案提供了用于减小或减少组织体积尺寸的方法，其包括将编码蛋白质抗原的遗传物质、包含遗传物质的载体、或包含其的组合物施用到对象的靶组织中。所述方法可优选地杀伤构成皮下脂肪组织的细胞。i)方法或者ii)编码蛋白质抗原的遗传物质、包含遗传物质的载体、或包含其的组合物、或包含其的药盒可用作用于改善或治疗对象的肥胖的用途、用于改善皱纹的用途、用于减少肌肉的用途、用于除去或减小良性或恶性肿瘤的用途、用于除去疣的用途等，并且可用作用于出于美容目的除去眼下方的脂肪袋的用途，并且可用作用于由此减轻黑眼圈的用途。
30.所述方法还可包括在将遗传物质、包含遗传物质的载体、或包含其的组合物施用到靶组织中之前，在体内构成免疫环境。在体内构成免疫环境可包括施用能够诱导免疫应答的外来物质。外来物质可包括任何物质，只要其使用蛋白质作为抗原而没有限制。
31.本发明的一个实施方案可作为用于治疗、改善或预防多种适应证的用途而提供，并且也可作为用于改善外观的美容目的而提供。
32.本发明的另一个实例提供了药盒，其包含：(a)用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含编码外来抗原的遗传物质；以及(b)用于疫苗施用的施用指南。药盒还可包含(c)含有用于在施用(a)组合物之前构成免疫环境的蛋白质抗原或其表位的组合物。本文中，(c)可解释为至少一种用于诱导免疫应答的前疫苗(pre-vaccine)或组合物。
33.本技术中提及的“前疫苗”可解释为在施用用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物之前施用的疫苗，并且可理解为在施用本技术的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物之前施用以获得预先存在的免疫力的疫苗组合物。前疫苗可包含与本技术的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物中包含的抗原物质相同的抗原物质。例如，(a)包含编码外来抗原的遗传物质的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物可包含黄热病病毒、风疹病毒和/或水痘带状疱疹病毒，以及(c)还可包含黄热病病毒、风疹病毒和/或水痘带状疱疹病毒。
34.(a)疫苗组合物还可包含编码细胞因子的遗传物质，并且可包含任何可用于提高(a)组合物的免疫作用的物质而没有限制。细胞因子可包含选自il-12、il-2、il-4、il-5、ifn-γ、il-10、il-1、il-6、inf-α、inf-β、tnf-α和tnf-β中的至少一种。
35.本发明的药盒可包含至少一种如本说明书中关于药物组合物、抗微生物剂、dna酶抑制剂、rna酶抑制剂、增溶剂等所限定的另外的药剂。药盒可例如由至少一个药盒部分(例如，容器)组成。例如，每个容器可以是注射器、预填充注射器、小瓶、瓶、罐、密封套筒、封套或小袋、管或泡罩包装或者其中容器被配置成阻止元件过早混合的任何其他合适的形式。不同元件中的每个可单独提供，或不同元件中的一些可一起提供(即，在同一容器中)。药盒还可包含施用指南，其具有关于任何组分的施用、施用方法和剂量的信息。
36.本发明的另一个实例提供了填充有用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物的注射器，其包含编码外来抗原的遗传物质。注射器还可包含编码细胞因子的遗传物质。细胞因子可包含选自il-12、il-2、il-4、il-5、ifn-γ、il-10、il-1、il-6、inf-α、inf-β、tnf-α和tnf-β中的至少一种。
37.有益效果
38.本发明提供了新的用于改善或治疗肥胖的组合物，其可杀伤特定靶部位上的细胞，可减小或减少组织的尺寸或体积。通过施用所述组合物，可获得身体塑形作用或身体改善作用。
39.本发明可提供新型肥胖治疗剂，其可解决局部肥胖并完成平滑的身体线条。
40.本发明的肥胖治疗剂对选择性局部部位减小是有效的，其可选择性地仅减小期望部位的组织，而不影响不期望部位的组织或构成它们的细胞。
41.另外，本发明的组合物可用于改善外观的美容目的。
附图说明
42.图1示出了通过施用黄热病疫苗株17d病毒来诱导预先存在的免疫力的结果。这是通过在施用疫苗株之后2周分离血清来测量针对黄热病病毒的igg抗体滴度以确定免疫环境的组成的结果。分别地，nc表示未施用的正常小鼠，以及nd(正常饮食)表示用正常饮食饲喂的小鼠，以及hfd(高脂肪饮食)表示施加高卡路里饮食的肥胖诱导小鼠。
43.图2是基于在紧临施用用于治疗的疫苗之前的体重来测量在施用之前和之后的体重变化的结果。
44.图3是示出在施用用于治疗的疫苗之后的at(脂肪组织)重量变化程度的结果。
45.图4示出了at(脂肪组织)的重量变化率的统计学分析的结果。作为统计学分析的结果，mock/治疗剂(用于治疗的疫苗)的p值为0.03007，以及mock/治疗剂+il-12的p值为0.0005，并且在统计学上，以单独治疗剂和治疗剂+il-12进行的处理分别与mock相比存在显著差异。可看出，在单独治疗剂处理与治疗剂和il-12同时处理的两组之间存在显著差异。
46.图5示出了其中将编码黄热病病毒(17d)基因组(genbank：x03700.1)中的结构蛋白(衣壳蛋白、prm蛋白、包膜蛋白，119至2452bp(2334bp))的遗传物质(seq id no:1)插入到gwiz
tm
载体中的载体图。tga(终止密码子)被添加在末端。
47.图6示出了其中将对应于il-12的p35(genbank：m86672.1)和p40(genbank：m86671.1)的编码区(p35，127至774bp；p40，35至1042bp)的核酸序列seq id no:2和3分别插入到具有kozak序列的psf-cmv-cmv-sbfl载体中的载体图。将il-12p35插入到限制酶中；在mcs位点i处的ecori和xhoi位点，并将il-12p40插入到限制酶中；在mcs位点ii处的sali和spei位点。
具体实施方式
48.在下文中，为了帮助理解本发明，将通过实施例等对其进行详细描述。然而，根据本发明的实施例可以以许多不同的形式进行修改，并且本发明的范围不应被解释为限于以下实施例。提供本发明的实施例以向本领域技术人员更完整地说明本发明。
49.1.用于降解脂肪细胞的疫苗的制备
50.对于实验，如下制备用于施用到其中诱导了预先存在的免疫力的对象中的遗传物质以及可与遗传物质一起施用的免疫增强剂。
51.(1)外来抗原的制备
52.1)黄热病病毒的遗传物质的制备
53.首先，制备编码黄热病病毒(17d)基因组(genbank：x03700.1)中结构蛋白(衣壳蛋白、prm蛋白、包膜蛋白，119至2452bp(2334bp))的遗传物质(seq id no:1)。
54.2)风疹病毒的遗传物质的制备
55.制备编码风疹病毒ra27/3毒株的e1-e2蛋白的遗传物质，其编码seq id no:5。
56.3)水痘带状疱疹病毒的遗传物质的制备
57.制备编码水痘带状疱疹病毒oka毒株的ge蛋白的遗传物质，其编码seq id no:6。
58.(2)动物细胞中表达的载体的制备
59.代表性地，通过将黄热病病毒的遗传物质插入到可在动物细胞中表达蛋白质的gwiz
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载体中，确定了脂肪细胞死亡的结果。载体图在图5中示出。
60.(3)辅助遗传物质的制备
61.接下来，制备免疫增强剂作为辅助遗传物质。将对应于il-12的p35(genbank：m86672.1)和p40(genbank：m86671.1)的编码区(p35，127至774bp；p40，35至1042bp)的核酸序列seq id no:2和3分别插入到具有kozak序列的psf-cmv-cmv-sbfl载体中。载体图在图6中示出。
62.另外，在各il-12的合成期间，kozak序列被插入前端。
63.将克隆的yf抗原质粒和mil12质粒转化到dh5a感受态细胞中。大量培养相应的细胞，并使用质粒制备试剂盒回收质粒。
64.2.脂肪细胞死亡的确定
65.(1)实验方法
66.1)饮食诱导的肥胖(diet induced obese，dio)小鼠产生
67.对c57bl/6j、3w、雌性小鼠分别饲喂正常饮食和60％高脂肪饮食。每周测量体重，并且当饲养10至15周之后体重比正常小鼠提高25％或更多时，其被认为是肥胖诱导小鼠，并用于实验。
68.2)预先存在的免疫力的诱导和抗体滴度的测量
69.使用减毒活病毒(疫苗株病毒)诱导预先存在的免疫力形成。作为疫苗株病毒，使用17d病毒。
70.将17d病毒(减毒活病毒)以2
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105pfu/次的浓度注射到小鼠左后肢的肌肉中，以2周间隔注射3次。在最后一次注射之后2周收集血液，并分离血清。在分离的血清中，通过elisa分析来检测对yfv具有特异性的抗体。通过elisa分析，将用于注射的17d病毒以5
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104pfu/孔的浓度包被在板上，并将分析样品(血清)稀释并反应2小时。在洗涤之后，将抗小鼠igg-hrp二抗以1/4000稀释并处理，并随后反应2小时。在洗涤之后，添加颜色形成溶液并反应10分钟以测量o.d值。
71.在施用黄热病疫苗株17d病毒之后两周，分离血清，并测量针对yfv的igg抗体滴度，并且发生了正常的免疫诱导(抗体)。
72.结果在图3中示出。为了确定小鼠体内抗体的产生，首先，进行yfv特异性igg总滴度分析。使用elisa测定将滴度形成的程度显示为吸光度(od值)。与nc组相比，nd和hfd组显示出约1的od值，并且可确定产生了抗体。因此，可确定发生了免疫诱导。
73.3)用于治疗的疫苗的施用和脂肪重量的测量
74.将正常小鼠或肥胖诱导小鼠分成分别施用黄热病疫苗的组和未施用的组，并用于实验。在施用用于治疗的疫苗之前3天，向所有小鼠提供正常饮食。通过将小鼠分成左侧和右侧，将用于治疗的疫苗注射到一侧的腹股沟脂肪组织中和肩胛间脂肪组织的2个部位中。将it以2至3天的间隔施用5次，并且抗原dna的浓度为100ug/部位，以及il-12dna的浓度为50ug/部位，并且使用了总共150ug/部位，并根据施用的抗原dna的总量使用空载体。测量在施用用于治疗的疫苗之前和之后的体重。在最后一次施用用于治疗的疫苗之后第7天，解剖小鼠，并分离腹股沟脂肪组织和肩胛间脂肪组织，并测量各自的重量。
75.nd：正常饮食，hfd：60％高脂肪饮食
76.[表1]
[0077][0078][0079]
确定了在施用表1中各组的治疗剂之后体重的平均变化率和减小脂肪组织的作用，并且其在图2至4中示出。参考图2，在施用用于治疗的疫苗(治疗剂，处理)之前和之后测量体重，并且基于紧临施用之前的体重测量体重的变化，并且在没有用任何物质处理的组的情况下，体重逐渐提高，但是所有的mock、用于治疗的疫苗1和用于治疗的疫苗2的组均显示出体重减轻的作用，并且在用于治疗的疫苗1和2的施用组中，体重更显著地降低。另外，在与il-12共施用的组的情况下，显示出最大的体重减轻。图3示出了以下结果：在施用用于治疗的疫苗5次之后的第7天，分离小鼠左侧和右侧的腹股沟at(脂肪组织)和肩胛间at，以测量at的重量，并与同一对象中基于空载体或未施用用于治疗的疫苗的at的脂肪重量减少的量进行比较。当与未施用任何物质的对照和施用空载体的组相比时，可看出，当用于治疗的疫苗1和2处理时，脂肪组织重量减少。特别地，可看出，在与il-12一起施用的用于治疗的
疫苗2的处理组中，脂肪组织重量的变化大得多。
[0080]
工业适用性
[0081]
本发明可预防和/或治疗肥胖。本发明提供了可通过注射到局部区域中来预防和/或治疗肥胖的方法。

技术特征：
1.用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其包含编码外来抗原的遗传物质。2.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述靶组织是由选自脂肪细胞、肌细胞、骨细胞、软骨细胞、皮肤细胞、分泌细胞和血细胞的一种或更多种细胞组成的组织。3.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述组合物诱导脂肪细胞的减少或死亡。4.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述组合物中包含的外来抗原是选自以下中的一种或更多种：非人来源的抗原、病毒来源的抗原、细菌来源的抗原、真菌来源的抗原、原生动物来源的抗原、藻类来源的抗原、寄生虫来源的抗原、支原体来源的抗原和植物来源的抗原。5.根据权利要求4所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述外来抗原是选自黄热病病毒、水痘带状疱疹病毒和风疹病毒的一种或更多种病毒；或其表位。6.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述遗传物质是dna或rna。7.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述遗传物质包含选自以下中的一种或更多种：seq id no:1的核酸分子；和编码seq id no:5或6的肽的核酸分子。8.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物还包含编码细胞因子的遗传物质。9.根据权利要求8所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述细胞因子是选自以下中的一种或更多种：il-12、il-2、il-4、il-5、ifn-γ、il-10、il-1、il-6、inf-α、inf-β、tnf-α和tnf-β。10.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述外来抗原引起细胞内免疫应答。11.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述组合物局部地发挥作用，并且所述疫苗组合物在用于产生免疫环境的至少一种蛋白质或其表位首次施加于对象之后进行施加。12.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述遗传物质经口，通过经皮、肌内、腹膜、静脉内、皮下或经鼻途径注射，或者通过电穿孔、基因枪、脂质体、树枝状聚合物、纳米粒或转移载体施用于靶组织。13.根据权利要求1所述的用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其中所述遗传物质的剂量为每一次接种0.1至1000ug/部位。14.药盒，其包含：(a)用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含编码外来抗原的遗传物质；以及(b)用于疫苗施用的施用指南。15.根据权利要求14所述的药盒，其中所述药盒还包含(c)含有用于在施用(a)组合物之前产生免疫环境的蛋白质抗原或其表位的组合物。
16.根据权利要求14所述的药盒，其中(a)疫苗组合物还包含编码细胞因子的遗传物质。17.填充有用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物的注射器，其包含编码外来抗原的遗传物质。18.根据权利要求17所述的注射器，其中所述注射器还包含编码细胞因子的遗传物质。19.用于除去皮下脂肪细胞的组合物，其包含编码至少一种外来抗原的遗传物质。20.根据权利要求19所述的用于除去皮下脂肪细胞的组合物，其中所述组合物还包含编码细胞因子的遗传物质。21.减小对象的靶组织的尺寸或体积的方法，其包括向对象的靶组织施用编码外来抗原的遗传物质。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法诱导对象的脂肪细胞的减少或死亡。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法包括同时或顺序引入选自以下的一种或更多种细胞因子：il-12、il-2、il-4、il-5、ifn-γ、il-10、il-1、il-6、inf-α、inf-β、tnf-α和tnf-β。

技术总结
本发明涉及用于减小靶组织的尺寸或体积的疫苗组合物，其包含编码外来抗原的遗传物质，并且优选地，所述组合物可作为用于治疗或预防肥胖的疫苗组合物提供。疫苗组合物可作为用于除去皮下脂肪细胞的组合物提供。用于除去皮下脂肪细胞的组合物提供。用于除去皮下脂肪细胞的组合物提供。


技术研发人员：金恩顺 徐基元 洪承惠 权泰佑 金勋 李受陈
受保护的技术使用者：SK生物科学株式会社
技术研发日：2021.10.22
技术公布日：2023/8/24