治疗肽制剂的制作方法

10.leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-11.leu-xaa28-gly-gly-pro-ser-ser-gly
12.其中
13.xaa2为aib；
14.xaa28为glu或ser；
15.通过经由20位的lys与c14-c24脂肪酸之间的接头使lys侧链的ε-氨基与c14-c24脂肪酸缀合来化学修饰20位的lys，其中接头为([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)t，其中t为1或2；并且
[0016]
c-末端氨基酸任选被酰胺化(seq id no：5)，
[0017]
或其药学上可接受的盐；
[0018]
(ii)缓冲剂；
[0019]
(iii)张度剂；和
[0020]
(iii)抗氧化剂，
[0021]
其中制剂的ph为7.8-9.0。
[0022]
在初步制剂研究中发现，如本文所述的化合物在ph 5.0-6.0下具有次优溶解度。这些研究表明，化合物应在约7.0或更高的ph下配制，以具有适合于sc、im和/或ip施用的溶解度。然而，进一步的制剂研究令人惊讶地表明，本文所述的化合物在7.0至8.5的ph值范围内表现出显著的稳定性问题。进行进一步研究以了解稳定性问题。令人惊讶地发现，存在至少两种可能引起稳定性问题的机制。首先，认为化合物可能由于与天然人胰高血糖素的序列相似性而易于原纤维形成。本文所述的研究表明，化合物在小于7.8的ph下遭受显著的原纤维形成。其次，认为化合物可能易于在某些氨基酸残基上氧化，特别是在1位的组氨酸(his，h)和在25位的色氨酸(trp，w)。本文所述的研究表明化合物易于氧化。如上所述配制化合物以解决稳定性问题的这些经证实的原因。在7.8-9.0的ph范围内配制化合物避免了原纤维形成。包含抗氧化剂显著减少或消除了源自化合物氧化的聚集物。
[0023]
在本发明的进一步的实施方案中，c14-c24脂肪酸为选自以下的饱和单酸或饱和二酸：肉豆蔻酸(十四烷酸)(c14单酸)、十四烷二酸(c14二酸)、棕榈酸(十六烷酸)(c16单酸)、十六烷二酸(c16二酸)、十七酸(十七烷酸)(c17单酸)、十七烷二酸(c17二酸)、硬脂酸(十八烷酸)(c18单酸)、十八烷二酸(c18二酸)、十九烷酸(十九烷酸)(c19单酸)、十九烷二酸(c19二酸)、花生酸(二十烷酸)(c20单酸)、二十烷二酸(c20二酸)、二十一烷酸(二十一烷酸)(c21单酸)、二十一烷二酸(c21二酸)、山嵛酸(二十二酸)(c22)、二十二烷二酸(c22二酸)、二十四烷酸(二十四烷酸)(c24单酸)和二十四烷二酸(c24二酸)。
[0024]
优选地，c14-c24脂肪酸是十八烷二酸。
[0025]
可选择地，优选地，c14-c24脂肪酸为二十烷二酸。
[0026]
在本发明的优选实施方案中，c-末端氨基酸是酰胺化的。
[0027]
在本发明的进一步的实施方案中，化合物选自：
[0028]
(a)下式化合物：
[0029]
his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-leu-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly
[0030]
其中xaa2为aib；
[0031]
通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)-co-(ch2)
18
co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且
[0032]
c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：1)(化合物1)，
[0033]
或其药学上可接受的盐；
[0034]
(b)下式化合物：
[0035]
his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-leu-ser-gly-gly-pro-ser ser-gly
[0036]
其中xaa2为aib；
[0037]
通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)2-co-(ch2)
18
co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且
[0038]
c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：2)(下文称作化合物2)，
[0039]
或其药学上可接受的盐；
[0040]
(c)下式化合物：
[0041]
his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-leu-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly
[0042]
其中xaa2为aib；
[0043]
通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)-co-(ch2)
16
co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且
[0044]
c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：3)(下文称作化合物3)，
[0045]
或其药学上可接受的盐；和
[0046]
(d)下式化合物：
[0047]
his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-leu-ser-gly-gly-pro-ser-ser-gly
[0048]
其中xaa2为aib；
[0049]
通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)2-co-(ch2)
16
co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且
[0050]
c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：4)(下文称作化合物4)，
[0051]
或其药学上可接受的盐。
[0052]
在本发明优选的实施方案中，化合物具有下式：
[0053]
his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-leu-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly
[0054]
其中xaa2为aib；
[0055]
通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)-co-(ch2)
18
co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且
[0056]
c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：1)(化合物1)，
[0057]
或其药学上可接受的盐。
[0058]
在本发明的进一步的实施方案中，制剂包含1mg/ml-100mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0059]
优选地，制剂包含5mg/ml-90mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0060]
进一步优选地，制剂包含10mg/ml-80mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0061]
仍然进一步优选地，制剂包含20mg/ml-70mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0062]
仍然进一步优选地，制剂包含30mg/ml-60mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0063]
仍然进一步优选地，制剂包含40mg/ml-50mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0064]
可选择的是，制剂包含1mg/ml-50mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0065]
进一步可选择的是，制剂包含2mg/ml-45mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0066]
仍然进一步可选择的是，制剂包含3mg/ml-40mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0067]
仍然进一步可选择的是，制剂包含4mg/ml-35mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0068]
仍然进一步可选择的是，制剂包含5mg/ml-30mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0069]
仍然进一步可选择的是，制剂包含6mg/ml-25mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0070]
仍然进一步可选择的是，制剂包含7mg/ml-20mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0071]
仍然进一步可选择的是，制剂包含8mg/ml-15mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0072]
可选择地，优选地，制剂包含1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml 15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml或100mg/ml的化合物或其药学上可接受的盐。
[0073]
在本发明的仍然进一步的实施方案中，缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂和三(羟甲基)氨基甲烷(或2-氨基-2-羟甲基-丙-1，3-二醇)[(hoch2)3cnh2])缓冲剂。
[0074]
在本发明的仍然进一步的实施方案中，制剂包含1mm-20mm的缓冲剂。
[0075]
优选地，制剂包含3mm-18mm的缓冲剂。
[0076]
进一步优选地，制剂包含5mm-15mm的缓冲剂。
[0077]
仍然进一步优选地，制剂包含8mm-12mm的缓冲剂。
[0078]
仍然进一步优选地，制剂包含9mm-11mm的缓冲剂。
[0079]
在本发明的又进一步的实施方案中，制剂包含1mm的缓冲剂、2mm的缓冲剂、3mm的缓冲剂、4mm的缓冲剂、5mm的缓冲剂、6mm的缓冲剂、7mm的缓冲剂、8mm的缓冲剂、9mm的缓冲剂、10mm的缓冲剂、11mm的缓冲剂、12mm的缓冲剂、13mm的缓冲剂、14mm的缓冲剂、15mm的缓冲剂、16mm的缓冲剂、17mm的缓冲剂、18mm的缓冲剂、19mm的缓冲剂或20mm的缓冲剂。
[0080]
在本发明的优选实施方案中，缓冲剂为三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲剂。
[0081]
进一步优选地，制剂包含1mm的tris缓冲剂、2mm的tris缓冲剂、3mm的tris缓冲剂、
4mm的tris缓冲剂、5mm的tris缓冲剂、6mm的tris缓冲剂、7mm的tris缓冲剂、8mm的tris缓冲剂、9mm的tris缓冲剂、10mm的tris缓冲剂、11mm的tris缓冲剂、12mm的tris缓冲剂、13mm的tris缓冲剂、14mm的tris缓冲剂、15mm的tris缓冲剂、16mm的tris缓冲剂、17mm的tris缓冲剂、18mm的tris缓冲剂、19mm的tris缓冲剂或20mm的tris缓冲剂。
[0082]
更优选地，制剂包含10mm tris缓冲剂。
[0083]
在本发明的又进一步的实施方案中，张度剂选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘油、丙二醇、氯化钠和盐酸精氨酸。
[0084]
张度剂为经选择以调节制剂张度的赋形剂。张度通常涉及溶液的渗透压，其通常相对于人血清的渗透压。制剂可以是低渗的、等渗的或高渗的。张度剂的浓度取决于所需的张度和所选择的特定活性剂的分子量。例如，25mg/ml甘油对作为95mg/ml蔗糖的水溶液具有相似的张度。其它赋形剂可以影响制剂的张度，并且张度剂的浓度根据所需结果和所用活性剂的分子量进行改变。
[0085]
在本发明的又进一步的实施方案中，制剂包含5mg/ml-150mg/ml的张度剂。
[0086]
优选地，制剂包含10mg/ml-120mg/ml的张度剂。
[0087]
进一步优选地，制剂包含20mg/ml-100mg/ml的张度剂。
[0088]
仍然进一步优选地，制剂包含30mg/ml-80mg/ml的张度剂。
[0089]
仍然进一步优选地，制剂包含40mg/ml-60mg/ml的张度剂。
[0090]
仍然进一步优选地，制剂包含45mg/ml-55mg/ml的张度剂。
[0091]
在本发明的优选实施方案中，张度剂为甘露醇。
[0092]
仍然进一步优选地，制剂包含10mg/ml-90mg/ml的甘露醇。
[0093]
仍然进一步优选地，制剂包含20mg/ml-80mg/ml的甘露醇。
[0094]
仍然进一步优选地，制剂包含30mg/ml-70mg/ml的甘露醇。
[0095]
仍然进一步优选地，制剂包含40mg/ml-60mg/ml的甘露醇。
[0096]
仍然进一步优选地，制剂包含45mg/ml-55mg/ml的甘露醇。
[0097]
更优选地，制剂包含50mg/ml的甘露醇。
[0098]
在本发明的又进一步的实施方案中，抗氧化剂选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂。
[0099]
在本发明的又进一步的实施方案中，制剂包含0.05-10.0mg/ml的抗氧化剂。
[0100]
优选地，制剂包含0.1-5.0mg/ml的抗氧化剂。
[0101]
进一步优选地，制剂包含0.2-1.0mg/ml的抗氧化剂。
[0102]
可选择地，优选地，制剂包含0.05mg/ml的抗氧化剂、0.075mg/ml的抗氧化剂、0.1mg/ml的抗氧化剂、0.2mg/ml的抗氧化剂、0.3mg/ml的抗氧化剂、0.4mg/ml的抗氧化剂、0.5mg/ml的抗氧化剂、0.6mg/ml的抗氧化剂、0.7mg/ml的抗氧化剂、0.8mg/ml的抗氧化剂、0.9mg/ml的抗氧化剂、1.0mg/ml的抗氧化剂、1.1mg/ml的抗氧化剂、1.2mg/ml的抗氧化剂、1.3mg/ml的抗氧化剂、1.4mg/ml的抗氧化剂、1.5mg/ml的抗氧化剂、1.6mg/ml的抗氧化剂、1.7mg/ml的抗氧化剂、1.8mg/ml的抗氧化剂、1.9mg/ml的抗氧化剂、2.0mg/ml的抗氧化剂、2.5mg/ml的抗氧化剂、3.0mg/ml的抗氧化剂、3.5mg/ml的抗氧化剂、4.0mg/ml的抗氧化剂、4.5mg/ml的抗氧化剂、5.0mg/ml的抗氧化剂、5.5mg/ml的抗氧化剂、6.0mg/ml的抗氧化剂、6.5mg/ml的抗氧化剂、7.0mg/ml的抗氧化剂、7.5mg/ml的抗氧化剂、8.0mg/ml的抗氧化剂、
8.5mg/ml的抗氧化剂、9.0mg/ml的抗氧化剂、9.5mg/ml的抗氧化剂或10.0mg/ml的抗氧化剂。
[0103]
在本发明的优选实施方案中，抗氧化剂为自由基清除剂。
[0104]
进一步优选地，抗氧化剂选自edta、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯(bht)、丁羟茴醚(bha)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、乙醇和n-乙酰基半胱氨酸。
[0105]
仍然进一步优选地，抗氧化剂为edta。
[0106]
仍然进一步优选地，制剂包含0.05-10.0mg/ml的edta。
[0107]
仍然进一步优选地，制剂包含0.1-5.0mg/ml的edta。
[0108]
仍然进一步优选地，制剂包含0.2-1.0mg/ml的edta。
[0109]
可选择地，优选地，制剂包含0.05mg/ml的edta、0.075mg/ml的edta、0.1mg/ml的edta、0.2mg/ml的edta、0.3mg/ml的edta、0.4mg/ml的edta、0.5mg/ml的edta、0.6mg/ml的edta、0.7mg/ml的edta、0.8mg/ml的edta、0.9mg/ml的edta、1.0mg/ml的edta、1.1mg/ml的edta、1.2mg/ml的edta、1.3mg/ml的edta、1.4mg/ml的edta、1.5mg/ml的edta、1.6mg/ml的edta、1.7mg/ml的edta、1.8mg/ml的edta、1.9mg/ml的edta、2.0mg/ml的edta、2.5mg/ml的edta、3.0mg/ml的edta、3.5mg/ml的edta、4.0mg/ml的edta、4.5mg/ml edta，5.0mg/ml的edta、5.5mg/ml的edta、6.0mg/ml的edta、6.5mg/ml的edta、7.0mg/ml的edta、7.5mg/ml的edta、8.0mg/ml的edta、8.5mg/ml的edta、9.0mg/ml的edta、9.5mg/ml的edta或10.0mg/ml的edta。
[0110]
更优选地，制剂包含0.5mg/ml的edta。
[0111]
可选择地，优选地，抗氧化剂为柠檬酸。
[0112]
仍然进一步优选地，制剂包含1-20mm的柠檬酸。
[0113]
仍然进一步优选地，制剂包含5-15mm的柠檬酸。
[0114]
仍然进一步优选地，制剂包含8-12mm的柠檬酸。
[0115]
可选择地，优选地，制剂包含1mm的柠檬酸、1.5mm的柠檬酸、2mm的柠檬酸、2.5mm的柠檬酸、3mm的柠檬酸、3.5mm的柠檬酸、4mm的柠檬酸、4.5mm的柠檬酸、5mm的柠檬酸、5.5mm的柠檬酸、6mm的柠檬酸、6.5mm的柠檬酸、7mm的柠檬酸、7.5mm的柠檬酸、8mm的柠檬酸、8.5mm的柠檬酸、9mm的柠檬酸、9.5mm的柠檬酸、10mm的柠檬酸、10.5mm的柠檬酸、11mm的柠檬酸、11.5mm的柠檬酸、12mm的柠檬酸、13mm的柠檬酸、13.5mm的柠檬酸、14mm的柠檬酸、14.5mm的柠檬酸、15mm的柠檬酸、15.5mm的柠檬酸、16mm的柠檬酸、16.5mm的柠檬酸、17mm的柠檬酸、17.5mm的柠檬酸、18mm的柠檬酸、18.5mm的柠檬酸、19mm的柠檬酸、19.5mm的柠檬酸或20mm的柠檬酸。
[0116]
更优选地，制剂包含10mm的柠檬酸。
[0117]
在本发明的可选择的实施方案中，抗氧化剂为抗坏血酸。
[0118]
在本发明的进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为丁羟甲苯(bht)。
[0119]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为丁羟茴醚(bha)。
[0120]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为亚硫酸钠。
[0121]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为对氨基酸苯甲酸。
[0122]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为谷胱甘肽。
[0123]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为没食子酸丙酯。
[0124]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为半胱氨酸。
[0125]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为组氨酸。
[0126]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为甲硫氨酸。
[0127]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为乙醇。
[0128]
在本发明的又进一步可选择的实施方案中，抗氧化剂为n-乙酰基半胱氨酸。
[0129]
在本发明的优选实施方案中，制剂的ph为8.0-8.6。
[0130]
进一步优选地，制剂的ph为8.0-8.3。
[0131]
在本发明的优选实施方案中，药物制剂包含：
[0132]
(i)1mg/ml-100mg/ml的下式化合物：
[0133]
his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val
‑‑
glu-trp-leu-leu-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly
[0134]
其中xaa2为aib；
[0135]
通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)-co-(ch2)18co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且
[0136]
c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：1)(化合物1)
[0137]
或其药学上可接受的盐；
[0138]
(ii)10mm的tris缓冲液；
[0139]
(iii)46mg/ml的甘露醇；
[0140]
(iv)0.5mg/ml的edta，
[0141]
其中制剂的ph为8.0-8.3。
[0142]
在本发明的又进一步的实施方案中，提供了治疗和/或预防2型糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝病(nafld)和/或非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的如本文所述的药物制剂。
[0143]
在本发明的又进一步的实施方案中，提供了如本文所述的药物制剂，其用于治疗和/或预防2型糖尿病、肥胖症、nafld和/或nash。
[0144]
在本发明的又进一步的实施方案中，提供了如本文所述的药物制剂在制备用于治疗2型糖尿病、肥胖症、nafld和/或nash的药物中的用途。
[0145]
如本文所用，表述“药物制剂”是指具有至少一种能够在人中发挥生物效应的活性药物成分(api)、至少一种非活性成分(例如，缓冲剂、赋形剂、表面活性剂等)的溶液，当与api组合时，非活性成分适合于向人治疗性施用。本公开的药物制剂是稳定的制剂，其中治疗化合物的降解、修饰、聚集、生物活性丧失等的程度可接受地受到控制，并且不会随时间不可接受地增加。
[0146]
在本发明的上下文中，api是化合物1或其药学上可接受的盐、化合物2或其药学上可接受的盐、化合物3或其药学上可接受的盐或者化合物4或其药学上可接受的盐。化合物1、2、3和4及其药学上可接受的盐及其制备方法描述在美国专利号9,938,335中。
[0147]
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指不具有治疗活性并且具有可接受毒性的任何成分，例如用于配制药物产品的缓冲剂、溶剂、张度剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂或聚合物。根据既定的政府标准，包括美国食品和药品管理局颁布的那些标准，它们
通常对人施用是安全的。
[0148]
如本文所用，如本文所用的术语“缓冲剂”是指对ph变化具有抗性的溶液。缓冲剂可以包括弱酸及其盐，或弱碱及其盐，其有助于维持ph的稳定性。在药物制剂中使用的缓冲剂的实例包括碳酸氢盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、三(羟甲基)氨基甲烷(或2-氨基-2-羟甲基-丙-1,3-二醇[(hoch2)3cnh2])缓冲剂及其组合。这些缓冲剂中的某些适合于皮下施用的药物制剂。根据制剂的所需ph选择用于药物制剂的缓冲剂。例如，本发明的药物制剂的ph为7.8至9.0。适于实现该ph的缓冲剂包括碳酸氢盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、三(羟甲基)氨基甲烷(或2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇[(hoch2)3cnh2])缓冲剂和氢氧化钠(naoh)缓冲剂。其中，磷酸盐缓冲剂和tris缓冲剂优选用于可注射制剂中。制剂的ph可以使用生理上适当的酸和碱调节，如可能需要的，以达到期望的ph。(例如，当制剂中api的浓度增加或降低时，可能需要调节ph)。
[0149]
三(羟甲基)氨基甲烷或三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂可以称作“tris”、“tris”、“tris碱”、“tris缓冲剂”、“trisamine”、“tham”和其它名称，此外，许多缓冲剂和/或缓冲体系包括tris。例如，tris～缓冲盐水(“tbs”)、tris-盐酸盐缓冲剂(“tris-hcl”)、tris碱(ph 10.6)、tris/硼酸盐/乙二胺四乙酸盐(“edta”)缓冲剂(“tbe”)和tris/乙酸盐/edta缓冲剂(“tae”)。tris碱通常与tris-hcl一起使用以制备所需ph的tris缓冲剂。
[0150]
如本文所用的术语“张度剂”是指用于调节制剂张度的药学上可接受的赋形剂。张度通常涉及溶液的渗透压，其通常相对于人血清的渗透压。制剂可以是低渗的、等渗的或高渗的。适合的张度剂包括但不限于盐、氨基酸和糖。用于本发明药物制剂的优选张度剂包括甘露醇、蔗糖、海藻糖、丙二醇、甘油、氯化钠和盐酸精氨酸。
[0151]
术语“抗氧化剂”是指防止api氧化的药学上可接受的赋形剂。适用于本发明药物制剂的抗氧化剂包括螯合剂(edta、柠檬酸)、活性氧清除剂(抗坏血酸、丁羟甲苯(bht)、丁羟茴醚(bha)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯)和链终止剂(组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和n-乙酰基半胱氨酸)。
[0152]
可适用于本发明药物制剂的可选择的缓冲剂、张度剂和抗氧化剂描述在remington:the science and practice of pharmacy,第23版,(editor-adeboye adejare)中。
[0153]
本文所述的药物制剂可以包括其它适合的药学上可接受的赋形剂，例如增溶剂、乳化剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、粘度调节剂和稳定剂。
[0154]
如本文可以使用的，术语“约”或“大约”，当用于提及特定列举的数值或值的范围时，是指该值可以从列举的值变化不超过10％(例如，+/-10％)。例如，本文所用的表述“约100”包括90和110以及其间的所有值(例如，91、92、93、94等)。
[0155]
如本文可互换使用的，“治疗”旨在指其中可能存在疾病和/或其症状的完全消除、减缓或延迟、严重性或频率(例如，突发(flares)或发作)的降低、进展的中断或停止，但不需要完全消除所有疾病症状的所有过程。治疗包括施用本公开的药物制剂用于治疗将受益于至少一种上文列出的过程的人的疾病，包括：(a)抑制疾病症状和作用的进一步进展，即阻止其发展；(b)缓解疾病，即引起疾病、疾病症状或其并发症的消除或消退；和(c)预防或减少疾病发作或突发的频率。根据具体的实施方案，本文提供的药物制剂可以用于治疗ii
型糖尿病、肥胖症、nafld和nash中的至少一种。
[0156]
如本文可互换使用的，术语“患者”、“个体(subject)”和“个体(individual)”是指人。除非另有说明，否则个体的特征还在于患有将受益于施用本文公开的药物制剂的疾病的症状、处于发展疾病的症状的风险中或经历疾病的症状。
[0157]
如本文可互换使用的，本公开的药物制剂的“有效量”或“治疗有效量”是指实现期望的治疗结果所需的量(在剂量、施用频率和特定施用方式的时间期限)。本公开的药物制剂的有效量可以根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及本公开的药物制剂在个体中引发期望响应的能力等因素的不同而变化。有效量也是其中治疗有益效果超过本公开的药物制剂的任何毒性或有害作用的量。
[0158]
本发明的药物制剂可以通过非肠道施用施用于患者。如医学领域所理解的，非肠道施用是指通过无菌注射器或一些其它药物递送系统包括自动注射器或输注泵将剂量注射到体内。与本公开的药物制剂一起使用的示例性药物递送系统描述在以下参考文献中，其公开内容通过引用整体明确地并入本文：lanigan等人于2013年3月7日提交的题为“infusion pump assembly”的美国专利公开号2014/0054883；deruntz等人于2006年2月3日提交的题为“medication dispensing apparatus with triple screw threads for mechanical advantage”的美国专利号7,291,132；jacobs等人于2006年9月18日提交的题为“medication dispensing apparatus with spring-driven locking feature enabled by administration of final dose”的美国专利号7,517,334；以及adams等人于2012年8月24日提交的题为“automatic injection device with delay mechanism including dual functioning biasing member”的美国专利号8,734,394。非肠道途径包括im、so和ip施用途径。
[0159]
附图简述
[0160]
图1示例当ph从约5.0变化至约7.0时化合物1在溶液中的浓度。
[0161]
图2a示例如通过尺寸排阻色谱法(sec)在包含10mm磷酸盐缓冲剂的制剂基质中测量的化合物1溶液制剂的总聚集物，其中nacl或甘油作为张度剂。
[0162]
图2b示例在包含10mm tris缓冲液的制剂基质中通过sec测量的化合物1溶液制剂的总聚集物，其中nacl或甘油作为张度剂。
[0163]
图3a示例当在多种ph条件下配制2mg/ml化合物1并且掺入原纤维时，作为ph函数的化合物1原纤维形成的风险。
[0164]
图3b示例当在各种ph条件下配制12mg/ml化合物1并且掺入原纤维时，作为ph函数的化合物1原纤维形成的风险。
[0165]
图4为rp-hplc色谱图，其示例了在40℃储存2mg/ml化合物1溶液制剂至多4周的热应力的影响。
[0166]
图5a为用0.5mg/ml edta配制的2mg/ml化合物1药物产品的rp-hplc色谱图，其示例过渡金属和h2o2的影响。
[0167]
图5b为不使用edta配制的2mg/ml化合物1药物产品的rp-hplc色谱图，其示例过渡金属和h2o2的影响。
[0168]
图6a示例在第0、1和3个月时如通过尺寸排阻色谱法(sec)测量的在5℃储存的化合物1制剂中的总聚集物。
[0169]
图6b示例在第0、1和3个月时如通过尺寸排阻色谱法(sec)测量的在25℃储存的化合物1制剂中的总聚集物。
[0170]
图6c示例在第0、1和3个月时如通过尺寸排阻色谱法(sec)测量的在30℃储存的化合物1制剂中的总聚集物。
实施例
[0171]
化合物1、2、3和4的制备
[0172]
化合物1
[0173]
hxaa2qgtftsdyskyldekkakefvewlleggpssg
[0174]
其中xaa2为aib；
[0175]
通过([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)1-co-(ch2)
18-co2h与k侧链的ε-氨基缀合来化学修饰20位的k；并且
[0176]
c-末端氨基酸被酰胺化为c-末端伯酰胺(seq id no：1)。
[0177][0178]
上图使用标准单字母氨基酸代码描绘了化合物1的结构，除外残基aib2和k20，其中这些氨基酸的结构已被扩展。
[0179]
化合物1如美国专利号9,938,335的实施例2中所述制备。可选择的合成方法描述在美国临时专利申请顺序号63/038,363中。
[0180]
化合物2
[0181]
hxaa2qgtftsdyskyldekkakefvewllsggpssg
[0182]
其中xaa2为aib；
[0183]
通过([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)2-co-(ch2)
18-co2h与k侧链的ε-氨基缀合来化学修饰20位的k；并且
[0184]
c-末端氨基酸被酰胺化为c-末端伯酰胺(seq id no：2)
[0185][0186]
上图使用标准单字母氨基酸代码描绘了化合物2的结构，除外残基aib2和k20，其中这些氨基酸的结构已被扩展。
[0187]
化合物2如美国专利号9,938,335的实施例4中所述制备。
[0188]
化合物3
[0189]
hxaa2qgtftsdyskyldekkakefvewlleggpssg
[0190]
其中xaa2为aib；
[0191]
通过([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)
1-co-(ch2)
16-co2h与k侧链的ε-氨基缀合来化学修饰20位的k；并且
[0192]
c-末端氨基酸被酰胺化为c-末端伯酰胺(seq id no：3)。
[0193][0194]
上图使用标准单字母氨基酸代码描绘了化合物3的结构，除外残基aib2和k20，其中这些氨基酸的结构已被扩展。
[0195]
化合物3如美国专利号9,938,335的实施例1中所述制备。
[0196]
化合物4
[0197]
hxaa2qgtftsdyskyldekkakefvewllsggpssg
[0198]
其中xaa2为aib；
[0199]
通过([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)
2-(γglu)
2-co-(ch2)
16-co2h与k侧链的ε-氨基缀合来化学修饰20位的k；并且
[0200]
c-末端氨基酸被酰胺化为c-末端伯酰胺(seq id no：4)。
[0201][0202]
上图使用标准单字母氨基酸代码描绘了化合物4的结构，除外残基aib2和k20，其中这些氨基酸的结构已被扩展。
[0203]
化合物4如美国专利号9,938,335的实施例3中所述制备。
[0204]
化合物1的合成
[0205]
正在人患者的临床试验中评估化合物1对ii型糖尿病的治疗。预期该药物应通过非肠道施用。评估化合物1在不同ph条件下的溶解度。
[0206]
材料
[0207]
本研究中使用的化合物1药物物质和赋形剂详述在表1中。所有其它实验室试剂按原样使用。
[0208]
表1：用于溶解性评估的材料
[0209][0210][0211]
方法
[0212]
在25℃在ph 5.0至ph 7.0评估化合物1的溶解度。所有溶液均包含10mm tris(1.21g/l)和0.05％edta(0.5g/l)。使用1n盐酸或浓tris碱储备溶液滴定溶液ph。
[0213]
通过uv-vis分光光度计(solovpe)在280nm处测量化合物1的浓度。uv-vis分光光度计通常用于定量溶液中的蛋白质或肽。280nm附近的特征性uv吸收光谱主要来自芳香族氨基酸，例如色氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)。当已知蛋白质或肽的摩尔消光系数时，使用beer-lambert定律、根据uv吸光度来准确定量蛋白质或肽的量，从而推定分子不含吸收uv的非蛋白质组分，例如结合的核苷酸辅因子、血红素或铁-硫中心。化合物1在10和13位上具有酪氨酸氨基酸残基并且在25位上具有色氨酸氨基酸残基，并且具有1.86ml
·
mg-1
·
cm-1
的消光系数(如通过pace方法计算)。通过该方法测量不同ph条件下的肽浓度适用于化合物1。
[0214]
结果
[0215]
化合物1的溶解度数据如表2中所示并且示例在图1中。
[0216]
表2：化合物1在ph 5.0-7.0(约)下的溶解度数据
[0217][0218]
随着ph从5.3增加至6.8，化合物1的溶解度显著增加。由于在进行本试验时化合物1的供应有限，因此，本研究没有在超过ph 6.8下进行。数据的外推表明化合物1的溶解度在7.0和更高的ph值下可以更高。数据表明化合物1应在ph 7.0或更高下配制，以确保化合物1在药物产品制造过程期间和/或在最终剂型中的足够溶解度。
[0219]
化合物1的溶液制剂的可行性研究
[0220]
进行研究以评估在溶液中配制化合物1的可行性。化合物1的溶解度数据表明其应在ph7.0或更高下配制。
[0221]
材料
[0222]
本研究中使用的化合物1api和赋形剂详述在表3中。所有其它实验室试剂按原样使用。
[0223]
表3：用于化合物1的可行性研究的材料
[0224][0225]
方法
[0226]
化合物1药物产品制剂如表4中所示。
[0227]
表4：化合物1药物产品制剂
[0228][0229]
将溶液通过0.22-mm pvdf过滤器过滤。在层流罩中，将溶液填充到玻璃小瓶中。将小瓶加盖，并且在5℃、25℃和30℃储存。抽取样品并且提交如下测试：(a)初始测试；(b)两周；和(c)一个月。通过尺寸排阻色谱法(sec)测量共价聚集物的形成。
[0230]
结果
[0231]
图2a和2b显示了25℃聚集物形成的数据。对于所有制剂，观察到快速聚集物形成。聚集动力学存在差异，这取决于ph、缓冲剂和张度剂。在25℃一个月后存在的聚集物的量表明，没有一种制剂作为可注射产品是可行的，即具有24个月的贮存期限和期望的使用持续时间。需要进一步研究以了解化合物1的降解机制。
[0232]
化合物1的溶液制剂的原纤维形成倾向和适当的ph条件
[0233]
化合物1与天然胰高血糖素共有一些序列相似性，并且认为该化合物可能倾向于原纤维形成。原纤维形成可导致天然蛋白质功能丧失，以及潜在的毒性功能获得，例如诱导免疫原性响应。评估化合物1形成原纤维的倾向性以确定其是否有助于化合物的降解。评估
作为溶液ph的函数的化合物1原纤维形成的风险。
[0234]
材料
[0235]
制备2mg/ml和12mg/ml的化合物1的溶液制剂，并且将溶液ph分别调节至7.5、7.8、8.0、8.3和8.5。制剂的组成示于表5中。所有其它实验室试剂按原样使用。
[0236]
表5：化合物1的溶液制剂的组成
[0237]
成分供应商批号浓度化合物1acorden/eli lillybo1704p0072mg/ml或12mg/mltriseli lillyc4699011.21mg/ml(10mm tris缓冲剂)edta二钠二水合物safccdbb4550v0.5mg/ml(0.05％)甘露醇eli lillyc47078646mg/ml(4.6％)盐酸，1nbfisher164777适量氢氧化钠，1nbfisher171239适量纯水hospira74-602-4b-01n/a-溶剂
[0238]a：调节化合物1的量以说明通过hplc报道在分析证书中的量。
[0239]b：足以调节ph的量
[0240]
化合物1原纤维种子的制备
[0241]
化合物1原纤维通过将500μl的2mg/ml和12mg/ml溶液在ph 7.5下在37℃温育箱中以恒定的端对端旋转温育72小时来产生。72小时后，溶液变浑浊。然后通过在浴超声波仪中超声处理200μl混浊溶液多个2-分钟循环直至溶液变澄清以产生原纤维种子。将2-mg/ml样品超声处理2个2-分钟循环，而将12-mg/ml样品超声处理6个2-分钟循环。
[0242]
用硫黄素t(tht)荧光测定法观察化合物1原纤维形成
[0243]
制备具有或不具有原纤维种子的化合物1溶液制剂。对于接种的样品，将5μl的2-mg/ml或12-mg/ml种子加入到150μl的相应药物产品中。对于未接种的样品，将5μl水加入到150μl化合物1药物产品中。还运行具有种子的缓冲液的阴性对照。
[0244]
使用硫黄素t(tht)测定(如schlein,m,the aaps journal 2017,19,(2),397-408中所述进行)观察化合物1的原纤维形成。简言之，将20μl每种样品加入黑色透明底384-孔板的三个孔中的每一个中。向每个孔中加入tht，最终tht浓度为4μm/孔。使用光学粘合剂膜密封板，并且加载到spectramax i3x(molecular devices)读板器中，每次温育至37℃。使用450nm的激发波长和480nm的发射波长每15分钟读板，持续36小时，读数之间振荡3秒。
[0245]
结果：通过tht荧光测定法的化合物1的原纤维形成
[0246]
原纤维是具有某些特定生物物理特性的蛋白质或肽的大的大分子自组装体。最值得注意的是单个肽骨架转化为富含β-折叠的构象。因此，可能会产生潜在的不期望的物理、化学和治疗风险。在试验上，原纤维形成可以视觉观察为增加的浊度、沉淀或胶凝化。
[0247]
在当前研究中，使用荧光光谱法评估作为溶液ph的函数的化合物1原纤维形成的风险，其中硫黄素t(tht)作为结合染料。tht是原纤维的有效荧光标志物。一旦选择性地与原纤维沉积物结合，则荧光信号表现出荧光亮度的显著增加。在多种ph条件(7.5、7.8、8.0、8.3和8.6)下配制化合物1，并且掺入预先制备的原纤维种子以加速原纤维形成动力学。图3a和3b示例在ph为8.0或更低的制剂中可以清楚地看到tht荧光信号的增加。化合物1原纤维形成显然对ph特别敏感。在低于7.8的ph下，原纤维的形成在两种浓度(2mg/ml和12mg/
ml)下都是快速的。当ph升高到8.0以上时，荧光信号保持平坦，表明不存在淀粉样蛋白原纤维。
[0248]
来自tht荧光测定的试验数据示例了化合物1在ph≤8.0下的原纤维形成风险。在ph》8.0时，即使在接种原纤维的情况下，也可以成功地防止原纤维形成。从减轻原纤维形成风险的角度来看，化合物1溶液制剂的适当ph条件在7.8以上，优选在8.0以上。此外，本研究还揭示，在产品贮存期限期间稳定的ph控制是关键的。可以使用具有足够缓冲强度的适合缓冲剂，例如tris。
[0249]
化合物1溶液制剂降解研究
[0250]
化合物1的氨基酸序列包含使肽潜在地易受化学和/或物理降解影响的残基。例如，化合物1分别在3位和4位具有谷氨酰胺(gln，q)和甘氨酸(gly，g)，其可能倾向于脱酰胺化。脱酰胺化主要受温度和ph的影响。化合物1还分别在1位和25位处具有组氨酸(his，h)和色氨酸(trp，w)，其可能是潜在的氧化热点。评估化合物1在溶液中氧化的风险。
[0251]
材料
[0252]
制备2mg/ml和ph 8.0的化合物1溶液制剂。研究制剂的组成示于表6中。所有其它实验室试剂按原样使用。
[0253]
表6：化合物1溶液制剂的组成
[0254][0255]a：得自cordenpharma的化合物1api(批号：bo1704p007)
[0256]b：调节化合物1的量以说明通过hplc报道在分析证书中的量。
[0257]
化合物1降解应力
[0258]
使化合物1溶液制剂经历多种条件，如表7中概括的。
[0259]
表7：化合物1溶液制剂的组成
[0260][0261]
结果和结论
[0262]
(a)热应力的影响
[0263]
制备化合物1溶液制剂并且在40℃储存至多4周。批号1和批号3的组合物包含
0.5mg/ml的edta(表6)，而批号2和批号4的组合物不包含edta。已知edta是有效的自由基清除剂。如果trp的氧化由ros引发，则推定0.5mg/ml edta的存在可以抑制观察到的化学降解。在适当的时间抽取样品，随后使用rp-hplc进行分析。
[0264]
rp-hplc色谱图显示在图4中。对于批号2和批号4，观察到保留时间约4分钟的新峰。基于历史数据，该新峰归因于trp的氧化。类似地，在约7分钟的保留时间处鉴定出另一个新峰，其对应于双重trp氧化。然而，在批号1和批号3的色谱图中在相同的保留时间不存在这些新峰。
[0265]
(b)过渡金属和h2o2的影响
[0266]
当化合物1制剂掺入2ppm的fe
3+
或1ppm的h2o2时，0.5mg/ml edta的存在抑制trp氧化，即在rp-hplc色谱图中在约4分钟和7分钟的保留时间处不存在新峰(图5a)。在没有edta的情况下，掺入2ppm的fe
3+
或1ppm的h2o2的样品产生trp氧化物(图5b)。掺有cu
2+
或ni
2+
的化合物1制剂未显示相同的降解程度。
[0267]
(c)为减少溶液中潜在的氧化而提出的缓解措施
[0268]
除酶促氧化外，溶液状态下蛋白质的氧化通常由自由基即活性氧物质(ros)引发。ros可以作为化学灭菌过程的结果、通过杂质形成或暴露于光而存在。例如，当过氧化氢(h2o2)用于灭菌时，残留的h2o2水平可以保持吸附在容器壁上并且可以引发氧化反应。当使用g-辐射进行灭菌时，通过辐射诱导的化学过程产生ros。过渡金属离子例如铁(fe
3+
)、铜(cu
2+
)或镍(ni
2+
)可以是ros的另外来源，并且通常在药物制剂中作为杂质发现，在api/药物物质或赋形剂中。它们也可以从用于储存和加工蛋白质产品的设备例如不锈钢容器中浸出。由于其固化过程，设备上的弹性体组分也可能包含金属。如果蛋白质溶液暴露于光，则uv光可以被芳香族氨基酸吸收，这导致ros的产生。
[0269]
尽管所有氨基酸侧链均倾向于氧化，但自由基倾向于优先攻击几个氨基酸残基，最值得注意的是甲硫氨酸(met，m)、半胱氨酸(cys，c)、组氨酸(his，h)或色氨酸(trp，w)。在化合物1的氨基酸序列中，在1位和25位处分别存在his和trp氨基酸，其使得肽潜在地倾向于氧化。
[0270]
降解研究表明，化合物1可能倾向于氧化。包含抗氧化剂，特别是自由基清除剂(例如，edta)是缓解溶液状态下的氧化的合理策略。
[0271]
化合物1溶液制剂稳定性研究
[0272]
本研究评估了在标称、加速和应激条件下，化合物1作为预填充注射器中的十二(12)种制剂中的溶液药物产品的稳定性。通过改变赋形剂类型、ph和添加原纤维来评估制剂的稳定性。用甘露醇、蔗糖和丙二醇作为赋形剂，同时改变ph(8.0、8.3和8.6)来评估化合物1的稳定性。本研究中使用的所有制剂列于表8中。将样品在5
±
3℃和25
±
2℃/60
±
5％相对湿度(rh)下储存至多6个月，并且在30
±
2℃/65
±
5％rh下储存至多2个月。完成的分析计划如下表9中所示。根据物理外观、rp-hplc、sec和aex描述在每个稳定性时间点进行的分析测试。在每个稳定性时间点执行测试方法。
[0273]
表8：化合物1溶液制剂配方的可行性研究
[0274][0275]1基于通过hplc测定的报道在分析证书中的量调节化合物1的量。将材料纯度报道为84％。因此，为了实现12mg/ml的终浓度，制备14.29mg/ml的浓度。
[0276]2向制剂中掺入原纤维种子。
[0277]
表9：测试计划可行性研究
[0278][0279]
材料
[0280]
本研究中使用的材料如下：
[0281]
i)化合物1测试样品，批号nb7956p7a-l,浓度为12mg/ml；
[0282]
ii)化合物1企业参考标准，批号rs1237,浓度为0.89mg/ml
[0283]
iii)化合物1原纤维种子，批号c241836-2018-0176-b1,浓度为12mg/ml
[0284]
iv)glass prefillable syringe platforms，bd neopak，c/n 47433010，批号4357108
[0285]
v)syringe plungers,west pharma,c/n 11402007，批号d000077885
[0286]
vi)edta二钠盐,二水合物,sigma,c/n e1644，批号slbv1798
[0287]
vii)甘露醇，j.t.baker，c/n 2553-01，批号212595
[0288]
viii)丙二醇，fisher chemical，c/n p355-1，批号180248
[0289]
ix)蔗糖，sigma，c/n s3929，批号slbv6651
[0290]
x)tris碱，sigma，c/n t6791，批号slbq2306v
[0291]
xi)aeris peptide xb-c18，2.6μm，4.6
×
250mm，c/n 00g-4505-e0，批号h18-303286，h19 051410，h19-079474，h19-084509，h19-131060和h19-131061
[0292]
xii)biopro iex qf，5μm，4.6
×
100mm，c/n qf00505-1046wp，批号14153
[0293]
tosoh tskgel g2000swxl，5μm，7.8
×
300mm，c/n 08540，批号008c-00776d和a02353-05a
[0294]
设备
[0295]
用于本研究的设备如下：
[0296]
i)agilent 1100/1200hplc系统
[0297]
ii)eisai机械观察灯型号mih-dx
[0298]
iii)fisher测光表型号06-662-63
[0299]
iv)hiac光微粒计数系统，型号9703
[0300]
v)metter toledo sevenmulti ph计
[0301]
vi)proteinsimple微流成像显微镜，带有bot 1的dpa 5200
[0302]
方法
[0303]
a)根据物理外观描述
[0304]
根据物理外观描述使用标题为“physical appearance testing for client 055 bioproduct drug substance and liquid drug product”的方案进行在所有时间点的测试。
[0305]
b)rp-hplc
[0306]
在所有时间点通过rp-hplc使用标题为“identity and purity determination of compound 1 by rp-hplc”的方案测定样品的纯度和蛋白质含量。
[0307]
c)尺寸排阻色谱法
[0308]
使用标题为“determination of compound 1 purity by size exclusion chromatography”的方案，通过尺寸排阻色谱法测定所有时间点的样品聚集物。
[0309]
d)阴离子交换色谱法
[0310]
使用标题为“determination of compound 1 charge heterogeneity by anion exchange chromatography”的方案，通过阴离子交换色谱测定所有时间点的样品的电荷异质性曲线。
[0311]
结果
[0312]
a)根据物理外观描述
[0313]
物理外观结果如表10中所示。在所有时间点和条件下，所有配制的样品均为微乳光、微黄色液体溶液。对于每种制剂，在初始、半个月或一个月时间点未观察到颗粒物。在两个月的时间点，在25
±
2℃/60
±
5％rh条件下在制剂4、5和12中几乎未观察到颗粒物，并且在30
±
2℃/65
±
5％rh条件下在制剂2、5和6中几乎未观察到颗粒物。在两个月时，在相应的稳定性条件下，在其余制剂中未观察到颗粒物。在三个月和六个月时间点，在两种稳定性条件下，在所有制剂中几乎未观察到颗粒物。
[0314]
表10：物理外观概述
[0315]
[0316]
[0317]
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
[0323][0324]
b)反相高效液相色谱法
[0325]
通过rp-hplc分析纯度的结果如表11中所示。在该组制剂中，初始平均主峰纯度百分比范围为97.3-97.5％，并且总相关物质(trs)的平均百分比范围为2.5-2.7％。在6m/5
±
3℃时间点和条件下的制剂组中，平均主峰纯度百分比范围为96.4-97.2％，并且trs的平均百分比范围为2.8-3.6％。在6m/25
±
2℃/60
±
5％rh时间点和条件下的制剂组中，平均主峰纯度百分比范围为89.4-93.1％并且trs的平均百分比范围为6.9-10.6％。在2m/30
±
2℃/65
±
5％rh时间点和条件下的制剂组中，平均主峰纯度百分比范围为92.0-94.3％，并且trs的平均百分比范围为5.7-8.0％。对于每种制剂，在加速稳定性条件下观察到主峰百分比下降和trs百分比增加的类似模式。与初始值相比，观察到在5
±
3℃条件下至多6个月主峰纯度的边际降低。主峰纯度百分比降低取决于ph值，对于ph值，较高的ph值表现出最大的变化。
[0326]
通过rp-hplc在所有时间点和条件下评估蛋白质含量的结果(表11)。以约12mg/ml
的单一浓度水平制备十二(12)种单独制剂中的每一种。在整个研究中，蛋白质含量范围为9.8-13.7mg/ml。因此，当在整个研究中将蛋白质浓度与初始分期时间点进行比较时，百分比标记要求范围为84-111％。在加速的六个月时间点条件下观察到降低的蛋白质浓度。更特别地，降低的含量取决于ph值，对于ph值，较高的ph值表现出最大的变化。
[0327]
表11：rp-hplc结果的概述
[0328]
[0329]
[0330]
[0331]
[0332]
[0333]
[0334][0335]
(c)尺寸排阻色谱法
[0336]
通过sec的纯度分析结果如表12中所示。在该组制剂中，初始单体百分比范围为98.8-99.2％，所有制剂的聚集物百分比为0.3％，并且片段百分比范围为0.5-0.9％。在6m/5
±
3℃时间点和条件下的制剂组中，单体百分比范围为98.7-99.0％，聚集物百分比范围为0.4-0.5％，并且片段百分比范围为0.6-0.9％。在6m/25
±
2℃/60
±
5％rh时间点和条件下的制剂组中，单体百分比范围为98.2-98.7％，聚集物百分比范围为0.7-1.0％，并且片段百分比范围为0.6-1.0％。在2m/30
±
2℃/65
±
5％rh时间点和条件下的制剂组中，单体百分比范围为98.4-99.0％，聚集物百分比范围为0.5-0.8％，并且片段百分比范围为0.5-1.0％。对于每种制剂，在所涉及的稳定性条件下观察到单体百分比下降以及聚集物和片段百分比增加的类似模式。虽然边际变化可能归因于方法可变性，但基于蔗糖的制剂表现出最大的单体百分比变化，而基于甘露醇的制剂表现出最小的单体百分比变化。此外，对于每种赋形剂类型，较高的ph值表现出最大的变化，丙二醇除外。此外，当比较具有和不具有原纤维种子的相同制剂组分时，具有原纤维种子的那些总体上表现出更高的纯度，特别是在加速条件下。
[0337]
总之，数据显示在加速条件下储存6个月后最小的聚集物和片段变化。
[0338]
表12：sec结果的概述
[0339]
[0340]
[0341]
[0342]
[0343][0344]
(d)阴离子交换色谱法
[0345]
通过aex测定的电荷异质性的结果如表13中所示。在该组制剂中，初始主峰百分比范围为98.1-98.7％，碱性变体的百分比范围为0.6-1.1％，并且酸性变体的百分比范围为0.6-0.8％。在6m/5
±
3℃时间点和条件下的制剂组中，主峰百分比范围为93.3-97.1％，碱性变体的百分比范围为0.5-0.9％，并且酸性变体的百分比范围为2.3-6.0％。在6m/25
±
2℃/60
±
5％rh时间点和条件下的制剂组中，主峰百分比范围为86.5-91.6％，碱性变体的百分比范围为0.9-1.9％，并且酸性变体的百分比范围为7.3-11.8％。在2m/30
±
2℃/65
±
5％rh时间点和条件下的制剂组中，主峰百分比范围为92.4-93.3％，碱性变体的百分比范围为1.0-1.4％，并且酸性变体的百分比范围为5.3-6.5％。对于每种制剂，在所涉及的稳定性条件下观察到主峰百分比下降以及酸性和碱性变体百分比增加的类似模式。
[0346]
表13：aex结果的概述
[0347]
[0348]
[0349]
[0350][0351]
抗氧化剂对化合物1稳定性的影响
[0352]
引言
[0353]
降解研究表明，化合物1可能倾向于氧化。包含edta(一种常用的抗氧化剂)可有效减轻溶液状态下的氧化。其它赋形剂也可以被认为减少氧化。在本研究中，评估edta、柠檬酸盐和甲硫氨酸作为化合物i溶液制剂的抗氧化剂。包括不含任何抗氧化剂的样品作为对照。
[0354]
材料和方法
[0355]
用于本研究的化合物1api和赋形剂详述在表14中。所有其它实验室试剂均按原样使用。
[0356]
表14：研究材料
[0357][0358]a：调节化合物1的量以说明通过hplc的报道在分析证书中的量。
[0359]b：足以调节ph的量
[0360]
包含所研究的化合物1的制剂如表15中所示。
[0361]
表15：化合物i制剂组成
[0362][0363]
将溶液通过0.22mm pvdf过滤器过滤。在层流罩中，将溶液填充到玻璃小瓶中。将小瓶加盖，并且在5℃、25℃和30℃储存。制备包含化合物1的四种制剂以评估抗氧化剂(即edta、柠檬酸盐和甲硫氨酸)的稳定功效。还包括不含任何抗氧化剂的对照样品(表15，批号25-1、25-2、25-3和25-4)。随后，制备含有较高浓度甲硫氨酸(100mm与10mm)的第五样品以评估甲硫氨酸浓度的影响(表15，批号26)。制备样品，并且在5℃、25℃和30℃储存至多3个
月。在适当的时间，进行稳定性指示测定以评估物理和化学稳定性。
[0364]
化合物i制剂的外观
[0365]
通过目视检查三个月后化合物1制剂的外观显示制剂之间的明显差异(表15)。在5℃，溶液是无色的。然而，在25℃和30℃，对照和含甲硫氨酸的样品为微黄色，而含edta和柠檬酸盐的样品保持无色。颜色变化通常是化学降解的指示。在5℃，无论稳定剂如何，化学降解速率都可能足够慢，因此，所有溶液都呈现无色。在升高的温度下，发散的降解动力学反映了抗氧化剂的作用。
[0366]
表16：三(3)个月后化合物1制剂的外观
[0367][0368]
根据rp-hplc的抗氧化剂对化合物1的化学稳定性的影响
[0369]
表17中的数据显示化合物1的化学降解在冷藏条件下不是显著的。在25℃和30℃，稳定功效存在显著差异。在没有任何抗氧化剂的情况下，对照样品显示出快速的化学降解。与edta和柠檬酸盐相比，甲硫氨酸(单克隆抗体制剂中常用的抗氧化剂)表现出较低的稳定功效(10mm或100mm)。化学降解被edta或柠檬酸盐抑制，edta比柠檬酸盐稍微更有效。
[0370]
表17：通过rp-hplc的化合物1总杂质
[0371]
[0372][0373]
来自上述试验的数据表明，trp的氧化是主要的降解途径之一。表18中的数据显示可能的trp氧化几乎完全被edta或柠檬酸盐抑制，从甲硫氨酸可获得的效果较小。
[0374]
表18：通过rp-hplc的涉及trp氧化的化合物1杂质
[0375][0376]
抗氧化剂对化合物1物理稳定性的影响
[0377]
通过尺寸排阻色谱(sec)评估共价聚集物的形成。历经三个月通过sec测量的总聚集物对于在5℃储存的小瓶显示在图6a中，对于在25℃储存的小瓶显示在图6b中，并且对于在30℃储存的小瓶显示在图6c中。所有制剂在5℃表现良好。在25℃和30℃，edta和柠檬酸盐显示出显著的稳定功效。
[0378]
除了sec之外，使用光遮蔽(hiac)和流动成像(mfi)方法测试三个月样品的亚可见颗粒物质。试验数据如表19中所示。没有观察到明显的趋势。通过hiac的颗粒计数均在≥10μm和≥25μm测量的规格内。
[0379]
表19：通过sec的化合物1总聚集物
[0380]
[0381]

技术特征：
ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-leu-ser-gly-gly-pro-ser-ser-gly其中xaa2为aib；通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γβ-glu)2-co-(ch2)16co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：4)。3.权利要求1或权利要求2的药物制剂，其中化合物具有下式：his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-val-glu-trp-leu-leu-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly其中xaa2为aib；通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)-co-(ch2)18co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：1)。4.权利要求1-3任一项的药物制剂，其中制剂包含1mg/ml-100mg/ml的化合物。5.权利要求1-4任一项的药物制剂，其中缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂和三(羟甲基)氨基甲烷(或2-氨基-2-羟甲基-丙-1，3-二醇[(hoch2)3cnh2])缓冲剂。6.权利要求1-5任一项的药物制剂，其中制剂包含1mm-20mm的缓冲剂。7.权利要求1-6任一项的药物制剂，其中缓冲剂为三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲剂。8.权利要求7的药物制剂，其中制剂包含10mm tris缓冲剂。9.权利要求1-8任一项的药物制剂，其中张度剂选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、丙二醇、甘油、氯化钠和盐酸精氨酸。10.权利要求1-9任一项的药物制剂，其中制剂包含5mg/ml-150mg/ml的张度剂。11.权利要求1-10任一项的药物制剂，其中张度剂为甘露醇。12.权利要求11的药物制剂，其中制剂包含45-55mg/ml的甘露醇。13.权利要求1-12任一项的药物制剂，其中抗氧化剂选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂。14.权利要求1-13任一项的药物制剂，其中制剂包含0.05-10.0mg/ml的抗氧化剂。15.权利要求1-14任一项的药物制剂，其中抗氧化剂选自edta、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯(bht)、丁羟茴醚(bha)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和n-乙酰基半胱氨酸。16.权利要求15的药物制剂，其中抗氧化剂为edta。17.权利要求16的药物制剂，其中制剂包含0.2-1.0mg/ml的edta。18.权利要求16或权利要求17的药物制剂，其中制剂包含0.5mg/ml的edta。19.权利要求15的药物制剂，其中抗氧化剂为柠檬酸。20.权利要求19的药物制剂，其中制剂包含5mm-15mm柠檬酸。21.权利要求18或19的药物制剂，其中制剂包含8mm-12mm柠檬酸。22.权利要求19-21任一项的药物制剂，其中制剂包含10mm柠檬酸。23.权利要求1-22任一项的药物制剂，其中制剂的ph为8.0-8.6。24.权利要求1-23任一项的药物制剂，其中制剂的ph为8.0-8.3。25.权利要求1的药物制剂，其包含：
(i)1mg/ml-100mg/ml的下式化合物：his-xaa2-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-glu-lys-lys-ala-lys-glu-phe-valglu-trp-leu-leu-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly其中xaa2为aib；通过使lys侧链的ε-氨基与([2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γ-glu)-co-(ch2)18co2h缀合来化学修饰20位的lys；并且c-末端氨基酸被酰胺化(seq id no：1)；(ii)10mm的tris缓冲剂；(iii)46mg/ml的甘露醇；(iv)0.5mg/ml的edta，其中制剂的ph为8.0-8.3。26.治疗和/或预防2型糖尿病的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的药物制剂。27.治疗和/或预防肥胖症的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的药物制剂。28.治疗和/或预防非酒精性脂肪肝病(nafld)的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的药物制剂。29.治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的药物制剂。30.权利要求1-25任一项的药物制剂，其用于治疗和/或预防2型糖尿病。31.权利要求1-25任一项的药物制剂，其用于治疗和/或预防肥胖症。32.权利要求1-25任一项的药物制剂，其用于治疗和/或预防nafld。33.权利要求1-25任一项的药物制剂，其用于治疗和/或预防nash。34.权利要求1-25任一项的药物制剂在制备用于治疗2型糖尿病的药物中的用途。35.权利要求1-25任一项的药物制剂在制备用于治疗肥胖症的药物中的用途。36.权利要求1-25任一项的药物制剂在制备用于治疗nafld的药物中的用途。37.权利要求1-25任一项的药物制剂在制备用于治疗nash的药物中的用途。

技术总结
用于治疗双重GLP-1受体/胰高血糖素受体激动剂的稳定药物制剂和使用此类稳定药物制剂的方法。剂的方法。剂的方法。


技术研发人员：D
受保护的技术使用者：伊莱利利公司
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2023/8/24