低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法与流程

1.本发明涉及血液检测技术领域，具体涉及低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法。


背景技术：

2.人体血液中正常血红蛋白（hb）有三种血红蛋白亚组分组成：血红蛋白a（hba）、血红蛋白f（hbf）和血红蛋白a2（hba2）。成人血红蛋白中主要含有血红蛋白a（hba），其又由两种亚组分组成：糖化血红蛋白（hba1）（5%-7%）和非糖化血红蛋白（hba0）（90%）。糖化血红蛋白（hba1）也有三种亚组分，分别为：hba1a、hba1b和hba1c。其中，hba1c约占hba1的75%-80%，且结构稳定，能反应测定前两到三个月的平均血糖水平。因此被用作糖尿病控制的监测指标。且受抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素干扰小。
3.目前，临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有高效液相色谱法、电泳法、亲和层析法和免疫法等。其中，高效液相离子层析法（hplc）被公认为金标准。
4.质控品是一类在临床检验工作中广泛应用的物质，其作用是评估体外诊断设备及试剂的性能是否符合原先设置的标准。临床检验中要求糖化血红蛋白质控品必须覆盖正常测试范围及异常测试范围。对于正常人的测试结果一般在4%-6%，高血糖和糖尿病病人的测试结果一般在6%-16%，因此，糖化血红蛋白质控品大部分生产厂家通常会提供两个水平的质控品，低水平质控品（4%-6%）和高水平质控品（8%-10%），但是所谓的低水平质控品是落在了正常值参考范围内的质控品，并非真正的低水平范围（2%-4%）的质控品，目前在低于正常范围的商业化质控品较少，对于检出限的检测没有衡量的标准，为促进整个检测范围的质量标准控制，需制备低于正常范围的质控品。
5.糖化血红蛋白质控品的制备多以人全血或猪血或猪血红蛋白为原料，经过离心、洗涤、破碎细胞，去除杂质及冻干等多个步骤制成。首先，对血液样本进行离心处理，获得红细胞。利用洗涤液对所述红细胞进行洗涤，形成红细胞悬液。在洗涤后的红细胞加入反应液进行糖基化或进行亲和层析获取高糖基化血红蛋白溶液，再通过纯化、混合、离心等操作配制不同水平的质控品。最后在处理好的红细胞悬液中加入稳定剂、冻干保护剂，制成液体或冻干的糖化血红蛋白质控物。
6.综上，虽然制备糖化血红蛋白质控品的方法各有不同，但，低水平糖化血红蛋白质控品hba1c测定值多在4%-6%之间，且需要有配套试剂或配套仪器才可用于质量控制，不能满足参考值下限4%范围外的质控测试要求。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法，本发明提供的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品稳定性高，制备方法简单且原料方便易获取，可满足正常参考值下限范围外的质控测试要求。
8.本发明提供了制备低水平糖化血红蛋白质控品的试剂组合，包括溶血剂和冻干保
护剂；所述溶血剂包括磷酸盐缓冲液、叠氮化钠和表面活性剂，所述表面活性剂包括曲拉通、脱氧胆酸钠和sds中的至少一种；所述冻干保护剂包括nacl、bsa、tween-80、dtt、葡萄糖、海藻糖、乳糖、vc、tris-hcl、hepes和甘氨酸中的至少一种。
9.与其他试剂组合相比，本发明提供的试剂组合为低水平糖化血红蛋白质控品的制备提供了更加有效的溶血效果以及更稳定的冻干体系，能够更大程度的保证冻干后血红蛋白质控品的稳定性、灵敏度和特异性，从而获得更准确的技术效果。
10.在一些实施例中，所述溶血剂包括磷酸盐缓冲液、叠氮化钠和曲拉通，所述磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；所述冻干保护剂包括nacl、bsa、tween-80、海藻糖、hepes和甘氨酸。
11.相比较其他试剂，上述各组分之间相互配合紧密，兼容性强，能够更有效的配合血红蛋白质控品的制备，从而获得更准确的技术效果。
12.在一些实施例中，所述溶血剂包括0.5~3mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~1.5mmol/l叠氮化钠和0.2~1.0mmol/l曲拉通；所述冻干保护剂包括0.1~0.3mol/l nacl、2wt%~5wt% bsa、0.1wt
‰
~0.2wt
‰ꢀ
tween-80、2wt%~5wt%海藻糖、20~100mmol/l hepes和2wt%~5wt%甘氨酸。
13.在一些具体实施例中，所述溶血剂包括0.4mmol/l曲拉通，1.0mmol/l磷酸二氢钠、2.5mmol/l磷酸氢二钠和0.5mmol/l叠氮化钠；所述冻干保护剂包括0.15mol/l nacl、2wt%bsa、0.1wt
‰
tween-80、5wt%海藻糖、60mmol/l hepes和4wt%甘氨酸。
14.实验表明，在此浓度下，所述试剂组合配合血红蛋白质控品的制备效果最佳。
15.本发明提供了低水平糖化血红蛋白质控品的制备方法，包括如下步骤：步骤1：取正常血液样本，经离心、去除血浆和血小板后的获得的溶液，经pbs缓冲液清洗、离心、去除上清后获得红细胞悬液；步骤2：所述红细胞悬液与所述的试剂组合中的所述溶血剂混合，经离心、去除沉淀后获得血红蛋白溶液；步骤3：所述血红蛋白溶液与所述的试剂组合中的所述冻干保护剂混合后，获得所述低水平糖化血红蛋白质控品。
16.在一些实施例中，所述血液样本包括人血样本和猪血样本；所述步骤1中所述红细胞悬液包括人红细胞悬液和猪红细胞悬液，；所述步骤2中所述血红蛋白溶液包括人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液；所述步骤3中，所述血红蛋白溶液中包括体积比为1：（0.1~10）的人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液。
17.实验表明，牛血样本和牛血红蛋白与人血液样本的出峰时间及目标蛋白的差异性较大，不能真实反应临床样本的检测结果，在质控分析和使用中不能作为产品稳定性的控制物质。从出峰个数与总峰面积来看，人血红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白配置的出峰个数较相应的血液样本少，峰面积较低，目标蛋白处峰面积小，因此选择人血样本和猪血样本进行混合测试能够更有效的实现低水平糖化血红蛋白质控品的制备，从而获得更准确的技
术效果。
18.进一步地，所述人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液中血红蛋白的浓度均为0.1~0.2g/ml，所述人血红蛋白溶液检测ngsp糖化血红蛋白hba1c结果为4%-6%，所述猪血红蛋白溶液检测ngsp结果为1%-3%。
19.更进一步地，所述步骤1中，所述离心的条件为：2000~4000 rpm/min离心10~20min，所述溶液与所述pbs缓冲液的体积比为1:（1~5），所述清洗的次数为2~5次；所述步骤2中，所述红细胞悬液与所述溶血剂的体积比为1：（0.5~2）；所述步骤3中，所述血红蛋白溶液与所述冻干保护剂的体积比为1：（1~5）。
20.在一些实施例中，所述人血样本和所述猪血样本在采集时需要使用到抗凝剂，以防止采集的血液将很快凝成固体，不能用于后续离心处理等工序。所述抗凝剂包括edta、枸橼酸钠和肝素中的至少一种。
21.在另一些实施例中，还包括冻干的步骤，所述冻干包括取所述低水平糖化血红蛋白质控品，经真空冷冻干燥获得冻干态的所述低水平糖化血红蛋白质控品。
22.本发明提供了所述的制备方法制得的低水平糖化血红蛋白质控品。
23.本发明还提供了所述的制备方法制得的低水平糖化血红蛋白质控品在制备糖化血红蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。
24.本发明提供了包括溶血剂和冻干保护剂的试剂组合以及采用所述试剂组合制备的低水平糖化血红蛋白质控品，本发明还提供了所述低水平糖化血红蛋白质控品的制备方法及其应用。本发明提供的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品稳定性高，以正常人红细胞和猪血红蛋白或新鲜猪血为原料，原料方便易获取，并可涵盖医学决定水平处低值范围外的测试需求，同时制备方法简单，可进行批量工业化生产。本发明提供的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品在2~8℃存放可稳定保存2年，开瓶复溶后2~8℃存放可稳定15天，-20℃存放可稳定60天。
附图说明
25.图1示低水平冻干态糖化血红蛋白质控品高效液相色谱图。
具体实施方式
26.本发明提供了低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
27.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
28.实施例1
29.糖化血红蛋白能反应测定前人体内两到三个月的平均血糖水平，糖化血红蛋白监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的“金指标”。糖化血红蛋白质控品采用血红蛋白制备，内含正常血红蛋白和冻干保护剂。使用离子交换高效液相色谱（hplc）法进行三梯度洗
脱，hba1a（糖化血红蛋白a）、hba1b（糖化血红蛋白b）、hbf（血红蛋白f）、la1c（不稳定糖化血红蛋白） 、a1c（稳定糖化血红蛋白）、hba0（血红蛋白a0）逐次洗脱开来，通过单波长（415nm）可见光比色的方法在线连续测定洗脱物的吸光度，得到相应的血红蛋白层析图谱。
30.该质控品主要用于糖化血红蛋白分析仪及配套试剂的检验，供对人抗凝全血样本中糖化血红蛋白项目检测时，进行室内质量控制。
31.本实施例的主要目的是筛选最佳原材料，使原材料符合设计性能指标，而且生产厂家能够稳定供应糖化血红蛋白质控品试剂盒中主要原材料包含血红蛋白和冻干保护剂，冻干保护剂由海藻糖、牛血清白蛋白及盐类物质等。此研究资料需要验证筛选人血红蛋白及冻干保护剂的组合。主要设备为糖化血红蛋白分析仪sgh-200。
32.1、原料筛选血红蛋白的筛选如下表1所示，筛选不同来源血红蛋白及配比的有效性。
33.表1溶血剂主要成分的筛选如下表2所示，试验不同溶血剂对产品结果的影响。
34.表2冻干保护剂的筛选如下表3所示，试验加入不同冻干保护剂对产品结果的影响。
35.表3
2、筛选结果2.1不同来源血红蛋白的筛选a.将分别来源于人血样本、人血红蛋白、猪血样本、猪血红蛋白和来源于牛的血红蛋白进行检测。与人血液样本进行对比，筛选可作为主要原材料的可行性，结果如表4所示。
36.表4试验结果显示，牛血样本和牛血红蛋白与人血液样本的出峰时间及目标蛋白的差异性较大，不能真实反应临床样本的检测结果，在质控分析和使用中不能作为产品稳定性的控制物质。从出峰个数与总峰面积来看，人血红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白配置的出峰个数较相应的血液样本少，峰面积较低，目标蛋白处峰面积小，综合检测结果及成本情况来看，可选择人血样本和猪血样本进行混合测试。
37.b.人血样本（人血红蛋白）与猪血样本（猪血红蛋白）以不同比例混合测试结果如表5所示。
38.表5
结果表明，配置不同混合比例的血红蛋白溶液进行糖化血红蛋白分析后，出峰个数只有与人血样本混合后能够与临床样本相同的6个峰，且混合比例从10:1-1:10均可达到2%-4%的低值质控需求。
39.2.2 不同溶血剂对产品结果的影响分别使用三种不同的溶血剂进行样本溶血测试，溶血剂作用是将红细胞破裂，释放出血细胞中的血红蛋白，因此溶血剂效果反应在相同条件下检测结果中的总峰面积。将同一人血样本分别取1ml加入1ml不同溶血剂后进行糖化血红蛋白分析仪检测，结果如表6所示。
40.表6从总峰面积结果显示溶血剂1和3溶血较2更充分，出峰个数上来分析溶血剂3对出峰个数有影响，可能因其为离子型表面活性剂，对洗脱过程产生影响的原因。因此优选溶血剂1，即以曲拉通为主要成份的溶血剂。
41.4.3 冻干保护剂对结果影响的分析配置好的人血样本与猪血样本混合液分别与冻干保护剂a、b、c和pt按照1:1的比例混合，试验其对产品冻干前和冻干后有效性和稳定性的影响，结果如表7与表8所示。
42.表7 冻干前检测结果
从表7冻干前与为加入冻干保护剂的原液对比检测结果来看，在糖化值上，加入冻干保护剂对结果影响不大，相对偏差均不超过
±
8%，从出峰时间和出峰个数来看冻干保护剂a与原液最接近，峰面积均比原液减少一半，因为稀释后其血红蛋白的浓度降低的原因。混合后按照相同的冻干程序进行冻干：预冻温度-40℃ 4h，预冻结束后按照5-10℃一个梯度进行升温升华，真空度控制在150bar，-30℃、-20℃、-10℃、0℃和10℃分别保持2h，20℃保持2h，并将真空度降至50bar。
43.表8 冻干后检测结果
冻干复溶后外观呈均匀的红色液体状态，未出现沉淀不溶解状态，从复溶后外观
来看均符合要求，上机试验结果显示，表8中分别使用四个冻干保护剂冻干后，从糖化值、出峰时间、总峰面积三方面来看其重复性冻干保护剂a结果最好，符合产品设计要求。
44.通过原材料的筛选实验研究，最终确定糖化血红蛋白质控品的主要原材选择人血样本与猪血样本混合，冻干保护剂选择冻干保护剂a，溶血剂以曲拉通为主要成份。
45.实验验证，溶血剂中包括0.5~3mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~1.5mmol/l叠氮化钠和0.2~1.0mmol/l曲拉通，冻干保护剂中包括0.1~0.3mol/l nacl、2wt%~5wt% bsa、0.1wt
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~0.2wt
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tween-80、2wt%~5wt%海藻糖、20~100mmol/l hepes和2wt%~5wt%甘氨酸时，溶血剂与冻干保护剂制备的低水平糖化血红蛋白质控品差异较小。
46.实施例2 制备低水平冻干态糖化血红蛋白质控品具体包括下述步骤：第一步，配置磷酸盐缓冲液（pbs），ph调整在6-8范围内。配置溶血剂，除pbs外，添加有表面活性剂和防腐剂，表面活性剂选择曲拉通，防腐剂选择叠氮化钠。配置冻干保护剂，包含nacl、bsa、tween-80、海藻糖、hepes和甘氨酸等组分。
47.第二步，采集正常人枸橼酸抗凝全血样本和枸橼酸抗凝猪血样本，根据样本量分别放置于2-200ml离心管中，以2000-4000 rpm/min离心10-20 min，用移液枪小心吸去上清血浆和中间血小板层，得到下层红细胞悬液。
48.第三步，按体积比1:1-1:5加入pbs，上下颠倒混匀洗涤，按照2000-4000 rpm/min离心10-20min，用移液枪小心吸去上清，再次加入pbs洗涤，重复2-5次，弃上清，得到人红细胞悬液和猪红细胞悬液；第四步，按体积比1:0.5-1：2分别在人和猪红细胞悬液加入溶血剂，震荡混匀，再以4000-8000 rpm/min转速离心10-20min，弃沉淀，得到人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液；分别测定血红蛋白浓度在0.1-0.2g/ml，测试人糖化血红蛋白结果在4%-6%，猪糖化血红蛋白结果在1%-3%。
49.第五步，人血红蛋白与猪血红蛋白按照1:10-10:1的比例混合；第六步：混合后血红蛋白溶液与冻干保护剂按照体积比1:1-1:5混匀，测定hba1c结果为2%-4%，得到低水平糖化血红蛋白质控品。
50.第七步：配制好的质控溶液分装于西林瓶，置于冻干机中进行真空冷冻干燥，得到低水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃。
51.制备的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品高效液相色谱图检测结果如图1所示。
52.实施例3 本发明制备的质控品的性能测定
53.将实施例2制备的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品依次进行均匀性检测、4℃开瓶稳定性、-20℃开瓶稳定性，37℃加速稳定性考察，具体测定数据见下表9~11所示。
54.表9 sgh-200糖化血红蛋白分析仪测定质控品均匀性
55.表10 sgh-200糖化血红蛋白分析仪测定质控品开瓶稳定性
56.表11 sgh-200糖化血红蛋白分析仪测定质控品加速稳定性
57.结论：制备的低水平质控品性质稳定，均匀性变异系数在5%范围内，2-8℃存放可稳定保存2年，开瓶复溶后放置4℃可稳定15天，复溶后放置-20℃可稳定60天；37℃加速14天测定hba1c相对偏差均在6%以内。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.制备低水平糖化血红蛋白质控品的试剂组合，其特征在于，包括溶血剂和冻干保护剂；所述溶血剂包括0.5~2mmol/l磷酸二氢钠、1.0~3.0mmol/l磷酸氢二钠、0.5~1.5mmol/l叠氮化钠和0.2~1.0mmol/l曲拉通；所述冻干保护剂包括0.1~0.3mol/l nacl、2wt%~5wt% bsa、0.1wt
‰
~0.2wt
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tween-80、2wt%~5wt%海藻糖、20~100mmol/l hepes和2wt%~5wt%甘氨酸。2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，其特征在于，所述溶血剂包括1.0mmol/l磷酸二氢钠、2.5mmol/l磷酸氢二钠、0.5mmol/l叠氮化钠和0.4mmol/l曲拉通；所述冻干保护剂包括0.15mol/l nacl、2wt%bsa、0.1wt
‰
tween-80、5wt%海藻糖、60mmol/l hepes和4wt%甘氨酸。3.低水平糖化血红蛋白质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取正常血液样本，经离心、去除血浆和血小板后的获得的溶液，经pbs缓冲液清洗、离心、去除上清后获得红细胞悬液；步骤2：所述红细胞悬液与权利要求1或2所述的试剂组合中的所述溶血剂混合，经离心、去除沉淀后获得血红蛋白溶液；步骤3：所述血红蛋白溶液与权利要求1或2所述的试剂组合中的所述冻干保护剂混合后，获得所述低水平糖化血红蛋白质控品。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述血液样本包括人血样本和猪血样本；所述步骤1中所述红细胞悬液包括人红细胞悬液和猪红细胞悬液，；所述步骤2中所述血红蛋白溶液包括人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液；所述步骤3中，所述血红蛋白溶液中包括体积比为1：（0.1~10）的人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液中血红蛋白的浓度均为0.1~0.2g/ml，所述人血红蛋白溶液检测ngsp糖化血红蛋白hba1c结果为4%-6%，所述猪血红蛋白溶液检测ngsp结果为1%-3%。6.根据权利要求3~5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述离心的条件为：2000~4000 rpm/min离心10~20min，所述溶液与所述pbs缓冲液的体积比为1:（1~5），所述清洗的次数为2~5次；所述步骤2中，所述红细胞悬液与所述溶血剂的体积比为1：（0.5~2）；所述步骤3中，所述血红蛋白溶液与所述冻干保护剂的体积比为1：（1~5）。7.根据权利要求3~6任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括冻干的步骤，所述冻干包括取所述低水平糖化血红蛋白质控品，经真空冷冻干燥获得冻干态的所述低水平糖化血红蛋白质控品。8.权利要求3~7任一项所述的制备方法制得的低水平糖化血红蛋白质控品。9.权利要求3~7任一项所述的制备方法制得的低水平糖化血红蛋白质控品在制备糖化血红蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及血液检测技术领域，具体涉及低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法。本发明提供了包括溶血剂和冻干保护剂的试剂组合以及采用所述试剂组合制备的低水平糖化血红蛋白质控品，本发明还提供了所述低水平糖化血红蛋白质控品的制备方法及其应用。本发明提供的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品稳定性高，以正常人红细胞和猪血红蛋白或新鲜猪血为原料，原料方便易获取，并可涵盖医学决定水平处低值范围外的测试需求，同时制备方法简单，可进行批量工业化生产。可进行批量工业化生产。


技术研发人员：朱颜敏 李晴 任晓敏 杨雷 王建新
受保护的技术使用者：山东新华医疗器械股份有限公司
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/8/24