一种具有溶瘤活性的多肽化合物及其制备方法与应用

1.本发明涉及多肽化合物技术领域，尤其涉及一种具有溶瘤活性的多肽化合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.目前，基于溶瘤病毒的免疫治疗成为当前肿瘤治疗中最有前景的疗法之一，溶瘤治疗不仅可以直接溶解肿瘤细胞，还可以激发全身性抗肿瘤免疫(包括细胞因子释放和淋巴细胞激活)。尽管溶瘤病毒通常经过工程改造以降低毒力和传染性以用于临床转化，但基于病毒的生物制剂仍然存在固有的生物安全风险，包括自我复制、器官感染和功能障碍等，甚至产生突变株。因此，在迫切需要开发高效且安全的溶瘤药物来用于临床抗肿瘤治疗，以消除生物安全风险。
3.现有的受天然蛋白质启发设计并合成的溶瘤肽ltx-315具有与溶瘤病毒相似的药理活性，表现出诱导溶瘤肿瘤细胞死亡和免疫应答的药效，且没有溶瘤病毒的安全问题。然而，由于ltx-315体内注射后疗效不足，溶瘤肽仍然难以满足临床需求。进而仅需提出一种新的具有溶瘤活性的多肽化合物用于抗肿瘤治疗。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提供一种具有溶瘤活性的多肽化合物及其制备方法与应用，旨在解决现有合成的溶瘤肽用于抗肿瘤细胞治疗效果无法达到预期的技术问题。
5.为实现上述目的，本发明提供一种具有溶瘤活性的多肽化合物，所述化合物的结构通式为：其中，r1为精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸中的至少一种，r2为碱性的赖氨酸，r3为烷烃、胆固醇、硫辛酸或其衍生物中的其中一种，r1、r2的构型为l型或d型。
6.可选地，所述方法包括以下步骤：
7.步骤1，将预设质量的甲氧基保护的赖氨酸与叔丁氧羰基保护的赖氨酸先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第一次缩合反应，然后进行脱叔丁氧羰基反应，得到中间体a；
8.步骤2，将预设质量的中间体a与含有保护基团的亲水性氨基酸先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第二次缩合反应，然后进行脱甲酯反应，得到中间体b，其中亲水性氨基酸为精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸中的至少一种；
9.步骤3，将预设质量的疏水性反应物与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第三次缩合反应，然后进行脱叔丁氧羰基反应，得到中间体c，所述疏水性反应物为烷烃、胆固醇、硫辛酸或其衍生物中的其中一种；
10.步骤4，将预设质量的中间体b、中间体c依次先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂
进行第四次缩合反应，然后进行脱保护基团反应，得到溶瘤活性的多肽化合物；
11.其中，包含精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸的反应物均为l型或d型。
12.可选地，在所述步骤1中，甲氧基保护的赖氨酸是指单个赖氨酸的羧基端连接有甲氧基，叔丁氧羰基保护的赖氨酸氨是指单个赖氨酸氨基端连接有叔丁氧羰基；
13.在所述步骤2中，所述保护基团包括甲氧基、叔丁氧羰基、2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基和9-芴甲氧羰基。
14.可选地，在所述步骤2中，含有保护基团的亲水性氨基酸包括两端由甲氧基与叔丁氧羰基保护的赖氨酸、两端由叔丁氧羰基与2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基保护的精氨酸、两端由甲氧基与叔丁氧羰基保护的色氨酸、两端由9-芴甲氧羰基与叔丁氧羰基保护的谷氨酸中的至少一种。
15.可选地，在所述步骤3中，疏水性反应物与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺先在1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂中混合，并在惰性气氛中加入二氯甲烷溶解，然后在冰浴中加入预设量的n,n-二异丙基乙胺，室温反应24-30小时，纯化后得到中间体c1；
16.将中间体c1溶于二氯甲烷中，并加入预设量三氟乙酸溶液中反应10-12小时，去除溶剂后用乙醚沉淀，得到中间体c。
17.可选地，加入的三氟乙酸溶液与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺中的摩尔比为(10-12)：1。
18.可选地，其特征在于，在所述步骤1中，甲氧基保护的赖氨酸与叔丁氧羰基保护的赖氨酸先在1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂中混合，并在惰性气氛中加入二氯甲烷溶解，然后在冰浴中加入预设量的n,n-二异丙基乙胺，室温反应24-30小时，纯化后得到中间体a1；
19.将中间体a1依次用饱和氯化钠、碳酸氢钠饱和溶液、稀盐酸在避光下各洗涤三次，并收集有机相，然后向有机相中加入预设量的无水硫酸镁干燥避光过夜并抽滤，并将滤液中的溶剂旋干后避光条件下过柱，分离得到中间体a2；
20.将中间体a2溶于二氯甲烷溶液，加入预设量的三氟乙酸溶液反应12h，以脱去叔丁氧羰基，去除溶剂后用乙醚沉淀，得到中间体a，加入的三氟乙酸溶液与叔丁氧羰基保护的赖氨酸的摩尔比为(5-6):1。
21.可选地，所述辅助偶联剂包括苯并三氮唑-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲六氟磷酸酯、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的其中一种。
22.此外，为了实现上述目的，本发明还提供一种溶瘤多肽纳米药物的制备方法，将l型或d型的上述所述的具有溶瘤活性的多肽化合物或上述任一方法制得的具有溶瘤活性的多肽化合物的溶液中加入二硫苏糖醇，并在室温搅拌24-30小时，然后通过透析袋透析，并冷冻干燥，获得黄色粉末状的手性溶瘤多肽纳米药物。
23.此外，为了实现上述目的，本发明还提供一种根据上述所述的溶瘤多肽纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
24.有益效果：
25.本发明中制得的具有溶瘤活性的多肽化合物包括亲水端与疏水端，且内部具有手性结构，并在水中可通过亲疏水作用自组装形成手性溶瘤多肽纳米粒子，以及溶瘤多肽纳米粒子中氨基酸能够与生物膜形成多重作用力(多重氢键、疏水作用等)，并根据溶瘤病毒
的抗肿瘤机制，利用氨基酸/残基与生物膜相互作用，以及树状分子组装体的放大效应，实现溶解肿瘤细胞的生物学功能，进而根据不同手性结构产生不同强度的溶瘤效果，因此肿瘤细胞膜损伤可诱导肿瘤细胞发生免疫性细胞死亡，释放免疫刺激因子，刺激产生抗肿瘤免疫，即手性溶瘤多肽纳米粒子表面丰富的氨基酸残基可与肿瘤细胞膜相互作用，破坏肿瘤细胞膜系统，引起免疫原性细胞死亡，激活系统抗肿瘤免疫，进而实现抗肿瘤细胞治疗的效果。同时，制备的手性溶瘤多肽纳米药物可避免病毒等基于生物制品的溶瘤药物所引起的生物安全性风险，并且d型溶瘤多肽纳米药物的相应效果均优于l型溶瘤多肽纳米药物，且均优于现有合成的溶瘤肽ltx-315的抗肿瘤效果，进而可实现后续抗肿瘤的广泛使用。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
27.图1为本发明一种具有溶瘤活性的多肽化合物的制备方法的流程示意图；
28.图2为实施例1中的化合物1的1h nmr图；
29.图3为实施例1中的化合物2的质谱图；
30.图4为实施例1中的化合物3的1h nmr图；
31.图5为实施例1中的化合物4的质谱图；
32.图6为实施例1中的化合物5的1h nmr图；
33.图7为实施例1中的化合物6的质谱图；
34.图8为实施例1中的化合物7的1h nmr图；
35.图9为实施例1中的l型adps的质谱图；
36.图10为实施例2中的化合物8的1h nmr图；
37.图11为实施例2中的化合物9的质谱图；
38.图12为实施例2中的化合物10的1h nmr图；
39.图13为实施例2中的化合物11的质谱图；
40.图14为实施例2中的化合物12的1h nmr图；
41.图15为实施例2中的d型adps的质谱图；
42.图16为l-vops和d-vops的粒径分布；
43.图17为l-vops和d-vops的tem照片；
44.图18为l-vops和d-vops的旋光光谱；
45.图19为l-vops和d-vops的圆二色谱图；
46.图20为l-vops、d-vops和对照组ltx-315与4t1细胞孵育后的细胞毒性曲线；
47.图21为l-vops和d-vops与4t1细胞孵育时的激光共聚焦实时成像图；
48.图22为l-vops和d-vops与4t1细胞孵育时pi内流的流式实时检测数据；
49.图23为4t1细胞与l-vops和d-vops孵育后crt的表达量；
50.图24为4t1细胞与l-vops和d-vops孵育后hmgb1的表达量；
51.图25为表面等离子共振测定l-vops和d-vops与单层脂质体的亲和力；
52.图26为流式细胞仪测定l-vops和d-vops与4t1孵育不同时间后的结合量；
53.图27为l-vops和d-vops与胰蛋白酶孵育过程中的降解率曲线；
54.图28为l-vops和d-vops与胰蛋白酶孵育不同时间后的溶瘤活性；
55.图29为多次加入细胞后l-vops和d-vops的溶瘤活性测试；
56.图30为4t1荷瘤小鼠在生理盐水(saline)、l-vops、d-vops和ltx-315治疗过程中肿瘤体积的变化；
57.图31为生理盐水(saline)、l-vops、d-vops和ltx-315治疗后肿瘤组织的病理切片，包括h&e染色、ki67和tunel；
58.图32为治疗之后肿瘤浸润淋巴结中成熟树突状细胞(dc)的含量；
59.图33为治疗后肿瘤组织内细胞毒性t细胞(cd8
+
ctl)的含量。
具体实施方式
60.下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
61.另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
62.并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
63.参见图1，本发明提出一种制备具有溶瘤活性的多肽化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
64.步骤1，将预设质量的甲氧基保护的赖氨酸与叔丁氧羰基保护的赖氨酸先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第一次缩合反应，然后进行脱叔丁氧羰基反应，得到中间体a。具体地，甲氧基保护的赖氨酸是指单个赖氨酸的羧基端连接有甲氧基，叔丁氧羰基保护的赖氨酸氨是指单个赖氨酸氨基端连接有叔丁氧羰基。
65.以及具体的过程为：将甲氧基保护的赖氨酸与叔丁氧羰基保护的赖氨酸先在1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂中混合，并在惰性气氛中加入二氯甲烷溶解，然后在冰浴中加入预设量的n,n-二异丙基乙胺，室温反应24-30小时，纯化后得到中间体a1；将中间体a1依次用饱和氯化钠、碳酸氢钠饱和溶液、稀盐酸在避光下各洗涤三次，并收集有机相，然后向有机相中加入预设量的无水硫酸镁干燥避光过夜并抽滤，并将滤液中的溶剂旋干后避光条件下过柱，分离得到中间体a2；
66.将中间体a2溶于二氯甲烷溶液，加入预设量的三氟乙酸溶液反应12h，以脱去叔丁氧羰基，去除溶剂后用乙醚沉淀，得到中间体a，加入的三氟乙酸溶液与叔丁氧羰基保护的赖氨酸的摩尔比为(5-6):1。
67.步骤2，将预设质量的中间体a与含有保护基团的亲水性氨基酸先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第二次缩合反应，然后进行脱甲酯反应，得到中间体b，其中亲水性
氨基酸为精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸中的至少一种。具体地，所述保护基团包括甲氧基、叔丁氧羰基、2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基和9-芴甲氧羰基。优选地，含有保护基团的亲水性氨基酸包括两端由甲氧基与叔丁氧羰基保护的赖氨酸、两端由叔丁氧羰基与2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基保护的精氨酸、两端由甲氧基与叔丁氧羰基保护的色氨酸、两端由9-芴甲氧羰基与叔丁氧羰基保护的谷氨酸中的至少一种。
68.步骤3，将预设质量的疏水性反应物与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第三次缩合反应，然后进行脱叔丁氧羰基反应，得到中间体c，所述疏水性反应物为烷烃、胆固醇、硫辛酸或其衍生物中的其中一种。具体地，具体的步骤为：将疏水性反应物与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺先在1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂中混合，并在惰性气氛中加入二氯甲烷溶解，然后在冰浴中加入预设量的n,n-二异丙基乙胺，室温反应24-30小时，纯化后得到中间体c1；
69.将中间体c1溶于二氯甲烷中，并加入预设量三氟乙酸溶液中反应10-12小时，去除溶剂后用乙醚沉淀，得到中间体c。优选地，加入的三氟乙酸溶液与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺中的摩尔比为(10-12)：1。
70.步骤4，将预设质量的中间体b、中间体c依次先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第四次缩合反应，然后进行脱保护基团反应，得到溶瘤活性的多肽化合物。
71.进一步地，包含精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸的反应物均为l型或d型。
72.进一步地，上述所述辅助偶联剂包括苯并三氮唑-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲六氟磷酸酯、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的其中一种。
73.进一步地，通过上述方法可制得一种具有溶瘤活性的多肽化合物，所述化合物的结构通式为：其中，r1为精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸中的至少一种，r2为碱性的赖氨酸，r3为烷烃、胆固醇、硫辛酸或其衍生物中的其中一种，r1、r2的构型为l型或d型。
74.进一步地，将l型或d型的具有溶瘤活性的多肽化合物溶液中加入二硫苏糖醇，并在室温搅拌24-30小时，然后通过透析袋透析，并冷冻干燥，获得黄色粉末状的手性溶瘤多肽纳米药物。并且该溶瘤多肽纳米药物用于抗肿瘤细胞治疗。
75.进一步地，下述通过具体的实施例来说明具有溶瘤活性的多肽化合物的制备：
76.为了避免在具体合成过程中的消旋作用，采用的偶联剂包括苯并三氮唑-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)和1-羟基苯并三唑(hobt)。
77.lys：lysine，赖氨酸；arg：arginase，精氨酸；ome：甲氧基；
78.boc：叔丁氧羰基；tfa：三氟乙酸；dipea：n,n-二异丙基乙胺；
79.pbf：2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基；dcm：二氯甲烷。
80.实施例1中以l型多肽反应物的合成方法为例。
81.l型中间体a的合成
82.称取1.50g h-l-lys-ome，5.35g boc-l-lys(boc)-oh，2.96g edc.hcl和2.09g hobt于带有支管的单口瓶中，在氮气保护下加入二氯甲烷溶解，冰浴下加入6.70ml dipea，室温反应24小时，得到中间体a1，所得a1溶液先用饱和氯化钠在避光下洗涤三次，然后用碳酸氢钠饱和溶液在避光下洗涤三次，最后用稀盐酸在避光下洗涤三次，每次洗涤20分钟，收集有机相至锥形瓶中。向其中加入适量无水硫酸镁干燥避光过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后避光条件下过柱，分离得到纯中间体a2，即化合物1(l型)，具体结构如图2所示。将化合物1(l型)溶于二氯甲烷，加入tfa(boc：tfa＝1mol：10mol)反应12h，脱去叔丁氧羰基(boc)。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到中间体a，即化合物2(l型)，具体结构如图3所示。详细的反应过程如下：
[0083][0084]
l型中间体b的合成
[0085]
称取12.15g l-pbf-arg(boc)-oh，2.00g化合物1，8.74g hbtu和2.86g hobt至支口瓶，氮气保护下加入二氯甲烷溶解，冰浴下加入13.40ml dipea，室温反应24小时后，纯化得到中间体b1，即化合物3(l型)，具体结构如图4所示。化合物3用naoh与甲醇混合溶液(甲氧基：naoh＝1mol：10mol)处理12h，去除甲醇溶液，得到中间体b，即化合物4(l型)，结构如图5所示。具体的反应过程如下：
[0086][0087]
l型中间体c的合成
[0088]
称取2.00g硫辛酸，2.45g n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺，2.23g edc.hcl和1.57g hobt至支口瓶中。氮气保护下加入二氯甲烷，冰浴下加入10.10ml dipea，室温反应24h后，纯化后得到中间体c1，即化合物5(l型)，结构如图6所示。将化合物5(l型)溶于二氯甲烷，加入tfa(boc：tfa＝1mol：10mol)反应12h。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到中间体c，即化合物6，结构如图7所示。具体的反应过程如下：
[0089][0090]
具有溶瘤活性基团的l型多肽化合物的合成
[0091]
称取3.00g化合物4(l型)，0.45g化合物6，1.28g pybop和0.20g hobt至支口瓶中。
氮气保护下加入入n,n-二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入7.39ml dipea。室温反应36h后，纯化得到化合物7(l型)，结构如图8所示。将化合物7(l型)溶于二氯甲烷，加入tfa(boc：tfa＝1mol：10mol)反应18h。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到具有溶瘤活性基团的l型多肽化合物，合成的具有溶瘤活性的多肽化合物用adps表示，l型多肽化合物即为l-adps，结构如图9所示。具体的反应过程如下：
[0092][0093]
实施例2
[0094]
与实施例1中的条件基本相同，且基于手性树状多肽合成方法基本相同，进而仅将包含氨基酸的类型均由l型替换为d型，中间体c的合成不变，具体如下：
[0095]
d型中间体a的合成
[0096]
称取1.50g h-d-lys-ome，5.35g boc-d-lys(boc)-oh，2.96g edc.hcl和2.09g hobt于带有支管的单口瓶中，在氮气保护下加入二氯甲烷溶解，冰浴下加入6.70ml dipea，室温反应24小时，得到中间体a1，所得a1溶液依次用饱和氯化钠，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在避光下分别洗涤三次，每次洗涤20分钟，收集有机相至锥形瓶中。向其中加入适量无水硫酸镁干燥避光过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后避光条件下过柱，分离得到纯中间体a2，即化合物8(d型)，结构如图10所示。将化合物8(l型)溶于二氯甲烷，加入tfa(boc：tfa＝1mol：10mol)反应12h，脱去叔丁氧羰基(boc)。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到中间体a，即化合物9(d型)，结构如图11所示。具体的反应过程和l型类似。
[0097]
d型中间体b的合成
[0098]
称取12.15g d-pbf-arg(boc)-oh，2.00g化合物9，8.74g hbtu和2.86g hobt至支口瓶，氮气保护下加入二氯甲烷溶解，冰浴下加入13.40ml dipea，室温反应24小时后，纯化得到中间体b1，即化合物10(d型)，结构如图12所示。化合物10用naoh与甲醇混合溶液(1m，甲基：naoh＝1mol：10mol)处理12h，去除甲醇溶液，得到中间体b，即化合物11(d型)，结构如图13所示。具体的反应过程和l型类似。
[0099]
d型中间体c的合成
[0100]
称取2.00g硫辛酸，2.45g n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺，2.23g edc.hcl和1.57g hobt至支口瓶中。氮气保护下加入二氯甲烷，冰浴下加入10.10ml dipea，室温反应24h后，纯化后得到中间体c1，即化合物5(l型)。将化合物5(l型)溶于二氯甲烷，加入tfa(boc：tfa＝1：10,mol/mol)反应12h。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到中间体c，即化合物6。具体的反应过程和l型类似。
[0101]
具有溶瘤活性基团的d型多肽化合物的合成
[0102]
称取3.00g化合物11(d型)，0.45g化合物6，1.28g pybop和0.20g hobt至支口瓶中。氮气保护下加入入n,n-二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入7.39ml dipea。室温反应36h后，纯化得到化合物12(d型)，结构如图14所示。将化合物12(d型)溶于二氯甲烷，加入tfa(boc：tfa＝1：10,mol/mol)反应18h。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到具有溶瘤活性基团的d型多肽化合物即为d-adps表示，结构如图15所示。其中，在实施例1中均采用l型的氨基酸进行反应，最终制得的具有溶瘤活性的多肽化合物也将属于l型。同理，在实施例2中均采用l型的氨基酸进行反应，最终制得的具有溶瘤活性的多肽化合物也将属于d型。
[0103]
实施例3
[0104]
一种溶瘤多肽纳米药物的制备
[0105]
将实施例1-2中的l型或d型adps溶液(5mg/ml)中加入二硫苏糖醇(二硫键摩尔量的7.5％)，并在室温搅拌24小时，以此引发硫辛酸的开环聚合。将溶解用截留分子量2000的透析袋透析，并冷冻干燥，获得黄色粉末状的l型或d型溶瘤多肽纳米药物(用l-vops或d-vops表示)。并通过动态光散射粒度仪、透射电镜测定溶瘤多肽纳米药物的纳米结构，如图16-17所示，其中制得的l-vops、d-vops均具有纳米级结构，并且粒子分布均匀；用圆二色谱、旋光光谱测定溶瘤多肽纳米药物的光学活性，如图18-19所示，其中呈手性的l-vops、d-vops在旋光光谱和圆二色谱中呈现相反的光学效果。
[0106]
进一步地，为了更好的验证上述制得的手性溶瘤多肽纳米药物的效果，下述通过相应的试验验证。
[0107]
验证1细胞存活率实验
[0108]
将4t1细胞接种于96孔平板上，于37℃培养箱中培养24h。用含不同浓度l-vops、d-vops和对照组ltx-315的新鲜培养基孵育24h。然后去掉培养基，用pbs洗涤2次，加入含有10％cck8的新鲜培养基。细胞于37℃与cck8共孵育2h。测定450nm处的od值。细胞活力计算公式如下：
[0109]
细胞活力＝(od样品-od空白)/(od对照-od空白)
×
100。
[0110]
并由图20所示，l-vops和d-vops均具有溶瘤活性且强于对照组ltx-315，并且d-vops的活性强于l-vops的活性。
[0111]
验证2细胞膜渗透实验
[0112]
采用不能渗透细胞膜的荧光染料pi测定膜通透性。在激光共聚焦实验中，在玻底皿中加入含pi(5μg/ml)的4t1细胞悬液，然后分别加入l-vops和d-vops(50μg/ml)。同时，用时间扫描模式对细胞进行成像，如图21所示，与l-vops相比，d-vops渗透肿瘤细胞膜的速度更快，效果更显著。
[0113]
以及在流式细胞术分析中，将含pi(5μg/ml)的4t1细胞悬液分别与l-vops和d-vops混合，然后用流式细胞仪检测细胞5分钟，如图22所示，在相同时间下，l-vops与d-vops渗透肿瘤细胞膜的速度比对照组ltx-315更快，并且d-vops的渗透肿瘤细胞膜的效果更显著。
[0114]
验证3体外crt暴露和hmgb1释放实验
[0115]
激光共聚焦成像时，将4t1细胞接种于玻璃皿中培养24h，用含有不同浓度l-vops、d-vops和ltx-315的新鲜培养基替换培养基，孵育12h，然后用抗钙网蛋白抗体对细胞进行染色。在流式细胞术分析中，将细胞接种于12孔板上，同上处理，如图23所示，l-vops和d-vops均可引起免疫原性死亡标志物crt的释放，并且d-vops可引起更强烈的免疫原性死亡。
[0116]
将细胞接种于玻璃皿中培养24h，分别用l-vops、d-vops和对照组ltx-315(30μg/ml)处理12h，细胞用抗hmgb1抗体和af594标记的二抗染色。然后用clsm成像。同上处理细胞进行hmgb1测定，收集细胞培养基，采用hmgb1酶联免疫吸附测定试剂盒进行分析，如图24所示，l-vops和d-vops均可引起免疫原性死亡标志物hmgb1的释放，并且d-vops可引起更强烈的免疫原性死亡。
[0117]
验证4表面等离子共振(spr)测定vops与膜结合力
[0118]
首先，用挤出法制备单层小囊泡(suv)。将1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)和1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-乙酰甘油)(popg)以3mol：7mol的比例溶于氯仿中。在减压条件下，将溶剂去除，形成脂质薄膜。加入10mm的pbs制成脂质体悬浮液(0.5mm)，然后用avanti extruder通过100nm滤膜挤出21次。
[0119]
利用plexa plexarray ht系统进行spr分析，在金芯片上通过巯基键合1-十二烷基硫醇。为了形成脂质单层，将suv填充到空腔，静置30分钟，然后用pbs洗涤三次。pbs以2μl/s的流速运行300s。用l-vops或d-vops溶液(50μg/ml)替代pbs，运行300s。然后pbs运行300秒进行解离。所有结合实验均在25℃下进行，结果如图25所示，spr实验结果表明，d-vops与仿细胞膜的单层脂质的结合能力强于l-vops与仿细胞膜的单层脂质的结合能力。
[0120]
验证5细胞结合实验
[0121]
将4t1细胞接种于12孔板中培养24h，按预先设计的时间在孔中加入cy5标记的l-vops和d-vops(30μg/ml)。然后采集细胞，利用流式细胞仪分析，如图26所示，其中d-vops与4t1肿瘤细胞有的结合能力更强。
[0122]
验证6溶瘤多肽纳米药物体外酶降解实验
[0123]
用bhq-3和cy5的fret猝灭对标记l-vops和d-vops。取100μl bhq-3和cy5标记的vops溶液(50μg/ml)与0.5％胰蛋白酶在37℃下孵育。测定不同孵育时间bhq/cy5vops的荧光光谱，结果如图27所示。
[0124]
采用溶瘤活性测定法评价vops的耐酶性能。l-vops和d-vops(15μg/ml)用0.5％胰蛋白酶孵育不同时间，结果如图28所示。将处理后的l-vops和d-vops与4t1细胞孵育24h，通过cck8细胞活力测定vops的溶瘤活性，结果如图29所示。进而由图27-29所示，d-vops的抗
降解性能强于l-vops，进而具有更强的抗降解能力。
[0125]
验证7体内抗肿瘤及抗肿瘤免疫分析
[0126]
将4t1细胞注射于balb/c小鼠右侧，建立皮下肿瘤。当肿瘤体积增大至100～150mm3时，瘤内注射l-vops、d-vops和对照组ltx-315、生理盐水(10mg/kg)，每隔一天注射一次，共注射4次。用卡尺记录30天肿瘤体积，如图30所示，其中，在注射d-vops的肿瘤细胞在10天左右达到一个峰值，并随着时间的推移，注射d-vops的肿瘤细胞体积呈逐步缩小趋势，计算公式为：体积＝(l*w2)/2，其中l为肿瘤较长直径，w为较短直径。
[0127]
收集肿瘤及脏器并将脾脏制备成细胞悬液，然后用抗cd3抗体、抗cd8抗体、抗cd62l抗体和抗cd44抗体进行染色，结果如图31所；并用流式细胞仪检测记忆t细胞，结果如图33所示，d-vops对应的记忆t细胞的占比大于l-vops，且l-vops、d-vops均大于对照组ltx-315、生理盐水。肿瘤内的clts和肿瘤浸润性淋巴结中dcs的成熟树突细胞(dc)的含量如图32-33所示，其中d-vops对应的clts和dc的占比大于l-vops，且l-vops、d-vops均大于对照组ltx-315、生理盐水。进而根据图30-33所示，l-vops和d-vops均可产生肿瘤抑制作用，引起肿瘤组织病理损伤，促进肿瘤浸润性淋巴结中dc细胞成熟，并进一步激活抗肿瘤免疫，同时，d-vops的活性强于l-vops。
[0128]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

技术特征：
1.一种具有溶瘤活性的多肽化合物，其特征在于，所述化合物的结构通式为：其中，r1为精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸中的至少一种，r2为碱性的赖氨酸，r3为烷烃、胆固醇、硫辛酸或其衍生物中的其中一种，r1、r2的构型为l型或d型。2.一种制备如权利要求1所述的具有溶瘤活性的多肽化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，将预设质量的甲氧基保护的赖氨酸与叔丁氧羰基保护的赖氨酸先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第一次缩合反应，然后进行脱叔丁氧羰基反应，得到中间体a；步骤2，将预设质量的中间体a与含有保护基团的亲水性氨基酸先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第二次缩合反应，然后进行脱甲酯反应，得到中间体b，其中亲水性氨基酸为精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸中的至少一种；步骤3，将预设质量的疏水性反应物与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第三次缩合反应，然后进行脱叔丁氧羰基反应，得到中间体c，所述疏水性反应物为烷烃、胆固醇、硫辛酸或其衍生物中的其中一种；步骤4，将预设质量的中间体b、中间体c依次先通过1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂进行第四次缩合反应，然后进行脱保护基团反应，得到溶瘤活性的多肽化合物；其中，包含精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸的反应物均为l型或d型。3.根据权利要求2所述具有溶瘤活性的多肽化合物的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，甲氧基保护的赖氨酸是指单个赖氨酸的羧基端连接有甲氧基，叔丁氧羰基保护的赖氨酸氨是指单个赖氨酸氨基端连接有叔丁氧羰基；在所述步骤2中，所述保护基团包括甲氧基、叔丁氧羰基、2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基和9-芴甲氧羰基。4.根据权利要求3所述具有溶瘤活性的多肽化合物的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，含有保护基团的亲水性氨基酸包括两端由甲氧基与叔丁氧羰基保护的赖氨酸、两端由叔丁氧羰基与2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基保护的精氨酸、两端由甲氧基与叔丁氧羰基保护的色氨酸、两端由9-芴甲氧羰基与叔丁氧羰基保护的谷氨酸中的至少一种。5.根据权利要求2所述具有溶瘤活性的多肽化合物的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，疏水性反应物与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺先在1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂中混合，并在惰性气氛中加入二氯甲烷溶解，然后在冰浴中加入预设量的n,n-二异丙基乙胺，室温反应24-30小时，纯化后得到中间体c1；将中间体c1溶于二氯甲烷中，并加入预设量三氟乙酸溶液中反应10-12小时，去除溶剂后用乙醚沉淀，得到中间体c。6.根据权利要求5所述具有溶瘤活性的多肽化合物的制备方法，其特征在于，加入的三氟乙酸溶液与n-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺中的摩尔比为(10-12)：1。7.根据权利要求2至6中任一项所述具有溶瘤活性的多肽化合物的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，甲氧基保护的赖氨酸与叔丁氧羰基保护的赖氨酸先在1-羟基苯并三唑与辅助偶联剂中混合，并在惰性气氛中加入二氯甲烷溶解，然后在冰浴中加入预设量的n,
n-二异丙基乙胺，室温反应24-30小时，得到中间体a1；将中间体a1依次用饱和氯化钠、碳酸氢钠饱和溶液、稀盐酸在避光下各洗涤三次，并收集有机相，然后向有机相中加入预设量的无水硫酸镁干燥避光过夜并抽滤，并将滤液中的溶剂旋干后避光条件下过柱，分离得到中间体a2；将中间体a2溶于二氯甲烷溶液，加入预设量的三氟乙酸溶液反应12h，以脱去叔丁氧羰基，去除溶剂后用乙醚沉淀，得到中间体a，加入的三氟乙酸溶液与叔丁氧羰基保护的赖氨酸的摩尔比为(5-6):1。8.根据权利要求2至6中任一项所述具有溶瘤活性的多肽化合物的制备方法，其特征在于，所述辅助偶联剂包括苯并三氮唑-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲六氟磷酸酯、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的其中一种。9.一种溶瘤多肽纳米药物的制备方法，其特征在于，将l型或d型的权利要求1中所述的具有溶瘤活性的多肽化合物或权利要求2-8任一方法制得的具有溶瘤活性的多肽化合物的溶液中加入二硫苏糖醇，并在室温搅拌24-30小时，然后通过透析袋透析，并冷冻干燥，获得黄色粉末状的手性溶瘤多肽纳米药物。10.一种根据权利要求9所述的溶瘤多肽纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有溶瘤活性的多肽化合物及其制备方法与应用，其中，所述具有溶瘤活性的多肽化合物所述化合物的结构通式为：其中，R1为精氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸中的至少一种，R2为碱性的赖氨酸，R3为烷烃、胆固醇、硫辛酸或其衍生物中的其中一种，R1、R2的构型为L型或D型。本发明旨在制得手性溶瘤多肽纳米药物，以实现破坏肿瘤细胞膜系统，实现抗肿瘤效果。实现抗肿瘤效果。实现抗肿瘤效果。


技术研发人员：徐翔晖 李亚超 邓柯芙蓉 曾泽南 邹东哲
受保护的技术使用者：湖南大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/8/24