一种促进肿瘤细胞铁死亡的核酸药物及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种促进肿瘤细胞铁死亡的核酸药物及其应用。


背景技术：

2.铁死亡(ferroptosis)作为2012年新提出的一种调节性死亡方式，是由于细胞内脂质氧化物代谢障碍，在铁离子催化作用下代谢发生异常，细胞抗氧化能力减弱，脂质活性氧(ros)堆积，多不饱和脂肪酸(pufa)过氧化，过氧化脂质(lpo)大量积聚，从而诱导细胞死亡。从铁死亡被提出至今近十年来，有关铁死亡的研究呈指数级增长。研究发现，许多器官损伤、退行性病变和其他与脂质代谢异常方面的疾病都与铁死亡有密切联系，其在肿瘤方面的研究更是具有巨大的意义，为治疗肿瘤的研究提供了一个全新的思路。但是，现在的大多数研究都是通过外源性的方式诱导肿瘤细胞发生铁死亡，通过物理、化学的方法，如：靶向gpx4的光敏剂、抑制gpx4的化学小分子、促进细胞内铁和ros的积累等，对其内源性分子层面的基础研究较少。外源性物质或材料存在人体难以吸收、人体作用效果差的特点，如何推向临床是其最大障碍。
3.核酸药物治疗肿瘤已经得到证实。当前获批rna药物主要基于sirna和mirna这些短核酸，而mrna和lncrna等长序列rna药物，具有半衰期长，特异性高的特点，目前已经成为了rna药物研究的新方向。但核酸药物与肿瘤铁死亡之间仍缺乏相关的研究，有待补充。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于提供一种促进肿瘤细胞铁死亡的核酸药物及其应用。沉默和/或抑制lncrnahottip表达的试剂可以促进肿瘤细胞铁死亡。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
6.沉默和/或抑制lncrnahottip表达的试剂在制备肿瘤细胞铁死亡促进剂中的应用。沉默和/或抑制lncrnahottip表达的试剂可以促进肿瘤细胞铁死亡，用作促进肿瘤细胞铁死亡的药物，抑制肿瘤细胞的生长。
7.在一些实施例中，所述肿瘤细胞为骨肉瘤细胞。优选地，所述肿瘤细胞为mg63、u2os。
8.在一些实施例中，所述促进剂可以促进肿瘤细胞脂质过氧化。
9.在一些实施例中，所述促进剂可以降低肿瘤细胞抗氧化能力。
10.在一些实施例中，所述促进剂可以增加肿瘤细胞中ros含量。
11.在一些实施例中，所述抑制ncrnahottip表达的试剂为慢病毒、腺病毒、逆病毒中的至少一种。
12.在一些优选的实施例中，所述抑制lncrnahottip表达的试剂包括如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链。
13.本发明还提供了一种促进肿瘤细胞铁死亡的药物，所述药物包含沉默和/或抑制
lncrna hottip表达的试剂，以及药物学上可接受的辅料。
14.在一些实施例中，所述抑制lncrnahottip表达的试剂为慢病毒、腺病毒、逆病毒中的至少一种。
15.在一些优选的实施例中，所述抑制lncrnahottip表达的试剂包括如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链。
16.本发明还提供了一种非治疗目的的促进肿瘤细胞铁死亡的方法，包括以下步骤：(1)建立体外肿瘤细胞培养体系；(2)向所述培养体系中加入沉默和/或抑制lncrnahottip表达的试剂处理，使lncrnahottip表达下降；(3)然后加入铁死亡诱导剂处理，检测铁死亡水平。
17.在一些实施例中，所述肿瘤细胞为骨肉瘤细胞；优选地，所述肿瘤细胞为mg63、u2os。
18.在一些实施例中，所述抑制lncrnahottip表达的试剂为慢病毒、腺病毒、逆病毒中的至少一种。
19.在一些实施例中，所述铁死亡诱导剂为erastin、rsl3、ike中的至少一种。
20.本发明还提供了检测lncrnahottip表达水平的试剂在制备评估肿瘤细胞铁死亡敏感性的试剂盒中的应用。lncrnahottip表达水平低的肿瘤细胞更加容易发生铁死亡，因此，检测lncrnahottip表达水平可以评估肿瘤细胞铁死亡的敏感性。
21.本发明经过研究发现抑制lncrnahottip的表达可以促进肿瘤细胞脂质过氧化，降低肿瘤细胞抗氧化能力，增加肿瘤细胞中ros含量，从而促进肿瘤细胞的铁死亡水平。而促进lncrnahottip的表达则可以抑制肿瘤细胞的铁死亡水平。因此，靶向沉默lncrnahottip可以促进肿瘤细胞铁死亡，为肿瘤新药物的开发提供了新的靶点和思路。
附图说明
22.图1为骨髓转录组学分析结果。
23.图2为在骨肉瘤细胞系中验证lncrnahottip对于铁死亡的敏感性结果。
24.图3为lncrnahottip过表达和敲低细胞株的构建。
25.图4为过表达lncrnahottip后抑制了骨肉瘤细胞脂质过氧化实验结果。
26.图5为敲低lncrnahottip后促进了骨肉瘤细胞脂质过氧化实验结果。
27.图6为在小鼠体内敲低lncrnahottip后对骨肉瘤细胞铁死亡影响结果。
具体实施方式
28.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
29.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
30.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有
的其它步骤。
31.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
32.下面结合具体实施例进行说明。
33.实施例1转录组学分析lncrnahottip与脂质代谢途径密切相关
34.通过本领域常规技术手段构建在lncrnahottip基因敲除小鼠。取4-6周龄的基因敲除小鼠的骨髓进行转录组测序(上海嘉因生物)，并以正常wt小鼠的骨髓为对照。图1a为实验示意图。
35.图1b所示，将筛选出的差异基因基于kegg数据库进行注释，得到差异基因、靶基因参与的所有代谢通路，将所有差异/上调/下调基因分别分配到不同的代谢通路中，选取差异基因显著富集的pathway中的前25个条目以enrichment为纵轴作柱状图。其中，纵轴为enrichment，横轴为pathway名称。
36.gsea分析铁死亡相关基因集，发现biological oxidations基因集被显著激活，提示hottip基因与氧化还原过程密切相关(图1c)。
37.对差异基因进行分析聚类分析，把上调、下调基因分成两类，以火山图形式呈现(图1d)。
38.对每个差异基因进行go注释，得到其所有的go功能条目，将所有差异基因按上调/下调分类，从bp(biological process)这个层面分配到不同的go功能条目中，观察其中与铁死亡相关过程的差异情况(图1e、图1f)。结果发现与铁死亡相关的线粒体膜电位、脂质代谢、细胞对活性氧、铁离子的应答等生物学过程都被激活，提示lncrnahottip与以脂质过氧化为主要特征的铁死亡过程密切相关，为进一步验证lncrnahottip调控铁死亡的功能提供了理论依据。
39.实施例2在骨肉瘤细胞系中验证lncrnahottip对于铁死亡的敏感性
40.在体外培养骨肉瘤细胞系mg63、u2os，用铁死亡经典诱导剂erastin(终浓度为10μm)进行处理，使用等体积的溶剂处理作为对照组。处理24h后收集细胞，提取rna，使用qpcr检测lncrnahottip水平。如图2a所示，与对照组相比，erastin诱导后lncrnahottip表达明显降低，其中mg63、u2os分别对erastin诱导剂最敏感、敏感较低，遂分别对这两个细胞系进行过表达和敲低处理。
41.在体外培养骨肉瘤细胞系mg63、u2os，用铁死亡经典诱导剂erastin(终浓度为10μm)、rsl3(终浓度为1μm)，同时分别加入铁死亡抑制剂ferrostatin-1(fer-1，终浓度为2μm)、凋亡抑制剂z-vad-fmk(终浓度为10μm)、坏死抑制剂necrosulfonamide(necro，终浓度为1μm)，验证细胞发生的确实是铁死亡(图2b)。
42.在验证细胞铁死亡的基础上，克隆形成实验进一步验证erastin和rsl对mg63、u2os的抑制效果。结果如图2c所示。
43.实施例3
44.在以上结果的基础上，分别构建lncrnahottip过表达(phottip)和敲低(shhottip)的慢病毒质粒。
45.首先，把从南方医科大学构建的phottip、pvector和shhottip、shnc质粒采用
lipo3000脂质复合体的方式分别转入293t工具细胞中，分别于24、48、72小时收集毒液转入目的细胞中，96h后换为含10％fbs完全培养基。待细胞状态良好后，用嘌呤霉素puromycin(0.5mg/ml)筛除未成功转染的阴性细胞，7天后所剩下的即为转染成功的目的细胞，期间每天通过观察细胞荧光判断细胞转染效率，最后用qpcr实验验证细胞株是否构建成功，筛选出阳性细胞株(图3)。
46.所述shhottip包括如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链：
47.seq id no.1：5
’‑
gatccggcactttatatgctgtaattcaagagattacagcatata aagtgcctttttt-3’；
48.seq id no.2：5
’‑
aattaaaaaaggcactttatatgctgtaatctcttgaattacagc atataaagtgccg-3’。
49.实施例4过表达lncrnahottip后抑制了骨肉瘤细胞脂质过氧化
50.利用过表达阳性细胞株进行以下实验，药物处理浓度同实施例2。
51.1.细胞活性实验：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对phottip、pvector细胞株进行处理，同时分别做铁死亡抑制剂ferrostatin-1、凋亡抑制剂z-vad-fmk、坏死抑制剂necrosulfonamide对照组，验证细胞发生的是铁死亡以及lncrnahottip过表达后对骨肉瘤细胞铁死亡的影响。结果如图4a所示，过表达lncrnahottip后细胞铁死亡水平降低，提示hottip过表达抑制骨肉瘤细胞铁死亡。
52.2.ironassay：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对phottip、pvector细胞株进行处理，利用铁离子试剂盒(sigmamak025)检测细胞内铁含量，比较lncrnahottip过表达后对骨肉瘤细胞的铁离子水平的影响。结果发现过表达lncrnahottip后细胞总铁水平降低，提示lncrnahottip过表达抑制骨肉瘤细胞铁死亡(图4b)。
53.3.mda：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对phottip、pvector细胞株进行处理，利用mda试剂盒(南京建成a003-4-1)检测细胞脂质过氧化物终产物mda水平，比较lncrnahottip过表达后对骨肉瘤细胞的mda的影响。结果发现过表达lncrnahottip后脂质过氧化终产物mda水平降低，提示lncrnahottip过表达抑制骨肉瘤细胞脂质氧化损伤(图4c)。
54.4.ros：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对phottip、pvector细胞株进行处理，利用ros试剂盒(普利莱c1300-2)检测细胞脂质活性氧ros水平，比较lncrnahottip过表达后对骨肉瘤细胞的ros的影响。结果发现过表达lncrnahottip后脂质活性氧ros水平降低，提示lncrnahottip过表达抑制骨肉瘤细胞氧化应激损伤(图4d)。
55.5.gsh：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对phottip、pvector细胞株进行处理，利用gsh试剂盒(南京建成a006-2-1)检测细胞(还原型)谷胱甘肽gsh水平，比较lncrna hottip过表达后对骨肉瘤细胞抗氧化能力gsh的影响。发现过表达lncrnahottip后细胞抗氧化能力升高，提示lncrnahottip过表达降低了骨肉瘤细胞氧化水平(图4e)。
56.f、wb：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对phottip、pvector细胞株进行处理，分别验证cox2(abmart t58852)、xct(abmart t57046)、gpx4(abmart t56959)表达水平，β-actin((cst 4970)作为内参，比较lncrnahottip过表达后铁死亡相关蛋白的表达水平。结果发现过表达lncrnahottip后xct、gpx4变化水平较空载组明显降低，cox2变化水平较空载组明显减少，提示lncrnahottip过表达抑制了骨肉瘤细胞对铁死亡的敏感性(图4f)。
57.综上，过表达lncrnahottip后细胞氧化水平降低、抗氧化能力升高，进而证明过表达lncrnahottip抑制了骨肉瘤细胞过氧化。
58.实施例5敲低lncrnahottip后促进了骨肉瘤细胞脂质过氧化
59.利用敲低阳性细胞株进行以下实验，药物处理浓度同实施例2。
60.1.细胞活性实验：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对shhottip、shnc细胞株进行处理，同时分别做铁死亡抑制剂ferrostatin-1、凋亡抑制剂z-vad-fmk、坏死抑制剂necrosulfonamide对照组，验证细胞发生的是铁死亡以及lncrnahottip敲低后对骨肉瘤细胞铁死亡的影响。发现敲低lncrna hottip后细胞铁死亡水平降低，提示lncrna hottip敲低促进骨肉瘤细胞铁死亡(图5a)。
61.2.ironassay：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对shhottip、shnc细胞株进行处理后，利用铁离子试剂盒(sigmamak025)检测细胞内铁含量，比较lncrnahottip敲低后对骨肉瘤细胞的铁离子水平的影响。发现敲低lncrnahottip后细胞总铁水平升高，提示lncrnahottip敲低促进骨肉瘤细胞铁死亡(图5b)。
62.3.mda：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对shhottip、shnc细胞株进行处理后，利用mda试剂盒(南京建成a003-4-1)检测细胞脂质过氧化物终产物mda水平，比较lncrnahottip敲低后对骨肉瘤细胞的mda的影响。发现敲低lncrnahottip后脂质过氧化终产物mda水平升高，提示lncrnahottip敲低促进骨肉瘤细胞脂质氧化损伤(图5c)。
63.4.ros：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对shhottip、shnc细胞株进行处理后，利用ros试剂盒(普利莱c1300-2)检测细胞脂质活性氧ros水平，比较lncrnahottip敲低后对骨肉瘤细胞的ros的影响。发现敲低lncrnahottip后脂质活性氧ros水平升高，提示lncrnahottip敲低促进骨肉瘤细胞氧化应激损伤(图5d)。
64.5.gsh：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对shhottip、shnc细胞株进行处理后，利用gsh试剂盒(南京建成a006-2-1)检测细胞(还原型)谷胱甘肽gsh水平，比较lncrna hottip敲低后对骨肉瘤细胞抗氧化能力gsh的影响。发现敲低lncrnahottip后细胞抗氧化能力降低，提示lncrnahottip敲低提高了骨肉瘤细胞氧化水平(图5e)。
65.6.wb：通过铁死亡经典诱导剂erastin、rsl3对shhottip、shnc细胞株进行处理后，分别验证cox2(abmart t58852)、xct(abmart t57046)、gpx4(abmart t56959)表达水平,β-actin((cst 4970)作为内参，比较lncrnahottip敲低后铁死亡相关蛋白的表达水平。发现敲低hottip后cox2、xct、gpx4变化水平较空载组明显升高，提示lncrna hottip敲低促进了骨肉瘤细胞对铁死亡的敏感性(图5f)。
66.综上，敲低lncrna hottip后细胞氧化水平升高、抗氧化能力减弱，进而证明敲低lncrnahottip促进骨肉瘤细胞过氧化的结论。
67.实施例6体内实验证明敲低lncrnahottip后骨肉瘤细胞更容易发生铁死亡
68.在南方医科大学动物中心购买3周龄的雌性裸鼠20只，随机分四组，n＝5，饲养7天后，经由右侧胫骨间隙向股骨骨髓腔注射生长状态良好的u2os shhottip和shnc细胞株，1.5*106个/只，各10只。待造模9-11天后视肿瘤大小开始给药，腹腔注射经典铁死亡体内诱导剂ike，给药量20mg/kg，注射体积0.1ml/10g，以给药第一天为day0测量肿瘤体积(v＝(l*w2)/2),
69.每隔一天给药一次并测量肿瘤体积，监测肿瘤生长率(tumor growth rate)＝
day/day0*100％，给药后14天处死取材。测量肿瘤重量，取肿瘤组织送公司免疫组化检测ki67、gpx4的表达。(采用mean和sd统计方法，单因素方差分析(anova)和多重比较。)
70.取材后选取各组内肿瘤大小相近的三只老鼠拍照。发现hottip敲低后肿瘤体积相比空载组更小(图6a)，提示敲低lncrnahottip能显著抑制骨肉瘤组织形成。
71.从给药后第一天(day0)开始监测肿瘤体积的生长率＝day/day0*100％，v＝(l*w2)/2。结果显示shhottip+ike组生长率较其他三组更低(图6b)，提示敲低lncrnahottip能抑制骨肉瘤组织生长。
72.取材后比较肿瘤重量，发现lncrnahottip敲除组比空载组更低(图6c)，提示敲低lncrnahottip能起到抑制肿瘤增长的效果。
73.免疫组化ihc检测肿瘤生长指标ki67、铁死亡经典蛋白gpx4水平。结果显示lncrna hottip敲低后肿瘤组织ki67、gpx4水平较空载组明显更低(图6d)，进一步证明lncrna hottip促进了骨肉瘤铁死亡的发生。
74.综上，通过体内实验，证明裸鼠在注射铁死亡诱导剂ike诱导情况下，敲低lncrna hottip可以抑制肿瘤组织的形成、生长和增殖。组化结果也提示敲低lncrnahottip后肿瘤组织ki-67表达更低，铁死亡关键抑制蛋白gpx4表达也更低，提示敲低lncrnahottip可以促进肿瘤组织的铁死亡发生。
75.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
76.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.沉默和/或抑制lncrnahottip表达的试剂在制备肿瘤细胞铁死亡促进剂中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为骨肉瘤细胞。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述促进剂具有以下功效中的至少一种：(1)可以促进肿瘤细胞脂质过氧化；(2)降低肿瘤细胞抗氧化能力；(3)增加肿瘤细胞中ros含量。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制lncrnahottip表达的试剂为慢病毒、腺病毒、逆病毒中的至少一种。5.如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制lncrnahottip表达的试剂包括如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链。6.一种促进肿瘤细胞铁死亡的药物，其特征在于，所述药物包含沉默和/或抑制lncrna hottip表达的试剂，以及药物学上可接受的辅料。7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述抑制lncrnahottip表达的试剂为慢病毒、腺病毒、逆病毒中的至少一种。8.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于，所述抑制lncrnahottip表达的试剂包括如seq id no.1所示的正义链和如seq id no.2所示的反义链。9.一种非治疗目的的促进肿瘤细胞铁死亡的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)建立体外肿瘤细胞培养体系；(2)向所述培养体系中加入沉默和/或抑制ncrnahottip表达的试剂进行处理，使ncrnahottip表达下降；(3)然后加入铁死亡诱导剂处理，检测铁死亡水平。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为骨肉瘤细胞；优选地，所述肿瘤细胞为mg63、u2os；和/或，所述抑制lncrnahottip表达的试剂为慢病毒、腺病毒、逆病毒中的至少一种；和/或，所述铁死亡诱导剂为erastin、rsl3、ike中的至少一种。

技术总结
本发明提供了一种促进肿瘤细胞铁死亡的核酸药物及其应用，属于生物医药技术领域。沉默和/或抑制LncRNAHOTTIP表达的试剂可用于制备肿瘤细胞铁死亡促进剂。本发明经过研究发现抑制LncRNAHOTTIP的表达可以促进肿瘤细胞脂质过氧化，降低肿瘤细胞抗氧化能力，增加肿瘤细胞中ROS含量，从而促进肿瘤细胞的铁死亡水平。而促进LncRNAHOTTIP的过表达则可以抑制肿瘤细胞的铁死亡水平。因此，靶向抑制LncRNAHOTTIP可以促进肿瘤细胞铁死亡，为肿瘤新药物的开发提供了重要依据，在肿瘤治疗、药物研发等领域具有重要的应用价值。物研发等领域具有重要的应用价值。物研发等领域具有重要的应用价值。


技术研发人员：张锦芳 丁寿常
受保护的技术使用者：广州中医药大学深圳医院（福田）
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/28