Homosalate在水母爆发防控中的应用的制作方法

homosalate在水母爆发防控中的应用
技术领域
1.本发明涉及水母防控技术领域，更具体的，涉及homosalate在水母爆发防控中的应用。


背景技术：

2.水母是对人类危害最大的海洋生物之一，由于水母暴发带来的损失包括多个方面，其中最主要的有3个方面：首先，由于水母爆发，蜇伤人数在沿海地区显著增长。一方面，水母蜇伤带来了沉重的医疗负担，且治疗效果不明显；另一方面，由于水母爆发导致捕鱼业产出锐减，给捕鱼业和旅游业也带来了不可估量的损失。
3.homosalate，胡莫柳酯(英文:homosalate化学式：c
16h22
o3)又称水杨酸三甲环己酯、三甲基水杨酸盐、原膜散酯，为无色透明液体的化学物质，不溶于水，可吸收uvb295～315波段的紫外线，工业上主要用于紫外线uvb防晒剂。现有技术报道，homosalate也显着抑制htr8/svneo细胞的侵袭。此外，它调节磷酸肌醇3激酶(pi3k)/akt和丝裂原活化蛋白激酶(mapk)信号通路。
4.针对水母爆发使用homosalate抑制作为有效的防控手段，目前尚未见报道。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术存在的上述问题，首先提供homosalate在作为海月水母变态发育抑制剂中的应用。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.本发明首先提供homosalate在作为海月水母变态发育抑制剂中的应用。
8.本发明还提供homosalate在制备防控海月水母爆发的功能产品中的应用。
9.通过实验验证，配备好化学诱导及的人工海水和添加了浓度为1μm homosalate的人工海水诱导剂中，添加了homosalate抑制剂的组能明显降低同一时间的水螅体横裂率，且在碟状体阶段，明显减少碟状体数量，进而减少水母的数量。
10.因此，优选的，上述应用中，homosalate具有以下作用：
11.(1)降低海月水母变态发育的早期横裂率，和/或，
12.(2)减少海月水母碟状体的数量，和/或，
13.(3)减缓海月水母水螅体的横裂增殖速度。
14.更优选的，上述应用中，homosalate的浓度为100nm～1μm。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.抑制剂homosalate可以抑制海月水母水螅体在化学诱导剂中的变态进程，通过实验验证，100nm的homosalate抑制剂和1μm的homosalate抑制剂浸泡海月水母水螅体，同样都能抑制变态发育。结果表明，从第二天开始，实验组横裂的数目比对照组少，且出现碟状体的个数也较对照组减少。为水母的爆发防控提供了理论基础。
17.此外，homosalate在低浓度安全无毒，其成本低廉，操作简单易行，且见效快，
homosalate在水母爆防控造的应用上具有巨大潜力，本发明的上述方法适用于有水母爆发的沿海渔场、旅游海域、及有核电站海域，可用于防控水母的爆发，推荐先提前用将适当浓度的homosalate挥洒在海域。
附图说明
18.图1为1μm和100nm的homosalate抑制剂与对照组对不同时期海月水母变态发育的影响；
19.图2为1μm和100nm的homosalate抑制剂与对照组的海月水母在不同天数对应阶段的产生量。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
22.一、实验材料
23.人工盐水的配备：将海盐溶解至自来水里，用玻璃棒搅拌，用光学盐度计测定其盐度在2.8
‰‑
3.2
‰
，静置除去杂物。
24.化学诱导剂的配备：称取0.0403g的5-甲氧基-2-甲基吲哚(索莱宝)，置于5l的容器瓶中，加入5l的人工海水，摇晃至溶解完全，即配备好50μm的5-甲氧基-2甲基吲哚化学诱导剂。
25.20℃恒温箱；其他：培养皿、波纹板、水缸、24孔板。
26.二、实验方法
27.实验1、水螅体阶段和水母阶段总蛋白的提取
28.1)样品获取：用一次性吸管顺着波纹板纹路从上至下刮，使用吸管将水螅体从波纹板上吸出后放入盛有海水的烧杯中，使用海水多次冲洗水螅体，洗去杂质，最后使用1
×
pbs冲洗三次。
29.2)匀浆：收集清洗后的海月水母水螅体添加等体积的1
×
pbs溶液使用匀浆机在4℃环境下进行匀浆，匀浆20s
×
3次，每次间隔15s。
30.3)搅拌：获取海月水母水螅体匀浆液后，将其转移至烧杯中，并向其中加入水螅体和1
×
pbs体积比约为1：5的预制冷(4℃)1
×
pbs。将样品置于4℃冰箱中使用磁力搅拌器搅拌72h使其充分自溶。
31.4)过滤：收集自溶后溶液使用200目筛进行过滤2次，置于500ml烧杯，将未自溶部分及杂质去除。
32.5)离心：收集滤液进行离心，将滤液转移至50ml离心管中，于4℃、1000
×
g下离心10min，收集上清液。
33.6)透析：在离心结束后，剪一段透析袋，放置于开水中煮沸10min，煮开后，用嵌子
将透析袋从开水中夹起来，用固定夹夹紧一端，将收集到的上清液倒入透析袋中，再将另一端用固定夹夹紧，上下颠倒检查是否夹紧，置于烧杯中，倒入1
×
pbs至淹没透析袋，放入磁力搅拌器，透析1天。分装到15ml离心管中，作为毒液样品放置于-80℃冰箱保存。
34.7)再离心：收集透析液液进行离心，将滤液转移至50ml离心管中，于4℃、1000
×
g下离心10min，收集上清液于50ml离心管。分装到15ml离心管中得到水螅体总蛋白。作为毒液样品放置于-80℃冰箱保存。
35.实验2、小鼠毒性评价
36.选择icr小鼠，重量在18-22g，7周龄的雄性小鼠，将提取的总蛋白浓度为0.3036mg/ml，尾静脉注射，注射剂量为10ml/kg，对照组同样注射等剂量的1
×
pbs。
37.实验组、对照组的足掌注射体积均按小鼠体重呈比例缩减，分别测量注射后0h，0.5h，1h，2h，4h，12h，24h，36h，48h时的记录小鼠生存情况。
38.实验3、抑制剂浓度筛选
39.根据预实验结果分别设计2组实验，分别为1μm和100nm的homosalate抑制剂，在12孔板上，每组3个孔，每孔10只提前挑好的水螅体。
40.homosalate抑制剂的配备：取1mg的homosalate(陶术)抑制剂，加入381.1702μl的dmso配成10mm的母液
①
，随后取2μl母液
①
，加入19998μl用人工海水配备的50nm的5-甲氧基-2-甲基吲哚溶液配成20ml的1μm的homosalate抑制剂溶液
②
。
41.取1ml的
②
，加入9ml的用人工海水配备的50nm的5-甲氧基-2-甲基吲哚溶液，得到100nm的homosalate抑制剂溶液
③
。
42.在12孔板上加入水螅体的孔里，最左边的一列3个孔板作为对照组，每孔加入3ml的50nm的5-甲氧基-2-甲基吲哚溶液，中间的一列3个孔作为100nm的homosalate抑制剂组，每孔加入3ml的
②
；右边的一列3孔作为1μm的homosalate抑制剂组，每孔加入3ml的
③
。每天同一时间观察变态发育的情况，并记录早期、晚期横裂体和碟状体产出的时间和个数，一直到全部碟状体自融为止，作图，比较两种浓度的抑制剂对变态发育的影响效果，择优选择。
43.实验4、homosalate抑制剂实验
44.选择在水缸里生长良好、触手伸展完全的水螅体，提前饥饿处理一天，并挑选好，放置在12孔板，每个孔放置10只，分为对照组和实验组，对照组是加入化学诱导剂，不加抑制剂，实验组是加入1μm的homosalate抑制剂的化学诱导剂，每组n＝30，分3个孔，每孔加入10只水螅体。
45.第二天，拿出前一天准备好的样本，放置在光学显微镜下观察水螅体触手伸展状态，确保实验水螅体生长状态一致良好。用一次性吸管将12孔板里的人工海水洗干净，迅速加入对应的诱导剂和1μm的抑制剂，做好标记，放入到20℃恒温箱。每天同一时间记录水螅体的横裂情况，比如第一天是10点记录，后每天10点记录，一直到碟状体完全释放。
46.抑制剂组和对照组12孔板，每孔里加入的人工海水和抑制剂诱导剂均为3ml，配备的溶液均为同一批配备。
47.早期横裂的标准是从出现横裂节盘到五个节盘，晚期横裂体是体干节盘呈棕褐色，节盘并未脱落，碟状体的标注为节盘完全脱落，个体在溶液里自由伸缩的类似碟子一样的形状。
48.3、结果分析
49.通过实验1和2发现，用水螅体总蛋白注射小鼠后，小鼠在12分钟到30分钟相继死亡，表明海月水母水螅体阶段的毒性是比较强的。
50.通过实验3我们发现，用不同浓度的homosalate抑制剂处理，抑制剂处理的水螅体和没有用不同浓度抑制剂处理的水螅体，其变态发育有明显差异，1μm的homosalate抑制剂效果比100nm的homosalate抑制剂效果明显，在观察的第一天，水螅体发育状态都停留在水螅体阶段；而在观察的第二天，对照组的早期横裂体个数为15个，100nm的homosalate组早期横裂体为13个，1μm的homosalate抑制剂组的早期横裂体有12个；观察的第三天，100nm的homosalate抑制剂组和对照组的早期横裂体个数为21个，1μm的homosalate抑制剂早期横裂体为24个；观察的第四天，对照组所有水螅体都变态发育为早期横裂体阶段，100nm的homosalate组的早期横裂体为27个，1μm的homosalate抑制剂组的早期横裂体有28个；观察的第五天，三组均全部为早期横裂体阶段；观察的第六天，对照组有2只发育为晚期横裂体，100nm的homosalate组有6只发育为晚期横裂体，1μm的homosalate抑制剂组均停留在早期横裂体阶段；观察的第七天，对照组有15只发育为晚期横裂体，100nm的homosalate组有27只发育为晚期横裂体，1μm的homosalate抑制剂组只有10只发育为晚期横裂体；从观察第九天到十一天开始，1μm的homosalate抑制剂组的碟状体产生量分别为7、56、70只，而对照组的碟状体产生量分别为13、77、85只，并且，观察发现1μm的homosalate抑制剂组碟状体产生高峰期的出现出现了明显延缓，分别在第十二天和十三天，产生碟状体的数量分别为84、77只，而对照组产生碟状体的高峰为第十天。表明，1μm的homosalate抑制剂对变态发育的抑制作用明显。
51.通过实验4我们发现，第一天记录实验组和对照组没有差异，都处于水螅体阶段；从第二天开始，实验组出现了12只早期横裂蹄，而对照组有15只早期横裂体，对照组的横裂率为50％，实验组的横列率为43.33％，第三天，实验组有24只水螅体横裂，横裂率为80％，对照组只有21只水螅体横裂，横裂率为70％；第四天，实验组有28只横裂，对照组30只横裂；第五天，实验组和对照组均全部横裂为早期横裂体；第六天，实验组30只依旧是早期横裂体，而对照组已经有2只横裂为晚期横裂体；第七天，实验组有10只发育为晚期横裂体，而对照组有13只为晚期横裂体；第八天，实验组有25只为晚期横裂体，4只碟状体，而对照组有2只碟状体；第九天，对照组有28只晚期横裂体，13只碟状体，实验组有3只早期横裂体，26只晚期，7只碟状体；第十天，对照组有20只晚期，77只碟状体，实验组有3只早期，17只晚期，56只碟状体；第十一天，对照组有12只晚期，85只碟状体，实验组有12只晚期，70只碟状体；第十二天，对照组有9只晚期，72只碟状体，实验组有8只晚期，77只碟状体；第十三天，对照组有51只碟状体，实验组晚期2只，碟状体29只。表明抑制剂效果明显。

技术特征：
1.homosalate在作为海月水母变态发育抑制剂中的应用。2.homosalate在制备防控海月水母爆发的功能产品中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，homosalate具有以下作用：(1)降低海月水母变态发育的早期横裂率，和/或，(2)减少海月水母碟状体的数量，和/或，(3)减缓海月水母水螅体的横裂增殖速度。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，homosalate的浓度为100～1μm。

技术总结
本发明属于水母防控技术领域，公开了Homosalate在水母爆发防控中的应用。Homosalate在低浓度安全无毒，其成本低廉，操作简单易行，且见效快，Homosalate在水母爆防控造的应用上具有巨大潜力，本发明的上述方法适用于有水母爆发的沿海渔场、旅游海域、及有核电站海域，可用于防控水母的爆发，推荐先提前用将适当浓度的Homosalate挥洒在海域。前用将适当浓度的Homosalate挥洒在海域。前用将适当浓度的Homosalate挥洒在海域。


技术研发人员：杨积顺 陈锦红 于菲菲 王明科 于雪露 潘青青 耿晓宇
受保护的技术使用者：中国人民解放军海军特色医学中心
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/8/28