一种降解单宁和皂苷的植物乳植杆菌及其应用

1.本发明涉及微生物饲料技术领域，尤其涉及一种降解单宁和皂苷的植物乳植杆菌及其应用。


背景技术：

2.木本饲料(woody forage)富含均衡的氨基酸和维生素，粗蛋白含量高，营养价值丰富，是一种新型优良蛋白质饲料资源。然而单宁和皂苷是木本饲料中的主要抗营养因子，日粮中木本饲料添加量过高，动物会出现适口性降低、生产性能下降，甚至出现中毒或死亡。缩合单宁具有极强的收敛性，通过与动物口腔中的糖蛋白结合形成苦涩味物质而影响动物的适口性。缩合单宁与动物体内的蛋白质(各种消化酶、营养物质)和矿物质等结合为络合物，降低动物对饲料中营养物质的消化吸收。水解单宁已被消化水解而产生毒性，造成动物中毒甚至死亡。皂苷微苦而辛辣，引起动物产生强烈厌食感，影响动物的适口性。摄食皂苷后，皂苷与蛋白质、矿物质等营养物质形成复合物，降低动物的消化利用。
3.青贮不仅能保存饲草的营养成分和活性物质，提高饲草的适口性和消化率，顺利为越冬动物提供高营养饲料，还可有效降解饲料原料中的抗营养因子和有毒有害物质，提高动物对饲料的耐受阈值。目前关于乳酸菌对营养价值、活性物质和动物饲料的研究报道较多，而乳酸菌作为青贮发酵的促进剂，其种类和数量是决定青贮饲料中抗营养因子能否降解的关键因素，添加乳酸菌的青贮技术应用于抗营养因子降解的研究鲜有报道。


技术实现要素：

4.鉴于上述的分析，本发明旨在提供一种降解单宁和皂苷的植物乳植杆菌及其应用，用以解决现有技术中青贮饲料中单宁和皂苷抗营养因子高，导致青贮饲料利用率低等问题。
5.一方面，本发明提供了一种保藏编号为cgmcc no.27567的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91。
6.进一步地，所述的植物乳植杆菌p91包含seq id no.1所示的16s rdna。
7.进一步地，所述的植物乳植杆菌p91从构树青贮饲料分离得到。
8.第二方面，本发明提供了一种青贮饲料添加剂，包括所述的植物乳植杆菌p91。
9.第三方面，本发明提供了一种青贮饲料，所述的青贮饲料包括所述的植物乳植杆菌p91。
10.进一步地，所述的青贮饲料还包括柠条锦鸡儿青贮饲料和/或辣木青贮饲料。
11.第四方面，本发明提供了一种青贮饲料的制备方法，包括：将青贮原料与所述的植物乳植杆菌p91混合发酵，得到所述的青贮饲料。
12.进一步地，所述的植物乳植杆菌p91与所述的青贮原料的质量之比为1.0
×
105～2.0
×
106cfu/g。
13.进一步地，所述的青贮原料包括柠条锦鸡儿和/或辣木，优选的，青贮原料为柠条
锦鸡儿。
14.第五方面，本发明提供了一种所述的植物乳植杆菌p91在制备青贮饲料中的应用。
15.与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：
16.(1)本发明公开了一种植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91，所述的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91具有耐酸、生长速度快的特点，且对碳源的利用能力强，综合产酸能力强，降低青贮饲料抗营养因子，有效解决青贮原料中抗营养因子单宁和皂苷含量高的问题，很好地改善青贮饲料的适口性，并克服乳酸菌对原料的适应性问题，从而能够提高乳酸菌的活性并提高青贮饲料发酵的品质。
17.(2)本发明公开了一种青贮饲料，通过植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91改善青贮饲料的发酵品质，成本低、安全、可靠和易于利用。
18.本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。
附图说明
19.附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。
20.图1为本发明所述的植物乳植杆菌p91降解单宁变色圈情况图；
21.图2为本发明中皂苷为唯一碳源的植物乳植杆菌p91菌落生长情况图；
22.图3为本发明实施例1制备的植物乳植杆菌p91产酸及生长速率图；
23.图4为本发明对比例1制备的植物乳植杆菌p87产酸及生长速率图。
具体实施方式
24.下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例，其中，附图构成本发明一部分，并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。
25.本发明一个具体的实施例，公开了一种植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91，其菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmcc no.27567，保藏日期为2023年06月06日。
26.于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌p91包含seq id no.1所示的16s rdna。
27.于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌p91从构树青贮饲料分离得到。
28.需要说明地，在进行提取分离之前，所述的构树青贮饲料为储藏时间为60天的青贮饲料，优选的方案，构树为杂交构树。
29.具体地，所述的植物乳植杆菌p91的分离培养过程包括：
30.将构树饲料开袋后，在干净盆中混合均匀，取适量构树青贮饲料与0.85％生理盐水混合，取上层清液并移至mrs培养基中进行培养。
31.于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌p91菌株的培养温度为15～45℃，进一步可以为30～35℃，例如，温度为20℃、25℃、27℃、33℃、37℃、40℃。
32.于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌p91菌株于mrs培养基培养24h后可将培养基的ph值降低至3.5～4.0。
33.于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌p91的培养ph为4.5～7.0。
34.于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌p91的培养盐浓度为3.0～6.5％的nacl。
35.需要说明地，本发明所述的植物乳植杆菌p91的生物学特性为革兰氏染色阳性球菌，葡萄糖同型发酵，在ph＝4.5的条件下可以正常生长，表明其耐酸性较强；在3.0％和6.5％的盐浓度环境中能够良好生长，表明其耐盐性强；在mrs液体培养基中37℃培养48h后od
600
nm为1.6218，表明其生长速率快。在30℃条件下通过analytical profile index(api 50ch，blomerieux，france)试验条进行测试，除植物乳植杆菌p91可利用的碳源外，植物乳植杆菌p87还能很好的利用d-果糖和卫茅醇，见表6和表8，表明两株菌对碳源的利用存在差异。
36.本发明的另一个具体实施方式中，提供了一种青贮饲料添加剂，包括所述的植物乳植杆菌p91。
37.进一步的，所述的添加剂为杂交构树青贮饲料添加剂。
38.本发明的另一个具体实施方式中，提供了一种青贮饲料，所述的青贮饲料包括所述的植物乳植杆菌p91。
39.于一个实施方式中，所述的青贮饲料还包括柠条锦鸡儿青贮饲料和/或辣木青贮饲料。
40.进一步的，所述的青贮饲料还包括柠条锦鸡儿青贮饲料和辣木青贮饲料。
41.本发明的另一个具体实施方式中，提供了一种青贮饲料的制备方法，包括：将青贮原料与所述的植物乳植杆菌p91混合发酵，得到所述的青贮饲料。
42.于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌p91与所述的青贮原料的质量之比为1.0
×
105～2.0
×
106cfu/g，例如，质量之比为2.0
×
105cfu/g、5.0
×
105cfu/g、8.0
×
105cfu/g、1.0
×
106cfu/g、1.5
×
106cfu/g。
43.具体地，本发明一个实施方式中青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：
44.s1：将原料切碎并混合均匀；
45.s2：向原料中加入植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91，每克原料加入植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91有效活菌数为1.0
×
106个以上。
46.s3：将添加了植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91的饲料体系真空密封后贮藏。
47.于一个实施方式中，步骤s1中，所述的原料为柠条锦鸡儿和辣木，进一步对，将人工刈割后的柠条锦鸡儿和辣木原料切碎至2～3cm。
48.于一个实施方式中，步骤s3中，在20-25℃温度下进行储藏，在储藏90天后可将体系的ph值降至3.92。
49.本发明的另一个具体实施方式中，提供了一种所述的植物乳植杆菌p91在制备青贮饲料中的应用。
50.需要说明地，本发明所述的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91具有耐酸、生长速度快的特点，且对碳源的利用能力强，综合产酸能力强，降低青贮饲料抗
营养因子，有效解决青贮原料中抗营养因子单宁和皂苷含量高的问题，很好地改善青贮饲料的适口性，并克服乳酸菌对原料的适应性问题，从而能够提高乳酸菌的活性并提高青贮发酵的品质。
51.本发明的青贮饲料通过采用植物附生乳酸菌克服青贮时乳酸菌对原材料适应性的问题，降低了单宁和皂苷含量。
52.本发明的青贮饲料利用乳酸菌改善青贮饲料的发酵品质和降低其抗营养因子，成本低、安全、可靠、易于利用。
53.以下结合附图及具体实施例对本发明一实施方式的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91及青贮饲料进行进一步说明。
54.其中，所使用的柠条锦鸡儿材料取自从内蒙古自治区赤峰市内蒙古锦吉生物科技有限责任公司(北纬43.97
°
，东经119.38
°
，海拔687m，年平均温度5.8℃，年平均降水量314.5mm)，辣木材料取自广东省广州市华南农业大学实验基地(北纬23.14
°
，东经113.32
°
，海拔11m，年平均温度22.2℃，年平均降水量1632-2899mm)。
55.构树青贮原料来自于：重庆市荣昌区荣城构羊现代农业(重庆)有限公司，公司位置：北纬29.42，东经105.61，海拔380m，相对湿度76％，年平均温度17.8℃，年平均降水量1099mm。构树青贮饲料的具体制备方法如下：将构树青贮原料切碎至2-3cm，均匀取适量的放置于干净的塑料布上，取500g左右的新鲜构树样品装入双面斜纹青贮袋(28
×
35cm)中，室温(25
±
2℃)进行储藏。
56.在植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91的分离培养及生长速率、产酸速率等生理生化指标测定中所使用的mrs液体培养基。其成分如下表1所示：
57.表1mrs液体培养基成分
[0058][0059]
在mrs液体培养基的基础上加入琼脂(agar)15g即为mrs固体培养基，以上培养基均于高压灭菌锅中121℃灭菌15分钟。
[0060]
实施例1
[0061]
降解单宁和皂苷降解菌的分离与初筛
[0062]
1、菌株的分离与纯化
[0063]
取20g构树青贮饲料(已储藏60天)加入装有180ml无菌生理盐水(0.85％nacl溶液)的干净密封袋中，充分震荡后置于4℃冰箱中浸提4h后，取上清液(记为10-1
浓度梯度)
1ml并按10倍稀释度依次稀释至10-2
浓度梯度、10-3
浓度梯度和10-4
浓度梯度，分别取各梯度稀释液100ul在mrs固体培养基上进行平板涂布，将平板放入37℃培养箱培养48h。根据单菌落的形态、颜色和大小等菌落形态，挑选典型菌落采用平板划线法至少分离纯化培养两次，直到得到单菌落乳酸菌。采用菌落富集法将乳酸菌转移至含10％二甲基亚砜的nb营养培养基中，于-80℃冰箱保存。mrs固体培养基组成成分如上。
[0064]
2、初筛可同时降解单宁和皂苷的乳酸菌
[0065]
将单宁固体筛选培养基四等分，用无菌镊子将无菌牛津杯放入培养基相应位置表面上并轻轻按压。取活化好的纯乳酸菌液(100μl)点接在牛津杯中，将接种好的培养基缓慢放入30℃恒温培养箱中，培养24-48h，观察菌落生长情况及菌落周围变色圈的大小，出现透明圈的菌落初步视为具有降解单宁的能力，挑选此菌株，后续通过测定其产单宁酶活力进行后续降解皂苷初筛。其中，降单宁乳酸菌初筛培养基组分如下表2。
[0066]
表2降解单宁乳酸菌的初筛培养基组分
[0067][0068]
向皂苷固体筛选培养基中加入100μl上述筛选的降解单宁的纯菌菌液，均匀涂布于培养基表面，30℃培养48h后，若有菌落生长，初步判定此菌株具有利用皂苷的能力，保存后进行后续复筛。降皂苷乳酸菌初筛培养基组分如下表3。
[0069]
表3降解皂苷乳酸菌的初筛培养基组分
[0070][0071]
同时降解单宁和皂苷的降解菌的复筛
[0072]
单宁酶的测定：将活化24h的上述初筛同时降解单宁和皂苷的菌液接种至单宁酶产酶培养基(成分如表4所示)中，恒温摇床中30℃下150rpm震荡培养24h后，4℃条件下10000rpm离心10分钟得到的上清液为单宁酶粗酶液。将实验所需的没食子酸丙酯溶液和待测的粗酶液置于30℃水浴锅中保温5-10min。所有试管中加入0.25ml没食子酸丙酯溶液
(pg)，待测试管中加入0.25ml粗酶液，空白管中加入0.25ml柠檬酸缓冲液，涡旋混匀后将试管置于30℃水浴锅孵育5min，然后加入0.3ml甲醇绕丹宁溶液，孵育5min后，加入0.2mlkoh溶液，向测试管中加入0.25ml酶液，并向所有试管中加入4ml蒸馏水稀释反应体系，30℃孵育5-10min后，以蒸馏水作为空白，取适量反应液于酶标仪520nm处测定吸光度，计算单宁酶酶活含量。单宁酶的酶活计算如下：a
520
＝(a
test-a
blank
)-(a
control-a
blank
)。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线。标准方程为y＝0.001x+0.051,r2＝0.9917，单宁酶酶活为：183.47μmol/min
·
ml。
[0073]
表4单宁酶产酶培养基
[0074][0075]
皂苷降解率的测定：以皂苷的降解率作为复筛指标。制备皂苷粗发酵液：将待测菌株分别接种于不含琼脂的皂苷初筛培养基中摇瓶发酵24h后(培养基浑浊)，4℃冷冻离心(8000rpm,10min)得到的上清液，将菌体沉淀用无菌水洗涤3次，收集上清液并定容至250ml即为皂苷粗发酵液，取其中5ml定容至100ml，稀释后的发酵液放置于4℃冰箱中备用。取0.5ml稀释发酵液，测定其在550nm处的吸光度，以蒸馏水作为空白。皂苷的降解率(w)＝1-c/c0×
100％。其中：w表示皂苷的降解率，c表示发酵后皂苷的含量，c0表示发酵前皂苷的含量。降解菌的皂苷降解率为51.52％。
[0076]
选定单宁酶酶活为：183.47μmol/min
·
ml，皂苷降解率为51.52％的菌株作为降解菌，所述的降解菌进行下述形态鉴定和生理生化测试。
[0077]
降解菌的形态鉴定
[0078]
革兰氏染色和细胞形状观察以及过氧化氢酶实验的测试过程如下：
[0079]
革兰氏染色法：挑一环水于载玻片中央，再用接种环挑取少量菌与玻片上的水滴均匀混合并涂成薄的菌膜自然干燥；玻片向上在微火上固定：结晶紫初染1min后用水充分淋洗(动作轻柔，避免水流直接冲击菌块)。滴加碘液媒染1～2min，用95％乙醇脱色并水洗，番红复染1～2min水洗；自然干燥；1000倍油镜观察：蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。
[0080]
过氧化氢酶实验：用枪头吸取3％(体积分数)过氧化氢溶液于平板上，用接种环挑取菌少许，与过氧化氢溶液充分混合，2～3min后观察有气泡产生的为阳性，无为阴性。
[0081]
降解菌的生理生化测试
[0082]
根据生长温度(4、15、30、35、45℃)和生长ph(3.0、3.5、4.0、4.5、9.0)等实验对降解菌进行测试，过程如下：
[0083]
降解菌产酸和生长速率的测定及筛选：将已分离纯化的菌株接种到3ml的mrs液体培养基中，置于30℃、250rpm摇床过夜培养约14～16h。按1％(v/v)的接种量转入新的3ml mrs液体培养基中，于30℃、250rpm摇床培养，分别在接种时间后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h、48h测定mrs液体培养基的ph值，在波长600nm下测定吸光度值。每株菌每个
时间点需要做3个重复，且培养菌的试管需要同种规格。
[0084]
温度耐受性试验：按1％(v/v)的接种量分别转入新的mrs液体培养基中，分别置于4℃、15℃、30℃、35℃、45℃的恒温培养中培养2天。
[0085]
ph耐受性试验：按1％(v/v)的接种量接种到ph为3.0、3.5、4.0、4.5、9.0的mrs液体培养基30℃培养2天(用2.0m的naoh或者1.0m的hcl调节)。
[0086]
耐盐性：将降解菌株接种到nacl含量分别为3％、6.5％的mrs液体培养基中后置于30℃培养箱中培养2天，观察降解菌生长状况。
[0087]
经过上述试验，所述的降解菌的培养温度为15～45℃，所述的降解菌的培养ph为4.5～7.0，所述的降解菌的培养盐浓度为3.0～6.5％的nacl，降解菌在上述条件下均可以正常生长。
[0088]
降解菌株形态及生理生化特性如表5，降解菌产酸及生长速率图3所示。
[0089]
表5降解菌株的形态及生理生化特性
[0090][0091][0092]
注：表5中，耐受性试验中的
“‑”“
+”“++”“+++”表示如下含义：-：od
600
nm＜0.5；+:0.5≤od
600
nm＜1.0；++:1.0≤od
600
nm＜1.5；+++:1.5≤od
600
nm。
[0093]
表6降解菌株的碳源利用
[0094][0095]
注：表6中“w”“+
”“‑”
表示如下含义：w:弱阳性；+：阳性；-：阴性。
[0096]
表5和表6的结果表明，降解菌株为革兰氏阳性，同型发酵的杆菌，具有较强的耐酸、耐盐能力，生长速度快，综合产酸能力强。
[0097]
对比例1
[0098]
将构树饲料开袋后，在干净盆中混合均匀，取20g构树青贮饲料(已储藏60天)与180ml 0.85％生理盐水(nacl)混合，置于4℃冰箱中浸提4h后，取上层清液按照10倍稀释度依次稀释至10-4
浓度梯度、10-5
浓度梯度，分别取不同梯度下稀释液100ul在mrs培养基中进行平板涂布，至于30℃培养箱培养48h。待长出菌落后挑取菌落至少进行2次平板划线分离，得到单菌落a，将单菌落a采用二甲基亚砜法置于-80℃冰箱中保存。
[0099]
将上述得到的单菌落a菌株按照实施例1的方法进行初筛、复筛、鉴定和测试，最终筛选到同时降解单宁和皂苷的b菌株，b菌株相关结果参见表7和表8。
[0100]
表7 b菌株的形态及生理生化特性
[0101][0102]
注：表7中，耐受性试验中的
“‑”
+”“++”“+++”表示如下含义：-:od
600
nm＜0.5；+:0.5≤od
600
nm＜1.0；++:1.0≤od
600
nm＜1.5；+++:1.5≤od
600
nm。
[0103]
表8 b菌株的碳源利用
[0104][0105]
注：表8中“w”“+
”“‑”
表示如下含义：w:弱阳性；+：阳性；-：阴性。
[0106]
表7和表8的结果表明，b菌为革兰氏阳性，异型发酵的球菌，具有较强的耐盐能力，生长速度快，综合产酸能力强，b菌产酸及生长速率如图4所示。
[0107]
实施例1得到的降解菌和对比例1得到的b菌进行16s rdna基因同源性分析
[0108]
将菌株在5ml的mrs培养基中35℃培养过夜，然后将菌液移入1.5ml的离心管中，10000rpm/min离心3～5min收集菌，用te 0.1(10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/l edta，ph 8.0)清洗两次，再用tianamp bacteria dnakit(tiangen biotech co.,ltd,beijing,china)试剂盒提取dna，在od
600 nm处检测其吸光值。
[0109]
之后，进行pcr扩增，16s rdna的扩增引物为27f和1492r(monis et al,2005)，pcr反应为95℃(5min)-94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)-72℃(10min)，其中94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)反应循环30次。扩增产物送深圳华大基因科技有限公司(中国)测序，结果在ncbi的基因库中比对，找出与此菌亲缘相近的标准菌株植物乳植杆菌，用dnaman软件分析，将筛选菌株的16s rdna(降解菌见seq id no.1，b菌见seq id no.2)的部分序列(约1400bp-1500bp)与标准菌进行相似度分析，降解菌和b菌与植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)相似度超过99％，结合生理生化指标，判定降解菌和b菌与植物乳植杆菌属同一种。本发明中降解菌即为本发明所述的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91，b菌株即为本发明所述的植物乳植杆菌
(lactiplantibacillus plantarum)p87。
[0110]
其中，植物乳植杆菌p91降解单宁变色圈如图1所示，以皂苷为唯一碳源的植物乳植杆菌p91菌落如图2所示。
[0111]
应用例
[0112]
1、青贮饲料的制备
[0113]
将内蒙古自治区赤峰市内蒙古锦吉生物科技有限责任公司收获的柠条锦鸡儿和广东省广州市华南农业大学实验基地收获的辣木切短至2-3cm，混合均匀，分别接种实施例1的植物乳植杆菌p91(p91处理组)和对比例1植物乳植杆菌p87(p87处理组)，向每克新鲜材料中加入菌株p91或菌株p87约1
×
106个。将均匀混合后的原料装入28cm
×
35cm的聚乙烯青贮袋中，每个处理装3袋，每袋约500g，用真空密封机抽气、密封，置于20～25℃的温度下贮藏，发酵90天后开启。
[0114]
2、柠条锦鸡儿和辣木原料及青贮饲料的测试
[0115]
取样分析柠条锦鸡儿和辣木原料及加入添加剂处理后的青贮饲料青贮90天的抗营养成分，具体结果参考表9和10。测试过程如下：
[0116]
原料和青贮饲料的干物质含量用冻干法测定，样品混匀后置于冻干机中冻干5d以上直至质量恒定，测定干物质含量；烘干的样品经植物粉碎机粉碎后过40目筛用于抗营养成分。
[0117]
单宁类的测定方法参考张颖超(2019，优良乳酸菌筛选及其在典型木本饲料青贮中的作用机制研究)，并做以适当调整。称取冻干粉碎后样品0.2g于25ml圆底离心试管中，加入5ml 70％丙酮，室温超声20min后4℃8000rpm离心10min，重复一次，定容至25ml，冰浴保存得到提取液。取0.1ml提取液于15ml离心管中，加蒸馏水将总体积补齐到1.0ml后加入0.5ml folin试剂和2.5ml 20％碳酸钠试剂，混匀后室温振荡40min，取适量反应液于酶标仪720nm处测定吸光度，计算总酚含量。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线。取0.1g不溶性聚乙烯吡咯酮于10ml离心管中，分别加入1ml蒸馏水和提取液，涡旋混匀4℃下静置15min后8000rpm离心10min，取0.1ml上清液于试管中，加入0.9ml蒸馏水后依次加入0.5ml folin试剂和2.5ml20％碳酸钠试剂，混匀后室温振荡40min，取适量反应液于酶标仪720nm处测定吸光度，计算总酚含量。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线。水解单宁含量即为总酚与简单酚之差。缩合单宁含量的测定采用vanilli-hcl法。准确称取0.1g冻干粉碎后样品于15ml圆底离心管中，加入5ml 1％盐酸甲醇溶液，室温振荡20h后8000rpm离心10min收集上清液并定容至5ml，即为缩合单宁浸提液。取1ml上清液于试管中，加入5ml香兰素显色液涡旋混匀后，室温静置20min。取适量反应液于酶标仪495nm处测定吸光度，计算缩合单宁含量。以儿茶素为标准品，绘制标准曲线。水解单宁含量与缩合单宁含量之和为总单宁含量。
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总皂苷的测定方法参考张吉明(2015，不同品种、刈割时期及添加剂处理的紫花苜蓿总皂苷含量研究)准确称取0.5g冻干粉碎后样品置于50ml离心管中加入15ml 70％乙醇后，室温超温15min后75℃水浴15min，8000rpm离心10min后，取上清液定容至25ml即为总皂苷浸提液。取0.1ml浸提液于玻璃试管中，放置在80℃水浴锅中蒸干，冷却后一次加入0.2ml 5％香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml高氯酸，涡旋混匀后，于75℃水浴中加热20min后迅速置于冰浴中冷却后，加入5ml冰醋酸，涡旋振荡。静置10min后，取适量反应液于酶标仪545nm处测定吸光度，计算总皂苷含量。以齐墩果酸为标准品，绘制标准曲线。
[0119]
柠条锦鸡儿原料中水解单宁、缩合单宁、总单宁和总皂苷的含量2.30g/kg dm、5.52g/kg dm、7.67g/kg dm和141.53g/kg dm。辣木原料中水解单宁、缩合单宁、总单宁和总皂苷的含量为0.15g/kg dm、9.54g/kg dm、9.69g/kg dm和51.41g/kg dm。
[0120]
柠条锦鸡儿和辣木单独青贮后，抗营养因子含量如表10所示。与原料相比，添加p91，显著降低柠条锦鸡儿和辣木原料中缩合单宁、总单宁和总皂苷含量(p《0.05)。与ck(不加添加剂的青贮饲料经过90天青贮)相比，添加p91显著降低柠条中水解单宁、缩合单宁、总单宁和总皂苷含量，降解率分别为41.94％、14.48％、26.60％和47.19％(p《0.05)。添加p91降低辣木中水解单宁、缩合单宁、总单宁和总皂苷含量，降解率分别为8.81％、33.51％、28.33％和72.51％(p《0.05)。因此，植物乳植杆菌p91作为一种新型有效降解饲料中抗营养因子(单宁类物质和总皂苷)的添加剂，可以显著改善柠条锦鸡儿和辣木青贮饲料的品质。
[0121]
表9柠条锦鸡儿和辣木原料的抗营养成分
[0122][0123]
表10 p91和p87添加剂对柠条锦鸡儿和辣木青贮饲料中单宁和总皂苷的影响
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通过上述分析可知，植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91降解总单宁和总皂苷的降解菌均大于p87，因此，植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)p91作为一种新型的青贮饲料添加剂，可以显著青贮饲料发酵的品质。
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以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种保藏编号为cgmccno.27567的植物乳植杆菌(lactiplantibacillusplantarum)p91。2.根据权利要求1所述的植物乳植杆菌p91，其特征在于，所述的植物乳植杆菌p91包含seq id no.1所示的16srdna。3.根据权利要求1所述的植物乳植杆菌p91，其特征在于，所述的植物乳植杆菌p91从构树青贮饲料分离得到。4.一种青贮饲料添加剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌p91。5.一种青贮饲料，其特征在于，所述的青贮饲料包括权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌p91。6.根据权利要求5所述的青贮饲料，其特征在于，所述的青贮饲料还包括柠条锦鸡儿青贮饲料和/或辣木青贮饲料。7.一种青贮饲料的制备方法，其特征在于，包括：将青贮原料与权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌p91混合发酵，得到所述的青贮饲料。8.根据权利要求7所述的青贮饲料的制备方法，其特征在于，所述的植物乳植杆菌p91与所述的青贮原料的质量之比为1.0
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106cfu/g。9.根据权利要求7所述的青贮饲料的制备方法，其特征在于，所述的青贮原料包括锦鸡儿和/或辣木。10.一种权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌p91在制备青贮饲料中的应用。

技术总结
本发明涉及一种降解单宁和皂苷的植物乳植杆菌及其应用，属于微生物饲料技术领域，用以解决青贮饲料中单宁和皂苷抗营养因子导致饲料利用率低的问题。本发明提供了一种保藏编号为CGMCCNo.27567的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)P91。所述的植物乳植杆菌P91耐酸、生长速度快，且对碳源的利用能力强，综合产酸能力强，能够降低pH，很好地改善青贮饲料的适口性，降低青贮饲料抗营养因子，有效解决青贮原料中抗营养因子单宁和皂苷含量高的问题，并克服乳酸菌对原料的适应性问题，从而能够提高乳酸菌的活性并提高青贮发酵的品质。酵的品质。酵的品质。


技术研发人员：杨富裕 王宁伟 倪奎奎 徐港 周鸿章
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/9/6